茶皂素對腎癌細胞ACHN凋亡與遷移的機制研究

田迪 陳志云 吳沖 宋羚 趙英良 桂明英 馬嘯

摘 要：目的：探究腎癌細胞 ACHN 經(jīng)不同濃度茶皂素（TS）組處理后，對細胞凋亡及遷移的影響及其相關(guān)機制。方法：以腎癌細胞ACHN為研究對象，在二甲基噻唑藍比色法（MTT）細胞活性測定后，將細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中，分別用0、10、20、30 mg/L濃度的茶皂素處理細胞24 h。對細胞進行蘇木精-伊紅染色法（HE）、DAPI染色法（DAPI）觀察不同茶皂素處理濃度時腎癌細胞的細胞形態(tài)及凋亡情況。劃痕實驗觀察不同濃度茶皂素處理情況下細胞的遷移狀況，蛋白免疫印跡法對調(diào)控細胞凋亡的蛋白，如Bax、Bcl-2、核轉(zhuǎn)錄因子-кB（NF-кB P53）、Caspase-9等與對細胞遷移有影響的基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白進行印跡分析。結(jié)果：在一定范圍內(nèi)，隨著茶皂素處理濃度的增加腎癌細胞ACHN凋亡程度逐漸增大，對其遷移能力的抑制逐漸增加，對細胞凋亡有促進作用的Bax、P53、Caspase-9等蛋白的表達與無茶皂素處理組相比有增加趨勢，而對細胞凋亡有抑制作用的蛋白Bcl-2表達則呈降低的趨勢，促進細胞遷移的MMP-2蛋白表達也受到抑制。結(jié)論：茶皂素在腎癌治療方面具有一定的潛在價值。

關(guān)鍵詞：茶皂素；腎癌細胞；細胞活性；凋亡；機制

腎細胞癌又稱腎癌，主要起源于腎小管上皮細胞，屬于惡性腫瘤的一種，多發(fā)生于泌尿系統(tǒng)中，是成人腎臟中最常見的一種惡性疾病，且男性發(fā)病率遠高于女性[1-4]。近年來，全球腎癌患者的數(shù)量以每年30萬人的速度持續(xù)上漲[5]。目前，腎癌的主要治療方法為手術(shù)切除和傳統(tǒng)藥物治療[6]。盡管手術(shù)治療效果較好，但是手術(shù)治療也存在著復(fù)發(fā)率較高和早期轉(zhuǎn)移的風險[7]，而以白介素和干擾素為代表的傳統(tǒng)免疫治療在腎癌的治療過程中不僅效率低而且還存在著較大的副作用[8]，并且腎癌細胞對這些傳統(tǒng)藥物具有一定的耐藥性。因此，研發(fā)出一種能更加有效抑制腎癌細胞增殖與遷移并且安全性較高、耐藥性小的藥物具有重要的意義。茶皂素又稱茶皂甙，是茶葉的主要活性成分之一，屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷的混合物，主要存在于茶樹的種子中，除此之外在茶樹的根、莖、葉和花中也有分布[9]。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素具有多種藥理活性，如抗炎、抑菌、降血脂、抗氧化和抗癌等[10-12]，但目前有關(guān)茶皂素對癌癥治療方面的研究報道較少。研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素可通過抑制Bcl-2蛋白表達，增加Bax蛋白表達，并活化Caspase-3蛋白的活性來誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠肝瘤癌細胞凋亡[13]。因此，推測茶皂素對腎癌ACHN細胞的增殖與遷移也具有抑制作用。實驗通過研究茶皂素對腎癌細胞ACHN凋亡與遷移的作用，通過細胞遷移、DAPI細胞核染色、對凋亡蛋白進行檢測等試驗，初步明確茶皂素對腎癌細胞ACHN增殖與遷移抑制的作用機制，為茶皂素對腎癌的抑制方面研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶皂素，購自北京索萊寶科技有限公司；人腎癌細胞株ACHN，購自中科院昆明細胞庫；MTT、DAPI，均購自Sigma公司；DMEM高塘培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青鏈霉素，購自美國Hyclone公司；Bax、Bcl-2、MMP-2、P53、Caspase-9、β-Tubulin等抗體，購自美國CST公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱；超凈工作臺；北京六一電泳儀；Thermo Fisher倒置顯微鏡；盧湘儀自動平衡離心機；低溫高速離心機；Thermo Fisher高端酶標儀；蛋白熒光成像系統(tǒng)。

1.3 細胞培養(yǎng)

將腎癌ACHN細胞株按1×106個細胞/板的密度培養(yǎng)在100 mm直徑培養(yǎng)皿中，在含10%牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中保持生長，保持培養(yǎng)箱中含5%CO2，溫度維持在37 ℃。當細胞生長到鋪滿培養(yǎng)皿底的90%～95%時對細胞進行處理。

1.4 MTT法檢測腎癌細胞ACHN的存活率

將細胞以1×104個/孔的密度接種到96孔板中，分別為對照組和茶皂素處理組，茶皂素處理組濃度梯度為0、10、30、60、100 mg/L，設(shè)6組平行，避光培養(yǎng)24 h后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入濃度為3 mg/mL的MTT試劑20 μL，在5% CO2和37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h后，除去培養(yǎng)基，加160 μL的DMSO在搖床上混合10 min后，在酶標儀上492 nm處測吸光度并按式（1）計算細胞存活率。

細胞存活率（%）=藥物處理組的OD值/對照組的OD值×100%（1）

1.5 細胞劃痕試驗檢測腎癌細胞ACHN的遷移能力

將處于對數(shù)生長期的細胞，采用3×105個細胞/板的密度接種到60 mm的培養(yǎng)皿中，在5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時，用200 μL的滅菌槍頭在培養(yǎng)皿內(nèi)劃一條直線，用PBS清洗兩次，洗去細胞碎渣，每皿加入4 mL的高糖培養(yǎng)基，分別用0（對照組）、10、20、30 mg/L的茶皂素處理。在5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞向劃痕區(qū)遷移的相對距離并拍照，按式（2）計算細胞遷移率。每組設(shè)5個平行，取平均值。

遷移率（%）=給藥組細胞遷移面積/對照組細胞遷移面積×100%（2）

1.6 細胞凋亡檢測

將細胞按1×105個/孔的密度接種于事先放置爬片的12孔板上進行培養(yǎng)，待細胞均勻鋪滿爬片并貼壁生長后，加入0（對照組）、10、20、30 mg/L茶皂素處理24 h。處理結(jié)束后，用PBS清洗1次，多聚甲醛固定15 min后，將爬片放置事先滴有DAPI染液的載玻片上避光靜置25 min，然后在熒光顯微鏡下進行觀察拍照。設(shè)置3組平行。

1.7 HE染色

將細胞以4×105個/孔的密度接種于6孔板中進行分組培養(yǎng)，待細胞均勻鋪滿底部后加入0（對照組）、10、20、30 mg/L茶皂素處理24 h。對照組和給藥組均采用無血清培養(yǎng)，處理結(jié)束后，用冷PBS清洗2次，按照說明書加入蘇木精-伊紅染料，然后在倒置顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.8 Western blot分析

將細胞以1×106個/板的密度接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁生長后，加入不同濃度茶皂素處理24 h，棄去廢液，用冷PBS清洗2次，每板加入270 μL的細胞裂解液（RIPA裂解液∶PMSF為100∶1）放入冰盒處理30 min后，刮下培養(yǎng)皿上的細胞及液體，設(shè)置離心機參數(shù)為4 ℃，15 000 r/min離心10 min，取上清進行BCA蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果進行制樣，95 ℃煮樣10 min。將樣品逐一加入事先配制好的SDS-PAGE膠板中，設(shè)置電泳參數(shù)：第一階段為50 V，30 min；第二階段為120 V，70 min，隨后轉(zhuǎn)膜57 min。用5%脫脂乳粉封閉1 h后，加一抗在4 ℃冰箱過夜，然后用1xTBST洗膜3次，加二抗常溫孵育1 h，1xTBST洗膜3次，曝光。

1.9 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)取平均值，采用SPSS 17.0軟件用單因素方差進行統(tǒng)計分析，蛋白印跡圖像采用Image J軟件進行處理分析，采用GraphPad prism 5軟件作圖（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素對腎癌細胞ACHN存活率的影響

ACHN細胞經(jīng)0、10、30、60、100 mg/L的茶皂素處理24 h后，用MTT檢測細胞的存活率，如圖1所示，與對照組相比，12.5 mg/L茶皂素處理組的ACHN細胞生長受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且隨著茶皂素濃度的增加這種抑制作用就越強（P＜0.001），成濃度劑量依賴性，在50 mg/L時，ACHN細胞存活率降至最低（P＜0.001）。茶皂素24 h的IC50值為25.38 mg/L。

2.2 茶皂素抑制腎癌細胞ACHN的遷移能力

為了減少茶皂素對細胞的毒副作用，分別采取0（空白對照組）、10、20、30 mg/L的茶皂素處理細胞，進行細胞遷移試驗。如圖2所示，隨著茶皂素濃度的增加ACHN細胞遷移率逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。劃痕試驗結(jié)果表明，茶皂素對腎癌ACHN細胞的遷移能力具有抑制作用，且遷移率呈濃度依賴性降低。

2.3 茶皂素促進腎癌細胞ACHN的凋亡

由圖3可以觀察出，隨著茶皂素濃度的增加，細胞核的數(shù)量越來越少，表明腎癌細胞ACHN隨茶皂素濃度的遞增其凋亡的程度也逐漸增加。

2.4 HE染色結(jié)果

由圖4可以看出，加入不同濃度的茶皂素處理24 h后，隨著茶皂素濃度的增加，細胞核數(shù)量越來越少，并且細胞核體積整體出現(xiàn)增大的趨勢。

2.5 茶皂素對Bax、Bcl-2、MMP-2、Caspase-9、P53蛋白表達的影響

凋亡是抑制癌細胞增殖的主要機制之一，Bcl-2基因家族主要調(diào)控著細胞的凋亡，包括抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax等，可通過抑制Bcl-2和促進Bax基因的表達來促進癌細胞的凋亡[14]。而P53則是Bax上游的一個十分重要的抑癌基因，該基因編碼的蛋白可抑制腫瘤細胞的侵襲、增殖，在腫瘤血管的生成方面也發(fā)揮著有效的抑制作用[15]。因此，可通過激活P53基因的表達來抑制癌細胞的擴散并且促進其凋亡。細胞凋亡途徑最終是通過激活Caspase家族成員，然后作用于基底蛋白，使其分解而引起凋亡[16]。Caspase-9作為腎癌細胞凋亡通路中的重要因子，是細胞凋亡的直接效應(yīng)蛋白，可激活下游的細胞凋亡因子Cappase-3導(dǎo)致細胞凋亡[17]，該凋亡通路可由Bax來激活[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中增加Caspase-9及其下游靶蛋白Caspase-3的蛋白表達水平，可以促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生[19]。癌細胞除了具有無限增殖的特點外，還有著極強的侵襲和遷移功能[20]。腫瘤細胞的侵襲是一個復(fù)雜的、多步驟的過程，其中細胞外基質(zhì)和基底膜的降解是必需的步驟[21]。而MMP-2及其下游的MMP-9是降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶[22]，對癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有促進作用[23]，因此降低MMP-2和MMP-9的蛋白表達可使癌細胞的侵襲和遷移能力受到抑制，對癌癥的預(yù)防及治療具有重要的意義。與0 mg/L組對比，30、40 mg/L茶皂素處理組顯著抑制了Bcl-2、MMP-2蛋白的表達，上調(diào)了Bax、P53、Caspase-9蛋白的表達。隨著茶皂素濃度的增加，Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平逐漸降低，而Bax、P53、Caspase-9蛋白表達水平則呈增高趨勢，組間蛋白表達水平差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05、P＜0.01）。

3 結(jié)論

腎癌的發(fā)生主要是由于細胞不能正常進行程序性死亡，進而表現(xiàn)為細胞的無限增殖。試驗首先檢測茶皂素對腎癌ACHN細胞活性的影響，在24 h內(nèi)，茶皂素呈濃度依賴性地抑制了腎癌ACHN細胞的活性，可初步證實茶皂素具有體外抗腎癌ACHN細胞的活性。通過western blot可得，茶皂素對P53、Bax和Caspase-9蛋白表達水平均具有促進作用，對Bcl-2蛋白表達水平具有抑制作用，而細胞遷移試驗結(jié)果表明，茶皂素對腎癌細胞ACHN的遷移具有抑制作用，且具有濃度依賴性。研究表明，茶皂素具有可抑制腎癌細胞ACHN的增殖和遷移的能力，能促進腎癌ACHN細胞的凋亡，其作用機制可能與Bax、Bcl-2、P53、MMP-2、Caspase-9等蛋白的表達有關(guān)，為茶皂素在抑癌方面的進一步開發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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Abstract：Objective To investigate the effects of different concentrations of cordycepin on apoptosis and migration of renal cancer ACHN cell lines and the related mechanisms.Method ACHN cells were used as the research object.After MTT cell activity was determined，the cells were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and treated with 0，10，20，30 mg/L tea saponin for 24 h，respectively.He staining and DAPI staining were performed to observe the cell morphology and apoptosis of renal carcinoma cells treated with different concentrations of tea saponin.The migration status of cells treated with different concentrations of tea saponin was observed by scratch experiment.The proteins that regulate cell apoptosis，such as Bax，Bcl-2，P53，Caspase-9，and MMP-2 proteins of matrix metalloproteinase family，which have influence on cell migration，were analyzed by Western Blot.Result Within a certain range，with the increase of tea saponin treatment concentration，the apoptosis degree of ACHN in renal cancer cells gradually increased，and the inhibition of its migration ability gradually increased.Compared with the group without tea saponin treatment，the expression of Bax，P53，Caspase-9 and other proteins which can promote cell apoptosis showed an increasing trend.The expression of Bcl-2，which can inhibit cell apoptosis，was decreased，and the expression of MMP-2，which can promote cell migration，was also inhibited.Conclusion Tea saponin has potential value in the treatment of renal cancer.

Keywords：tea saponin;renal cancer cell;cell activity;apoptosis;mechanism