白芷不同基原化學(xué)成分差異性研究

王靜 朱春璐 袁子民

【摘要】目的：對白芷（白芷和杭白芷）不同基原進(jìn)行化學(xué)成分差異性研究。方法：對白芷和杭白芷飲片進(jìn)行浸出物、總香豆素含量及特征指紋圖譜研究，浸出物按照2020版《中國藥典》四部2201項下方法測定，總香豆素含量采用紫外-分光光度法，特征指紋圖譜采用HPLC法。結(jié)果：二者質(zhì)量差異較大，白芷的浸出物含量和總香豆素的含量明顯高于杭白芷，且特征指紋圖譜成分差異明顯。結(jié)論：白芷不同基原在所含化學(xué)成分方面存在一定的差異性，在制劑開發(fā)中應(yīng)固定基原，以利于制劑的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】白芷；杭白芷；總香豆素；指紋圖譜

【中圖分類號】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）10-0045-04

Study on the Difference of Chemical Constituents of Angelica Dahurica from Different OriginsWANG Jing1ZHU Chunlu2YUAN Zimin1*

1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600，China；

2.Shiyao Group Yuanda Dalian Pharmaceutical Co.Ltd. Dalian 116021，ChinaAbstract：Objective To evaluate the difference of chemical constituents of Angelica dahurica （Angelica dahurica and Angelica dahurica var.formosana） from different sources. Methods The contents of extract， total coumarin and fingerprint of Angelica dahurica were studied. The determination of the extract was carried out in accordance with the method of item 2201 in the fourth part of the 2020 edition of the Chinese Pharmacopoeia. The content of total coumarin was determined by UV-spectrophotometry and the characteristic fingerprint of Angelica dahurica was established by HPLC. Results There was a great difference in quality between Angelica dahurica and Angelica dahurica var.formosana，the contents of extract and total coumarin in Angelica dahurica were significantly higher than those in Angelica dahurica.Conclusions There were some differences in the chemical components of Angelica dahurica from different sources. The base materials should be fixed in the development of compound preparation to facilitate the quality control of the preparation.

Keywords：Angelicae dahuricae；Angelica dahurica var.Formosana；Total Coumarins；Characteristic Fingerprint

白芷載于2020版藥典，分為白芷、杭白芷兩種基原［1］。產(chǎn)區(qū)主要分布在四川、河南、河北、浙江、安徽等地，現(xiàn)代研究［2-4］表明其主要含有香豆素、揮發(fā)油等活性成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙等藥理作用。目前，白芷質(zhì)量評價以不同產(chǎn)地的成分差異研究報道較多［5-8］，對于白芷不同基原多指標(biāo)的化學(xué)成分差異性的質(zhì)量評價研究較少。另外，中國藥典主要以薄層鑒別、浸出物、歐前胡素含量測定作為化學(xué)成分質(zhì)量控制指標(biāo)，缺少全面表征其化學(xué)成分的控制標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究通過測定總香豆素、浸出物及多成分特征指紋圖譜的研究，對白芷不同基原進(jìn)行化學(xué)質(zhì)量分析及表征，以期為白芷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升及其藥材的基原選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

UV-3010紫外可見分光光度計（日本日立公司）； Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；白芷（1～10批，購于安國市光明飲片加工廠，產(chǎn)地河北安國）、杭白芷（1～10批，大連權(quán)健中藥飲片廠，產(chǎn)地四川）經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授分別鑒定為白芷Angelica dahurica （Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.F.、杭白芷Angelica dahurica （Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.var．Formosana （Boiss.） Shan et Yuan；歐前胡素對照品（批號：110826-200307；純度≥98%）購于中國藥品生物制品檢定所；異歐前胡素對照品（批號：ZM0531BB13；純度≥98%）、氧化前胡素對照品（批號：Y26A6S2757；純度≥98%）、水合氧化前胡素對照品（批號：R25A6F2764；純度≥98%）、白當(dāng)歸腦對照品（批號：P0103SA13；純度≥98%）、白當(dāng)歸素對照品（批號：P01028SA13；純度≥98%）、花椒毒酚對照品（批號：K21M5C1；純度≥98%）、佛手柑內(nèi)酯對照品（批號：RF0224FA14；純度≥98%）均購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2方法與結(jié)果

2.1浸出物的測定 取1～3批白芷和杭白芷粉末（過二號篩）約3 g，精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，采用稀乙醇作為溶劑，參照2020年版《中國藥典》四部醇溶性浸出物測定方法（通則2201）項下的熱浸法進(jìn)行測定。結(jié)果3批白芷的浸出物含量分別為68.54%、67.52%、70.30%，平均值為68.79%；3批杭白芷的浸出物含量分別為20.77%、21.56%、23.43%，平均值為21.92%。

2.2總香豆素的含量測定

2.2.1對照品溶液的制備 精密吸取0.32 mg/mL歐前胡素5 mL至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得0.032 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 分別取白芷、杭白芷粉末（過四號篩）約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇至50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液液0.5 mL置10 mL容量瓶中，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取2.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、8.0 mL上述對照品溶液，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。以甲醇為空白，用紫外-可見分光光度法，在300 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，歐前胡素濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.0314C-0.0058（r=0.9999），故濃度在0.0064～0.0256 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4方法學(xué)考察 本研究總香豆素的含量測定主要參考課題組前期研究結(jié)果，方法學(xué)（精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率）研究內(nèi)容均符合有關(guān)規(guī)定，參考已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)［9］。

2.2.5總香豆素含量測定結(jié)果 取1～3批白芷和杭白芷供試品溶液，以稀乙醇溶液為空白，在300 nm處測量吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各供試品溶液中總香豆素含量，結(jié)果3批白芷的總香豆素含量分別為26.43%、24.89%、26.04%，平均值為25.79%；3批杭白芷的總香豆素含量分別為14.18%、13.44%、13.01%，平均值為13.54%。

2.3特征指紋圖譜

2.3.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫：30 ℃；檢測波長：300 nm。流動相：A為乙腈，B為0.1%磷酸溶液;梯度洗脫：0～50 min，A為5%～65%，B為95%～35%；50～70 min，A為65%～95%，B為35%～5%；流速：1 mL/min；供試品溶液進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2供試品溶液的制備 分別取1～10批白芷和1～10批杭白芷飲片，粉碎（過60目篩），分別精密稱取粉末0.4 g，置容量瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，密塞，稱定，超聲處理（250 W，40 kHz）1h，放冷，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3混合對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，加甲醇制成每1 mL含花椒毒酚0.0175 mg、水合氧化前胡素0.0034 mg、白當(dāng)歸素0.012 mg、佛手柑內(nèi)酯0.0125 mg、白當(dāng)歸腦0.0132 mg、氧化前胡素0.0065 mg、歐前胡素0.016 mg、異歐前胡素0.0125 mg的混合對照品，即得。

2.3.4穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一白芷供試品溶液10 μL，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h進(jìn)樣測定，記錄特征指紋圖譜，以22號峰為參照峰，計算各共有特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD值均小于2%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5精密度試驗 精密吸取同一白芷供試品溶液10 μL，連續(xù)測定6次，以22號峰為參照峰，計算各共有特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD值均小于1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.6重復(fù)性試驗 精密稱取同一白芷粉末各6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別依法測定各特征指紋圖譜。以22號峰為參照峰，計算共有特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD值均小于3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.7特征指紋圖譜的建立及特征峰分析 取白芷和杭白芷，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定［10］，得到白芷、杭白芷的特征指紋圖譜，經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2012版處理，結(jié)果表明白芷共有模式確定了18個指紋峰，杭白芷共有模式確定了20個指紋峰，經(jīng)分別相似度比較，1～10批白芷的相似度分別為0.983、0.982、0.986、0.989、0.988、0.989、0.983、0.983、0.983、0.982；1～10批杭白芷的相似度分別為0.962、0.975、0.976、0.969、0.963、0.972、0.978、0.966、0.977、0.967。結(jié)果如圖1～5所示。經(jīng)對比白芷和杭白芷的HPLC特征指紋圖譜相似度為0.832，二者在化學(xué)成分方面存在明顯差異。白芷與杭白芷的共有峰分別為1號、3號、6號、7號、8號、9號、10號、11號、12號、13號、15號、16號、17號、22號、23號、24號，其中2號、4號、5號、14號為杭白芷特有成分，18號、19號、20號、21號為白芷特有成分。經(jīng)對照品確認(rèn)，11號峰為花椒毒酚、12號峰為水合氧化前胡素、13號峰為白當(dāng)歸素、16號峰為佛手柑內(nèi)酯、20號峰為白當(dāng)歸腦、 21號峰為氧化前胡素、22號峰為歐前胡素、24號峰為異歐前胡素。

3討論

基于本研究結(jié)果，白芷的浸出物含量和總香豆素的含量明顯高于杭白芷，說明浸出物含量和總香豆素之間存在一定的正相關(guān)，二者質(zhì)量差異較大，因此，白芷不同基原存在化學(xué)成分的差異性，特別是在白芷制劑的研究與開發(fā)中，應(yīng)重視基原的選擇，以確保制劑質(zhì)量的一致性。

特征指紋圖譜的研究中，考察了甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水等流動相系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液流動相的梯度系統(tǒng)的指紋峰分離效果最佳，重復(fù)性好。測定波長選取了254 nm和300 nm進(jìn)行考察，結(jié)果在300 nm測定波長下的特征指紋圖譜基線穩(wěn)定，波動小，無溶劑峰干擾，故確定300 nm為測定波長。

王麗赟等［11］以15份不同主產(chǎn)區(qū)的白芷為材料進(jìn)行基原差異分析，結(jié)果應(yīng)用核基因ITS2序列可以區(qū)分白芷與其變種杭白芷，而葉綠體基因matK序列不能有效區(qū)分白芷與其變種杭白芷，但該法專業(yè)技術(shù)要求較高，樣品處理繁瑣。章軍等［12］采用RP-HPLC法對不同品種白芷藥材進(jìn)行指紋圖譜的鑒別，結(jié)果通過指紋圖譜可鑒別白芷和杭白芷，但該研究中只指認(rèn)了歐前胡素、異歐前胡素共有峰，對其它特征峰或共有峰并未確定成分。而本研究經(jīng)對照品確認(rèn)共指認(rèn)確定了8個指紋峰，其中白芷中含有的白當(dāng)歸腦（20號峰）、氧化前胡素（21號峰）特征峰，在杭白芷中并不含有，因此，可以通過特征指紋圖譜的方法能夠快速區(qū)分白芷與杭白芷。

參考文獻(xiàn)

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2020：109.

［2］倪紅霞，王春梅.白芷總香豆素聯(lián)合白芷揮發(fā)油對大鼠偏頭痛的預(yù)防作用及其機(jī)制［J］.吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2018，44（3）：487-492.

［3］茍美玲，李玲，楊文虛，等.擬篩選白芷治療硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛的活性成分［J］.中成藥，2014，36（4）：789-795.

［4］王夢月，賈敏如，馬逾英，等.白芷中四種線型呋喃香豆素類成分藥理作用研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（3）：485-489.

［5］李玉華，劉晶晶，李景清，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地興安白芷中歐前胡素與異歐前胡素的含量［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2021，22（5）：465-470.

［6］吳文平，索彩仙，霍文杰，等.不同產(chǎn)地白芷藥材質(zhì)量評價［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2021，17（10）：28-34.

［7］李乾，劉潔，李月婷，等.UPLC-FLD法同時測定不同產(chǎn)地白芷中5種香豆素［J］.中成藥，2020，42（9）：2357-2362.

［8］陳琳，唐志書，宋忠興，等.不同產(chǎn)地白芷藥材9個呋喃香豆素成分的含量測定及其質(zhì)量評價［J］.中國中藥雜志，2019，44（14）：3002-3009.

［9］朱春璐，王靜，喬宇航，等.酒燉白芷中總香豆素及4種香豆素類成分含量測定［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2019，29（19）：31-33.

［10］袁子民，趙強(qiáng)，賈天柱，等.白芷酒燉前后化學(xué)成分的變化［J］.中成藥，2016，38（11）：2518-2520.

［11］王麗赟，孫健，沈宇峰，等.我國主要產(chǎn)區(qū)白芷的基原和群體遺傳組成特征分析［J］.中藥材，2022，45（4）：6.

［12］章軍，王躍生，何希榮.RP-HPLC指紋圖譜鑒別不同品種白芷藥材的研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2007，13（7）：1-4.

（收稿日期：2022-09-15編輯：陶希睿）