茄子葉際固氮菌的分離鑒定·培養(yǎng)特性及抑菌活性

幸翀 郭青云

摘要 采用Ashby無氮培養(yǎng)基從茄子葉際分離得到1株具有高效固氮性能的自生固氮菌QZ-1，經(jīng)16S rDNA序列鑒定，該菌株與克雷伯氏菌屬各菌株同源性高達(dá)99%以上，初步鑒定為克雷伯氏菌（Klebsiella sp.），其在酵母粉為碳源、pH為5.0時(shí)生長(zhǎng)最好。菌株QZ-1具有廣譜抗真菌活性，對(duì)油菜菌核病、葡萄炭疽病、番茄灰霉病抑制效果可達(dá)40%以上。自生固氮菌QZ-1具有固氮和生防作用，可為進(jìn)一步研發(fā)優(yōu)良的葉際固氮菌肥提供微生物資源。

關(guān)鍵詞 茄子；葉際固氮菌；克雷伯氏菌；分離鑒定；培養(yǎng)特性；抑菌活性

中圖分類號(hào) S182? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2023）10-0001-04

Abstract A nitrogenfixing bacteria strain QZ1 in the phyllosphere of Solanum melongena L.was screened using Ashby nitrogenfree medium.By 16S rDNA sequence analysis，the homology between strain QZ1 and Klebsiella isolated was up to 99%，thus，the isolated strain was identified as Klebsiella sp..The growth of strain QZ1 was better with yeast powder as carbon source at pH 5.0.Strain QZ1 had broadspectrum antifungal activity，with an inhibitory effect of over 40% on Sclerotinia sclerotiorum，grape anthracnose and Botrytis cinerea.The autotrophic nitrogen fixing bacterium QZ1 had nitrogen fixation and biocontrol effects，which could provide microbial resources for the further development of nitrogenfixing bacteria fertilizer.

Key words Solanum melongena L.;Nitrogenfixing bacteria from phyllosphere;Klebsiella sp.;Isolation and identification;Cultural characteristic;Antifungal activity

植物葉際存在許多有益的微生物種群，在一定程度上促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗植物病原菌。固氮菌可以定殖在植物葉際，通過固定空氣中的氮?dú)鉃橹参锷L(zhǎng)提供必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)繁殖，在自然生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用［1-2］。固氮菌是植物葉際的主要微生物類群，大多為細(xì)菌，目前已分離出的葉際固氮菌主要包括固氮菌屬（Azotobacter）、氣桿菌屬（Aerobaeter）、拜氏固氮菌屬（Beijerinekia）、黃桿菌屬（Flavobaeterium）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、分枝桿菌屬（Myeobaeterium）、克氏桿菌屬（Klebsiella）、螺菌屬（Spirillum）等［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)葉際固氮菌不僅具有較高的固氮能力，還能促進(jìn)作物生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量。如將森林植物葉際分離出Flavobacterium sp.TK2，接種于玉米葉際，可使產(chǎn)量提高約1/3［5］。水稻葉際固氮菌具有溶磷作用并能產(chǎn)生吲哚乙酸，可促進(jìn)水稻生長(zhǎng)［6］。葉際固氮菌還能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，降低玉米大、小斑病的發(fā)病率，提高植物抗病能力，間接促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育［3-4］。因此，固氮菌被廣泛用于生物菌肥中，在取代氮肥的施用上具有廣闊前景。

茄子（Solanum melongena L.）是我國(guó)廣泛種植的蔬菜作物，營(yíng)養(yǎng)豐富，食用方法多樣，深受人民喜愛。茄子生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氮素是限制茄子生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)元素［7］。合理施用氮肥可以使茄子增產(chǎn)增收，但多年連續(xù)施用氮肥，不僅會(huì)增加農(nóng)業(yè)種植成本，還會(huì)污染環(huán)境，造成土壤板結(jié)、肥力下降，甚至威脅人體健康。生物固氮具有成本低、高效、無污染等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于生物菌肥中，大多數(shù)農(nóng)作物施用葉際固氮菌劑后，可以促進(jìn)養(yǎng)分的吸收，減少氮肥和農(nóng)藥的用量，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)［7-8］。茄子葉際存在大量固氮微生物，與茄子生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，該研究利用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法分離篩選茄子葉際固氮菌，并對(duì)其培養(yǎng)特性和抗菌活性進(jìn)行研究，可為生物菌肥生產(chǎn)提供固氮菌種資源，對(duì)農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試茄子樣品于2021年9月采自農(nóng)民自種蔬菜園，取樣時(shí)每個(gè)樣品隨機(jī)選取5株植物，戴上無菌手套進(jìn)行采集，選取地上葉片，所取葉片位于新葉與老葉之間，避免沾染泥土引起試驗(yàn)誤差，將采集到的葉片混合放入無菌培養(yǎng)皿中，24 h內(nèi)對(duì)葉片進(jìn)行處理。

1.2 供試病原菌

棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum Lib.）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、葡萄炭疽病菌（Colletot-richum gloeosporioides）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）均由贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院袁小勇教授提供。

1.3 茄子葉際固氮菌分離篩選

將取回的新鮮葉片置于裝有100 mL無菌磷酸緩沖液（pH 7.0，含0.1% Tween）的錐形瓶中，保證溶液完全浸沒葉片，25 ℃ 200 r/min搖床振蕩30 min，超聲波40 kHz 超聲5 min，用鑷子取出葉片，將其余的溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，然后以10 000 r/min離心10 min，倒掉上清，收集得到沉淀菌體。吸取 100 μL稀釋液平板涂布法均勻接種到固體Ashby無氮培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d。根據(jù)菌落形態(tài)選擇長(zhǎng)勢(shì)較好、生長(zhǎng)速度較快的不同菌落進(jìn)行劃線純化，直至出現(xiàn)有規(guī)則的單菌落。

1.4 菌株16S rDNA和nifH基因的PCR擴(kuò)增

將篩選獲得的固氮菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min的搖床中過夜培養(yǎng)，收集菌體，用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，以細(xì)菌16S rDNA全序列通用引物27F/1492R［9］和固氮基因nifH特定的引物PolF/PolR［10］分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物有限公司測(cè)序，使用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件采用最大似然（ML）算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 固氮酶活性測(cè)定

按照微生物固氮酶（NITS）ELISA試劑盒說明書操作測(cè)定。取96孔酶標(biāo)板，分別依次加入待測(cè)樣本10 μL，樣本稀釋液40 μL，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，37 ℃溫育60 min，棄去液體，然后加入200 μL洗滌緩沖液洗板5次，加入顯色液37 ℃避光孵育15 min，加入終止液50 μL終止反應(yīng)于15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。同時(shí)以不同標(biāo)準(zhǔn)活性的標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本固氮酶活性。每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。

1.6 菌株培養(yǎng)特性研究

1.6.1 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

取等量的細(xì)菌培養(yǎng)液接種于pH為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的LB液體培養(yǎng)基中，每個(gè)pH至少做3個(gè)平行試驗(yàn)，置于28? ℃下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測(cè)定菌液OD600的平均值，確定菌株的最適生長(zhǎng)pH。

1.6.2 NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

取等量細(xì)菌培養(yǎng)液接種到含NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1%、2%、3%和4%的LB液體培養(yǎng)基中，至少做3個(gè)平行試驗(yàn)，置于28? ℃下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測(cè)定其OD600的平均值，確定菌株的耐鹽性。

1.6.3 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

配制分別由麥芽糖、葡萄糖、淀粉和蔗糖代替LB培養(yǎng)基中的碳源（酵母粉）的液體培養(yǎng)基，取等量細(xì)菌培養(yǎng)液接種于上述培養(yǎng)基中，至少做3個(gè)平行試驗(yàn)，置于28? ℃下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分別測(cè)定不同碳源下菌液OD600。

1.7 固氮菌對(duì)植物病原真菌的抑制活性

采用平板對(duì)峙法［11-12］研究固氮菌對(duì)植物病原真菌的抑制活性。將病原菌菌餅接種于PDA瓊脂平板（d=8.5 cm）中央，在距離菌餅兩側(cè)3 cm處劃線接種菌株，將接種后的培養(yǎng)皿在28? ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d，同時(shí)接種只含有病原真菌的PDA瓊脂平板作為對(duì)照。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，根據(jù)以下公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率：菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-對(duì)峙板菌落直徑） /對(duì)照菌落直徑 × 100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌的分離及鑒定

從茄子葉際分離到1株能在Ashby無氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快的菌株。經(jīng)過5代的分離純化后，其菌落為圓形半透明，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)，不易挑起，能夠產(chǎn)生黏液。在顯微鏡下觀察為棒桿狀（圖1）。通過擴(kuò)增固氮酶基因nifH進(jìn)行復(fù)篩，擴(kuò)增得到大小約為360 bp的基因片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致，將其編號(hào)為QZ-1。運(yùn)用ELISA法測(cè)定其固氮酶活性，菌株QZ-1的固氮酶活性為78.79 IU/L，結(jié)合nifH基因擴(kuò)增和固氮酶活性測(cè)定確定菌株QZ-1具有固氮能力。菌株QZ-1的16S rDNA序列1 437 bp，序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登記號(hào)為ON778565。在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株QZ-1和克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae親緣關(guān)系最近，聚為一支，序列相似度大于99%，因此將QZ-1命名為Klebsiella sp.QZ-1（圖3）。

2.2 固氮菌的培養(yǎng)特性

2.2.1 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

從圖4可以看出，菌株QZ-1在pH為5.0～9.0時(shí)生長(zhǎng)較好，生長(zhǎng)速率隨pH的增大呈減小趨勢(shì)，在pH為5.0時(shí)OD600達(dá)到最大，說明克雷伯氏菌對(duì)pH有較強(qiáng)的酸堿適應(yīng)性。在pH為6.0時(shí)比pH為8.0時(shí)生長(zhǎng)狀況好，說明菌株QZ-1為中性偏酸菌。

2.2.2 NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

菌株QZ-1在0～4% NaCl濃度下均能生長(zhǎng)，說明菌株有較廣的鹽度適應(yīng)性。菌株的生長(zhǎng)速率隨NaCl濃度的增大而減小，在NaCl濃度為0時(shí)，OD600達(dá)到最大，NaCl濃度為4%時(shí)，OD600最?。▓D5）。由此可見，該菌株的最佳NaCl濃度為0，較為適宜的NaCl濃度為0～3%。

2.2.3 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

當(dāng)LB培養(yǎng)基中的酵母粉被淀粉、麥芽糖、蔗糖和葡萄糖替代后，菌株QZ-1對(duì)各碳源均能利用，但是酵母粉被替代后生長(zhǎng)狀況不好，在培養(yǎng)48 h后，以淀粉為碳源的菌液OD600最高（1.32），遠(yuǎn)低于在LB培養(yǎng)基中OD600（2.73），說明酵母粉為菌株的最佳碳源（圖6）。

2.3 固氮菌對(duì)植物病原真菌的抑制活性

菌株QZ-1具有廣譜抗真菌活性，對(duì)多種植物病原菌的抑制率從大到小依次為油菜菌核病菌（63.53%）、葡萄炭疽病菌（57.14%）、番茄灰霉病菌（48.75%）、稻瘟病菌（33.33%）、棉花立枯病菌（31.91%）、蘋果輪紋病菌（21.88%）、棉花枯萎病菌（22.22%）、黃瓜灰霉病菌（8.57%），可見，其對(duì)油菜菌核病菌、葡萄炭疽病菌、番茄灰霉病菌活性的抑制效果較好，對(duì)黃瓜灰霉病菌活性的抑制效果最弱。與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組的抑菌圈邊界清晰，抑菌圈周圍菌絲生長(zhǎng)緩慢（圖7）。

3 討論與結(jié)論

自生固氮菌可以獨(dú)立進(jìn)行固定空氣中分子態(tài)氮，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加農(nóng)作物產(chǎn)量，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。植物葉際存在高水平的碳水化合物和碳氮比，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，存在廣泛的固氮作用，在自然條件下已經(jīng)發(fā)現(xiàn)菊科、禾本科、十字花科、薔薇科、杜鵑科、榆科等科的植物葉際具有較高的固氮酶活性［2-3］。人工接種葉面固氮菌可以達(dá)到增產(chǎn)增收的效果，大豆噴施葉面固氮菌的增產(chǎn)率可達(dá)13%以上，玉米在苗期和孕穗期噴施葉際固氮菌可增產(chǎn)10%以上［4］。自生固氮菌因其不與植物形成宿主關(guān)系且適應(yīng)能力強(qiáng)，具有增加農(nóng)作物產(chǎn)量以及綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已成為21世紀(jì)新型肥料發(fā)展的重要方向之一。

該研究從茄子葉際分離到一株自生固氮菌QZ-1，經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)分析鑒定為Klebsiella屬，將其命名為Klebsiella sp.QZ-1。據(jù)研究報(bào)道，克雷伯氏菌屬的一些種類是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌，大部分克雷伯氏菌基因組可檢測(cè)出固氮基因nif，說明該屬細(xì)菌具有固氮的遺傳基礎(chǔ)，對(duì)植物的生長(zhǎng)及代謝起著間接的促進(jìn)作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可作為一種綠色菌肥［13］。羅霆等［14］從甘蔗根系分離篩選到1株克雷伯氏固氮菌，其固氮百分率可達(dá)29.2％。李樹品等［15］和黃磊等［16］從小麥根系分離得到3株具有高固氮酶活性的克雷伯氏菌。韓梅等［17］從玉米中分離的內(nèi)生固氮菌克雷伯氏菌（K.trevisan），具有促進(jìn)玉米生長(zhǎng)的作用。該研究分離的自生固氮菌QZ-1在碳源氮源的利用方面基本與同屬的固氮菌利用情況相似，在淀粉為碳源或者無氮條件下都能生長(zhǎng)良好，能耐受低濃度的鹽類，在偏酸（pH 5.0）的環(huán)境下生長(zhǎng)良好，而現(xiàn)階段報(bào)道的菌株適應(yīng)的pH為5.5～7.2，該試驗(yàn)篩選菌株與一般的在酸性環(huán)境下難以生存的菌株形成差異，在菌肥應(yīng)用中能更好地用于不同酸堿度的土壤，因此可以更廣泛地應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

克雷伯氏菌作為生防菌，對(duì)多種植物病原真菌均有抑菌活性。如Park等［18］研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K.oxytoca）可防治胡蘿卜軟腐病。從石斛上分離到一株內(nèi)生細(xì)菌（K.variicola）可防治由鏈格孢引起的煙草赤星病、甘藍(lán)黑斑病和番茄早疫病等［19］。該研究中分離的菌株Klebsiella sp. QZ-1具有廣譜抗真菌活性，對(duì)油菜菌核病菌、葡萄炭疽病菌、番茄灰霉病菌抑制效果可達(dá)40%以上。因此，自生固氮菌QZ-1的篩選為葉際固氮菌的研究提供了微生物資源，由于克雷伯氏菌繁殖速度快，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，具有固氮和生防作用，繁殖過程中能夠產(chǎn)生黏液，易于在植物葉際定殖等優(yōu)點(diǎn)，可望高效地應(yīng)用于固氮菌劑中進(jìn)行資源化利用。

參考文獻(xiàn)

［1］VORHOLT J A.Microbial life in the phyllosphere ［J］.Nat Rev Microbiol，2012，10（12）：828-840.

［2］ 潘建剛，呼慶，齊鴻雁，等.葉際微生物研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，31（2）：583-592.

［3］ 沙小玲，梁勝賢，莊緒亮，等.植物葉際固氮菌研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2017，44（10）：2443-2451.

［4］ 王楠，李剛強(qiáng)，李云龍，等.固氮類芽孢桿菌的分離鑒定及其促生、抑菌活性的測(cè)定［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2019，21（5）：95-103.

［5］ GIRI S，PATI B R.A comparative study on phyllosphere nitrogen fixation by newly isolated Corynebacterium sp.& Flavobacterium sp.and their potentialities as biofertilizer［J］.Acta Microbiol Immunol Hung，2004，51（1/2）：47-56.

［6］ MWAJITA M R，MURAGE H，TANI A，et al.Evaluation of rhizosphere，rhizoplane and phyllosphere bacteria and fungi isolated from rice in Kenya for plant growth promoters［J］.SpringerPlus，2013，2：1-9.

［7］奚輝，陳喜靖，景金富，等.滴灌施肥對(duì)秋茄子生長(zhǎng)、產(chǎn)量及品質(zhì)的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（7）：1000-1001，1003.

［8］ 焦永剛，郭敬華，董靈迪，等.生物菌肥對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境改良效果［J］.北方園藝，2017（13）：135-139.

［9］ 李瑞芳，趙玉峰，薛雯雯，等.一株芽孢桿菌16S rRNA 的基因序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（3）：121-122，125.

［10］ RSCH C，MERGEL A，BOTHE H.Biodiversity of denitrifying and dinitrogenfixing bacteria in an acid forest soil ［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68（8）：3818-3829.

［11］ 王家和.煙草根病拮抗真菌的分離與篩選［J］.中國(guó)生物防治，1998，14（1）：28-31.

［12］ 馮蓉，劉麗，陳海念，等.解淀粉芽孢桿菌F11抗真菌活性研究［J］.農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2021，38（5）：849-857.

［13］ 李夢(mèng)嬌，彭晟，徐紹忠，等.克雷伯氏菌在農(nóng)業(yè)與環(huán)境治理上的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)進(jìn)展，2014，4（6）：415-420.

［14］ 羅霆，歐陽雪慶，楊麗濤，等.1株有固氮能力的甘蔗克雷伯氏菌的分離鑒定及固氮特性［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2010，31（6）：972-978.

［15］ 李樹品，蔣千里，楚杰，等.產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌（klebsiella oxytoca）的分離及其特性研究［J］.山東科學(xué)，1991，4（3）：19-25.

［16］ 黃磊，石萬瑜，董紹佩，等.小麥根系克雷伯氏桿菌的分離與鑒定［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990，27（1）：27-28.

［17］ 韓梅，羅培宇，肖亦農(nóng)，等.玉米內(nèi)生固氮菌的分離鑒定及其促生長(zhǎng)作用研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（1）：94-97.

［18］ PARK M R，KIM Y C，LEE S，et al.Identification of an ISRrelated metabolite produced by rhizobacterium Klebsiella oxytoca C1036 active against softrot disease pathogen in tobacco［J］.Pest Manag Sci，2009，65（10）：1114-1117.

［19］ 李祖紅，曾嶸，文國(guó)松，等.一株植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1及其應(yīng)用：CN201310383464.0［P］.2014-01-01.