• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    長鏈非編碼RNA DLX6-AS1調控喉癌細胞的機制研究

    2023-06-09 02:35:36穆妮熱賈帕爾阿依恒曲庫爾汗皮力東庫亞西穆扎排爾米爾扎克木新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科新疆烏魯木齊830000
    局解手術學雜志 2023年6期
    關鍵詞:喉癌熒光素酶極化

    穆妮熱·賈帕爾,阿依恒·曲庫爾汗,雍 軍,皮力東·庫亞西,穆扎排爾·米爾扎克木 (新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科,新疆 烏魯木齊 830000)

    喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤,飲酒和吸煙是喉癌的主要誘因,研究發(fā)現(xiàn)在過去30年里,早期喉癌患者主要通過手術及放化療手段進行治療,但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時為中晚期,治療效果不佳,導致患者的生存率有所下降[1-2]。因此,找到喉癌靶向治療的有效標志物至關重要。有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤樣本被大量的炎癥細胞浸潤,如I型輔助性T淋巴細胞、調節(jié)性T細胞和腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)[3]。TAMs是腫瘤微環(huán)境中至關重要的免疫細胞,與腫瘤不良預后相關,根據巨噬細胞的激活狀態(tài)可分為M1表型和M2表型。一般情況下,M1極化的巨噬細胞能夠分泌促炎細胞因子來消滅腫瘤細胞,以白細胞介素10(interleukin 10,IL-10)和精氨酸酶1(arginase 1,Arg-1)為主要標記物,參與血管生成和腫瘤進展[4]。TAMs主要屬于M2極化的巨噬細胞,可促進腫瘤生長、侵襲和轉移[5-6],在腫瘤進展中起重要作用,但其在喉癌發(fā)展中的分子機制尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)與多種病理過程密切相關,特別是腫瘤發(fā)生[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA DLX6-AS1作為一種新型的lncRNA參與了肺癌、胃癌、膀胱癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展[8-10],然而lncRNA DLX6-AS1對喉癌發(fā)展的影響及其作用機制尚不明確,因此本研究深入探討了lncRNA DLX6-AS1在喉癌細胞發(fā)展中的生物學功能。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器與試劑

    人喉表皮樣癌細胞Hep-2購自中國科學院上海細胞庫。qRT-PCR儀器購自西安天隆生物科技有限公司,酶標儀購自美國賽默飛世爾科技有限公司,細胞培養(yǎng)箱購自上海航佩儀器有限公司。Transwell Insert小室(膜孔徑為0.4 μm)購自美國Corning公司,lncRNA DLX6-AS1干擾質粒(si-lncRNA DLX6-AS1)及其陰性對照(si-NC)、lncRNA DLX6-AS1過表達質粒(pcDNA-lncRNA DLX6-AS1)及其過表達對照[pcDNA-3.1(+)]、miR-144抑制劑(miR-144 inhibitor)和miR-144模擬物(miR-144 mimics)購自上海吉瑪基因有限公司,CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司,RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和Taq-Man microRNA購自杭州沃森生物技術有限公司,CD163、E-cadherin和N-cadherin抗體購自英國Abcam公司,LipofectamineTM2000購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

    1.2 人外周血單核細胞(peripheral blood mono?nuclear cells,PBMCs)和TAMs的分離

    本研究經我院醫(yī)學倫理委員會批準(K202104-05)。采集健康志愿者新鮮外周血,使用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)密度梯度離心法分離PBMCs,將稀釋的全血加入分離層的上層,離心后吸出囊泡細胞,PBS沖洗,沉淀重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1.5 h,收集貼壁細胞。將新鮮的腫瘤組織用膠原酶消化得到單細胞懸液,抗CD11b磁珠孵育。使用MACS-LS色譜柱分離CD11b陽性細胞。細胞培養(yǎng)1 h,采用流式細胞術檢測CD11b陽性的TAMs。

    1.3 細胞培養(yǎng)和細胞轉染

    人喉表皮樣癌細胞Hep-2在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2的濕室中。將人單核細胞白血病細胞THP-1置于含10%胎牛血清、10 000 U/mL青霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 000 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將THP-1細胞與100 ng/mL佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)孵育48 h,誘導THP-1向巨噬細胞分化后,用白細胞介素4(interleu?kin 4,IL-4)20 ng/mL繼續(xù)誘導THP-1細胞,使其分化為M2型巨噬細胞。共培養(yǎng)實驗中,THP-1細胞(M2型巨噬細胞)接種于Transwell Insert小室中,Hep-2細胞在底孔中培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞分為Control組(THP-1與Hep-2細胞共培養(yǎng),Hep-2細胞不作任何處理)和IL-4組(20 ng/mL IL-4作用于THP-1細胞,THP-1與Hep-2細胞共培養(yǎng))。為了檢測下調lncRNA DLX6-AS1對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響,將IL-4組細胞分為IL-4+si-NC組(Hep-2細胞轉染4 μg si-NC質粒)與IL-4+si-DLX6-AS1組(Hep-2細胞轉染4 μg si-DLX6-AS1質粒)。為了檢測lncRNA DLX6-AS1與miR-144的關系,將Control組細胞分為DLX6-AS1 WT+mimics NC組(Hep-2細胞轉染4 μg lncRNA DLX6-AS1 WT+mimics NC質粒)、DLX6-AS1 WT+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg DLX6-AS1 WT+miR-144 mimics質粒)、DLX6-AS1 MUT+mimics NC組(Hep-2細胞轉染4 μg DLX6-AS1 MUT+mimics NC質粒)、DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics質粒)。為了檢測上調lncRNA DLX6-AS1通過miR-144對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響,將IL-4組細胞分為pcDNA-3.1(+)+mimics NC組[Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-3.1(+)+mimics NC質粒]、pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC組(Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC質粒)、pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics質粒)、pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics質粒)。為了檢測上調miR-144對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響,將IL-4組細胞分為IL-4+mimics NC組(Hep-2細胞轉染4 μg mim?ics NC質粒)、IL-4+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg miR-144 mimics質粒)。用LipofectamineTM2000將質粒共轉染到細胞中。

    1.4 qRT-PCR檢測lncRNA DLX6-AS1、miR-144、IL-10和Arg-1的表達

    分離總RNA,逆轉錄酶反應合成cDNA。采用TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和Taq-Man microRNA進行qRT-PCR。以U6或GAPDH分別作為內源對照,采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.5 Western blot檢測CD163、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達

    提取的40 μg蛋白經SDS-PAGE轉移到硝酸纖維素膜上,用5%脫脂乳阻斷,與抗CD163(1∶1 000)、E-cadherin(1∶5 000)、N-cadherin(1∶6 000)和GAPDH(1∶4 000)的一抗于4 ℃孵育12 h,用二抗室溫孵育2 h,對免疫復合物進行可視化檢測。

    1.6 CCK-8實驗檢測Hep-2細胞增殖活力

    與THP-1細胞(M2型巨噬細胞)共培養(yǎng)48 h后,收集Hep-2細胞,接種于96孔板。在每孔中加入100 μL CCK-8,置于細胞培養(yǎng)箱孵育4 h,按說明書測定細胞增殖活力。

    1.7 Transwell實驗檢測Hep-2細胞侵襲數(shù)目

    在Transwell上腔室中添加200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)Hep-2細胞(4×104細胞)。將含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入下腔,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h,對侵襲的細胞進行固定和結晶紫染色,隨機選取6個區(qū)域計數(shù)侵襲的細胞。

    1.8 雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定熒光素酶活性

    使用在線軟件miRcode進行生物信息學分析,預測lncRNA DLX6-AS1與靶基因miR-144的結合位點。Hep-2細胞置于24孔板過夜。用LipofectamineTM2000分別將DLX6-AS1 WT+mimics NC、DLX6-AS1 WT+miR-144 mimics、DLX6-AS1 MUT+mimics NC和DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics質粒共轉染至Hep-2細胞,48 h后檢測熒光素酶活性。

    1.9 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據采用SPSS 17.0軟件進行分析,結果以3次重復獨立實驗的均數(shù)±標準差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 lncRNA DLX6-AS1與miR-144在PBMCs與TAMs中的表達

    與PBMCs相比,TAMs中IL-10和Arg-1的mRNA表達明顯升高(P<0.01),見圖1a。與PBMCs相比,TAMs中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1表達顯著升高(P<0.01),miR-144表達顯著降低(P<0.01),見圖1b。

    圖1 qRT-PCR檢測PBMCs和TAMs中IL-10、Arg-1、lncRNA DLX6-AS1和miR-144的表達

    2.2 下調lncRNA DLX6-AS1抑制IL-4誘導的巨噬細胞M2極化

    qRT-PCR結果顯示,與Control組相比,IL-4組THP-1巨噬細胞的lncRNA DLX6-AS1 mRNA表達顯著上調(P<0.01);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組THP-1巨噬細胞的lncRNA DLX6-AS1 mRNA表達顯著下調(P<0.01),見圖2a。與Control組相比,IL-4組THP-1巨噬細胞IL-10和Arg-1的mRNA表達顯著上調(P<0.01);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組THP-1巨噬細胞IL-10和Arg-1的mRNA表達則顯著下調(P<0.01),見圖2b、c。在THP-1巨噬細胞中,與Control組相比,IL-4組M2巨噬細胞標志物CD163蛋白的表達顯著增加(P<0.01);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組CD163蛋白的表達顯著降低(P<0.01),見圖2d、e。

    圖2 下調lncRNA DLX6-AS1抑制IL-4誘導的巨噬細胞M2極化

    2.3 下調lncRNA DLX6-AS1抑制巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

    CCK-8實驗結果顯示,與Control組相比,IL-4組Hep-2細胞活力顯著增加(P<0.05);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組Hep-2細胞活力顯著下降(P<0.05),說明巨噬細胞M2極化促進了Hep-2細胞增殖,見圖3a。與Control組相比,IL-4組Hep-2細胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01),N-cadherin表達顯著上調(P<0.01),E-cadherin表達顯著下調(P<0.01);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組Hep-2細胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01),N-cadherin表達顯著下調(P<0.01),E-cadherin表達顯著上調(P<0.01),見圖3b~e。

    圖3 下調lncRNA DLX6-AS1抑制巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

    2.4 lncRNA DLX6-AS1可與miR-144相互作用

    使用在線軟件miRcode進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn),lncRNA DLX6-AS1與miR-144之間存在潛在的結合位點(圖4a)。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測顯示,lncRNA DLX6-AS1與miR-144之間存在直接相互作用,與DLX6-AS1 WT+mimics NC組相比,DLX6-AS1-WT+miR-144 mimics組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),與 DLX6-AS1 MUT+mimics NC組相比,DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics組熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05),圖4b。

    圖4 lncRNA DLX6-AS1與miR-144的靶點預測和相互關系分析

    2.5 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進巨噬細胞M2極化

    qRT-PCR結果顯示,與Control組相比,IL-4組THP-1巨噬細胞中的miR-144表達水平降低(P<0.01),與IL-4+mimics NC組相比,IL-4+miR-144 mimics組THP-1巨噬細胞中的miR-144 mRNA表達水平顯著上調(P<0.01),見圖5a。IL-4處理THP-1巨噬細胞后,與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC組細胞內IL-10和Arg-1的mRNA表達以及CD163蛋白表達顯著上調(P<0.01);與pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組相比,pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics組細胞內L-10和Arg-1的mRNA表達以及CD163蛋白表達顯著上調(P<0.01),見圖5b~e。

    圖5 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進巨噬細胞M2極化

    2.6 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

    IL-4處理THP-1巨噬細胞后,與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC組Hep-2細胞活力及細胞侵襲數(shù)目顯著增加(P<0.01),N-cadherin表達顯著上調(P<0.01),E-cadherin表達顯著下調(P<0.01);與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組Hep-2細胞活力顯著下降(P<0.01),細胞侵襲數(shù)目顯著減少(P<0.01),N-cadherin表達顯著下調(P<0.01),E-cadherin表達顯著上調(P<0.01);與pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組相比,pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics組Hep-2細胞活力及細胞侵襲數(shù)目顯著增加(P<0.01),N-cadherin表達顯著上調(P<0.01),E-cadherin表達顯著下調(P<0.01),見圖6。

    圖6 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

    3 討論

    有研究表明,在前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥中,巨噬細胞極化均與預后不良具有很強的相關性[11-13]。TAMs參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和腫瘤血管生成。李旭等[12]報道TAMs可通過促進MCF-7細胞發(fā)生上皮間質轉化進而促進乳腺癌的浸潤轉移。由于TAMs主要為M2表型,有研究表明,來自單核細胞的M2型巨噬細胞比M1型巨噬細胞更能促進腫瘤的生長和侵襲[13]。M2型巨噬細胞可明顯減少依托泊苷誘導的癌細胞凋亡,而與M1型巨噬細胞共培養(yǎng)的THP-1細胞凋亡顯著增加[14]。有研究發(fā)現(xiàn),M2型巨噬細胞依賴于M2型巨噬細胞來源的外泌體調節(jié)結直腸癌細胞遷移和侵襲;同時,M2型巨噬細胞來源的外泌體還可促進結腸癌細胞的遷移和侵襲[15]。因此,本研究深入探討了M2型巨噬細胞在喉癌細胞發(fā)展過程中的生物學功能,結果發(fā)現(xiàn),THP-1巨噬細胞衍生的M2型巨噬細胞進一步促進了Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化。

    lncRNA通過調節(jié)人單核細胞/巨噬細胞的分化和極化,在多種病理過程中發(fā)揮調節(jié)作用。Zeng等[16]研究發(fā)現(xiàn),M2型腫瘤相關巨噬細胞分泌的表皮生長因子通過激活EGFR-ERK信號通路和抑制lncRNA LIMT表達促進上皮性卵巢癌轉移。M2型巨噬細胞來源的外泌體lncRNA AFAP1-AS1和microRNA-26a會影響食管癌細胞的遷移和轉移[17]。此外,lncRNA可能通過調節(jié)單核細胞/巨噬細胞極化而發(fā)揮致癌或抑癌的作用。lncRNA COX-2可通過改變M1/M2巨噬細胞極化來阻止肝癌的免疫逃逸和轉移[18]。lncRNA LINC00662可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進M2型巨噬細胞極化和肝癌進展[19]。然而,目前關于lncRNA對喉癌進展中巨噬細胞極化的作用和機制的研究還很有限。本研究首先用qRT-PCR實驗檢測了lncRNA DLX6-AS1在PBMCs與TAMs中的差異表達,結果發(fā)現(xiàn)與PBMCs相比,TAMs中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1表達顯著升高。隨后我們使用干擾技術下調了lncRNA DLX6-AS1的表達,進一步分析了lncRNA DLX6-AS1的作用機制,結果表明下調lncRNA DLX6-AS1表達可抑制IL-4誘導的THP-1巨噬細胞M2極化。本研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞進一步促進了Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化,而下調lncRNA DLX6-AS1表達對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響尚不明了,因此我們繼續(xù)探討了下調lncRNA DLX6-AS1表達后的影響,結果提示lncRNA DLX6-AS1表達降低可通過抑制巨噬細胞M2極化抑制Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化。本研究結果初步揭示了lncRNA DLX6-AS1對喉癌Hep-2細胞惡性發(fā)展的影響及其作用機制,提示lncRNA DLX6-AS1在喉癌發(fā)展過程中發(fā)揮了明顯的促癌作用。

    在后續(xù)的研究中我們發(fā)現(xiàn)lncRNA DLX6-AS1可以與miR-144相互作用。miR-144已在多項研究中被證實參與了調控巨噬細胞極化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如miR-144可通過減輕M1型巨噬細胞相關炎癥來阻止實驗性腹主動脈瘤的形成[20];miR-144可通過調控PBX3抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲[21];此外,miR-144可通過下調激活增強因子結合蛋白4抑制胃癌細胞增殖和侵襲[22]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-144在喉癌患者分離出的TAMs中表達上調,且過表達lncRNA DLX6-AS1可通過miR-144促進IL-4誘導的THP-1巨噬細胞M2極化,并增強Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化能力,這表明miR-144在lncRNA DLX6-AS1調節(jié)M2極化和Hep-2細胞增殖、侵襲及上皮間質轉化過程中扮演了非常重要的角色。

    綜上所述,lncRNA DLX6-AS1可通過調控miR-144表達來促進M2型巨噬細胞的激活,而M2型巨噬細胞激活后可促進Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化。這些結果表明,lncRNA DLX6-AS1通過誘導喉癌巨噬細胞M2極化,在喉癌細胞發(fā)展進程中發(fā)揮了重要作用。

    猜你喜歡
    喉癌熒光素酶極化
    認知能力、技術進步與就業(yè)極化
    NNMT基因啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)的構建及其與SND1靶向關系的驗證
    不同雙熒光素酶方法對檢測胃癌相關miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    重組雙熒光素酶報告基因質粒psiCHECK-2-Intron構建轉染及轉染細胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達
    雙頻帶隔板極化器
    電子測試(2017年15期)2017-12-18 07:18:51
    缺氧誘導因子-1α在喉癌中的表達及意義
    基于PWM控制的新型極化電源設計與實現(xiàn)
    電源技術(2015年1期)2015-08-22 11:16:18
    喉癌組織中Survivin、MMP—2的表達、臨床意義及相關性研究
    人多巴胺D2基因啟動子區(qū)—350A/G多態(tài)位點熒光素酶表達載體的構建與鑒定及活性檢測
    ABCG2及其在喉癌中的研究進展
    精华霜和精华液先用哪个| 欧美+亚洲+日韩+国产| 五月玫瑰六月丁香| av免费在线看不卡| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲国产欧洲综合997久久,| a级毛片免费高清观看在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 九九在线视频观看精品| 国产在线男女| 免费一级毛片在线播放高清视频| 可以在线观看毛片的网站| 一级毛片我不卡| 99久国产av精品国产电影| 1024手机看黄色片| 欧美色视频一区免费| 三级毛片av免费| 免费看av在线观看网站| 日韩欧美国产在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 此物有八面人人有两片| 午夜a级毛片| 国产极品天堂在线| 国产av在哪里看| 免费观看a级毛片全部| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产亚洲5aaaaa淫片| 精华霜和精华液先用哪个| av免费在线看不卡| 成人特级av手机在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| a级毛色黄片| kizo精华| 最好的美女福利视频网| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产蜜桃级精品一区二区三区| av视频在线观看入口| 亚洲成a人片在线一区二区| 赤兔流量卡办理| 国产精品综合久久久久久久免费| 18禁在线播放成人免费| 一级av片app| 91狼人影院| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩强制内射视频| 免费看日本二区| 日韩国内少妇激情av| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲真实伦在线观看| 欧美精品国产亚洲| 欧美激情在线99| 99热全是精品| 一本精品99久久精品77| 99热这里只有是精品50| 国产伦在线观看视频一区| h日本视频在线播放| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国内揄拍国产精品人妻在线| 在线免费观看的www视频| 欧美精品国产亚洲| 日本免费a在线| 性色avwww在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 久久人妻av系列| 免费观看在线日韩| 国产成人精品婷婷| 欧美色欧美亚洲另类二区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品亚洲一区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 婷婷色av中文字幕| 国内精品一区二区在线观看| 久久中文看片网| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 高清在线视频一区二区三区 | 亚洲av成人精品一区久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 欧美精品国产亚洲| 久久人人爽人人片av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美日韩乱码在线| 老司机福利观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 高清日韩中文字幕在线| 麻豆国产av国片精品| av专区在线播放| 大型黄色视频在线免费观看| 淫秽高清视频在线观看| 人妻久久中文字幕网| 欧美不卡视频在线免费观看| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产美女午夜福利| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 天堂影院成人在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲欧美成人精品一区二区| 不卡一级毛片| 国产精品免费一区二区三区在线| 丰满乱子伦码专区| a级毛片a级免费在线| 国产精华一区二区三区| 欧美成人精品欧美一级黄| 黄色欧美视频在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一个人看的www免费观看视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲av.av天堂| 欧美日韩乱码在线| a级毛色黄片| 日本一本二区三区精品| 国产极品天堂在线| videossex国产| 亚洲在线观看片| 国产精品综合久久久久久久免费| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产久久久一区二区三区| 高清午夜精品一区二区三区 | 18+在线观看网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 禁无遮挡网站| 久久亚洲国产成人精品v| www日本黄色视频网| 午夜福利在线观看吧| 欧美精品国产亚洲| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产一级毛片在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 床上黄色一级片| 一本久久中文字幕| 午夜久久久久精精品| 色综合色国产| 国产一区二区在线观看日韩| 我要搜黄色片| 韩国av在线不卡| 国产在线男女| 22中文网久久字幕| 亚洲自偷自拍三级| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲成人中文字幕在线播放| 能在线免费看毛片的网站| 国产精品电影一区二区三区| 成人国产麻豆网| 99久国产av精品国产电影| 免费av观看视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 一级毛片我不卡| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产 一区精品| 夜夜爽天天搞| 国产亚洲精品av在线| 在线观看一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 免费av观看视频| 亚洲美女视频黄频| 午夜激情福利司机影院| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 成人漫画全彩无遮挡| 99久久人妻综合| 一区二区三区高清视频在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产成人精品一,二区 | 级片在线观看| 美女大奶头视频| 日本一二三区视频观看| 亚洲在久久综合| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产麻豆成人av免费视频| 日本熟妇午夜| 丰满乱子伦码专区| 国产 一区 欧美 日韩| 午夜福利高清视频| 欧美日韩乱码在线| 黄色欧美视频在线观看| 久久精品国产自在天天线| 日本欧美国产在线视频| 黄色一级大片看看| a级毛片a级免费在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 最好的美女福利视频网| 麻豆成人午夜福利视频| 在线观看66精品国产| 国产一区二区激情短视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩人妻高清精品专区| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久这里有精品视频免费| 久久精品91蜜桃| 色哟哟·www| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 黄色欧美视频在线观看| 美女大奶头视频| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲色图av天堂| 国产成年人精品一区二区| 桃色一区二区三区在线观看| 两个人的视频大全免费| 久久午夜福利片| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲自偷自拍三级| 直男gayav资源| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 在线观看66精品国产| 中文字幕熟女人妻在线| 天堂网av新在线| av免费观看日本| 欧美色视频一区免费| 欧美激情国产日韩精品一区| 色哟哟·www| 久久精品国产亚洲av天美| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产成人91sexporn| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美又色又爽又黄视频| av女优亚洲男人天堂| 99久久九九国产精品国产免费| 床上黄色一级片| 亚洲国产精品久久男人天堂| av免费观看日本| 国产精品一区www在线观看| 婷婷亚洲欧美| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 嘟嘟电影网在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲av第一区精品v没综合| 联通29元200g的流量卡| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲七黄色美女视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产精品精品国产色婷婷| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品福利在线免费观看| 丝袜美腿在线中文| 国产69精品久久久久777片| 人人妻人人看人人澡| 黄片wwwwww| 欧美日韩乱码在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品国产清高在天天线| 男女视频在线观看网站免费| 中出人妻视频一区二区| 亚洲,欧美,日韩| 国产一区二区三区av在线 | 日韩国内少妇激情av| 久久这里只有精品中国| 男插女下体视频免费在线播放| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美一区二区精品小视频在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日本黄色片子视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 热99在线观看视频| 99久久精品国产国产毛片| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲真实伦在线观看| 国内精品宾馆在线| 91久久精品电影网| 麻豆国产97在线/欧美| 99热全是精品| 久久久久国产网址| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲国产欧美人成| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲美女视频黄频| 男人的好看免费观看在线视频| 国产精品电影一区二区三区| 欧美又色又爽又黄视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产乱人偷精品视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 精品久久国产蜜桃| 成人二区视频| 亚洲电影在线观看av| 欧美日韩乱码在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 嫩草影院精品99| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲综合色惰| 99久久人妻综合| av国产免费在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 两个人的视频大全免费| 麻豆成人午夜福利视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 2022亚洲国产成人精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色哟哟哟哟哟哟| 一本久久中文字幕| 亚洲国产高清在线一区二区三| 性插视频无遮挡在线免费观看| 搞女人的毛片| 日韩强制内射视频| 午夜视频国产福利| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久国产成人精品二区| 波多野结衣高清无吗| 亚洲国产精品成人久久小说 | 色视频www国产| 此物有八面人人有两片| 国产中年淑女户外野战色| 人妻夜夜爽99麻豆av| 男插女下体视频免费在线播放| 在线观看66精品国产| 一个人观看的视频www高清免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 国产免费男女视频| 欧美日韩乱码在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲精品456在线播放app| 最好的美女福利视频网| 国产日本99.免费观看| 日韩av不卡免费在线播放| 一本一本综合久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 老司机影院成人| 亚洲中文字幕日韩| 午夜福利视频1000在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精华一区二区三区| 色哟哟哟哟哟哟| 一本一本综合久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产老妇伦熟女老妇高清| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产成人影院久久av| 欧美区成人在线视频| 美女内射精品一级片tv| 在线a可以看的网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 一本久久中文字幕| av在线蜜桃| 在现免费观看毛片| 日韩欧美 国产精品| 春色校园在线视频观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美zozozo另类| 久久久久久久久久成人| а√天堂www在线а√下载| 国产成人freesex在线| 欧美日韩乱码在线| 国产精品国产高清国产av| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av二区三区四区| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲欧美精品自产自拍| 可以在线观看的亚洲视频| 身体一侧抽搐| 午夜爱爱视频在线播放| 国产极品天堂在线| 美女高潮的动态| 黄片无遮挡物在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久精品国产自在天天线| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99热只有精品国产| 99久久精品一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文资源天堂在线| 欧美zozozo另类| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲电影在线观看av| 好男人在线观看高清免费视频| 男的添女的下面高潮视频| 午夜激情欧美在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 麻豆av噜噜一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲av.av天堂| 国产成人a区在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 禁无遮挡网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 成人鲁丝片一二三区免费| www日本黄色视频网| 亚洲不卡免费看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 真实男女啪啪啪动态图| 国国产精品蜜臀av免费| 麻豆成人av视频| 亚洲七黄色美女视频| 一个人看的www免费观看视频| 日韩欧美精品免费久久| 成人毛片60女人毛片免费| 最近的中文字幕免费完整| 久久99精品国语久久久| 亚洲欧美精品综合久久99| 最新中文字幕久久久久| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品,欧美在线| 精品久久久噜噜| 成年女人永久免费观看视频| 国产免费男女视频| 激情 狠狠 欧美| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 日本欧美国产在线视频| www日本黄色视频网| 在线观看午夜福利视频| 亚洲最大成人中文| 听说在线观看完整版免费高清| 国产熟女欧美一区二区| 69av精品久久久久久| 欧美人与善性xxx| 乱人视频在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品永久免费网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久99精品国语久久久| 少妇熟女欧美另类| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久色成人| 在线天堂最新版资源| 成人无遮挡网站| 国产精品一区二区在线观看99 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 18禁在线播放成人免费| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美性猛交黑人性爽| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产私拍福利视频在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 99热精品在线国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 51国产日韩欧美| 深夜a级毛片| 级片在线观看| 九九热线精品视视频播放| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 色综合站精品国产| 成年版毛片免费区| 成人av在线播放网站| 国产真实伦视频高清在线观看| 日本在线视频免费播放| 国产精品三级大全| 九草在线视频观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久99蜜桃精品久久| 成年av动漫网址| 国产成年人精品一区二区| kizo精华| 中国美女看黄片| 日韩欧美 国产精品| 成人二区视频| 99热只有精品国产| av在线亚洲专区| 在线观看午夜福利视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产久久久一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美日韩国产亚洲二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久精品人妻少妇| 免费黄网站久久成人精品| 国产男人的电影天堂91| 欧美人与善性xxx| 国产成人影院久久av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久久久久国产a免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 久久久色成人| 亚洲精品成人久久久久久| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品女同一区二区软件| 99视频精品全部免费 在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产一区二区在线观看日韩| 99精品在免费线老司机午夜| 69人妻影院| 亚洲一区二区三区色噜噜| 99热这里只有是精品在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 可以在线观看毛片的网站| 一夜夜www| 亚洲第一区二区三区不卡| 女人被狂操c到高潮| 99热只有精品国产| 内射极品少妇av片p| 久久久久九九精品影院| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲天堂国产精品一区在线| 乱人视频在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 美女高潮的动态| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 日韩 亚洲 欧美在线| 成人国产麻豆网| 欧美潮喷喷水| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美精品一区二区大全| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久久久国产a免费观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲人成网站在线播| 少妇的逼好多水| 国产精品国产高清国产av| 久99久视频精品免费| 亚洲美女视频黄频| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日本一本二区三区精品| а√天堂www在线а√下载| 1000部很黄的大片| 国产精品久久电影中文字幕| a级毛片免费高清观看在线播放| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲成a人片在线一区二区| 在线免费观看的www视频| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产在线男女| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 欧美性猛交黑人性爽| 国产高清不卡午夜福利| 人妻系列 视频| 日韩欧美三级三区| 久久久久国产网址| 最近的中文字幕免费完整| 免费av毛片视频| 成人永久免费在线观看视频| 99在线视频只有这里精品首页| 26uuu在线亚洲综合色| 午夜视频国产福利| 一本久久精品| 国产真实伦视频高清在线观看| 免费观看精品视频网站| 欧美成人a在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 十八禁国产超污无遮挡网站| av在线播放精品| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 乱码一卡2卡4卡精品| 青青草视频在线视频观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久精品91蜜桃| 中文字幕制服av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 中出人妻视频一区二区| 丰满乱子伦码专区| 久久精品91蜜桃| 精品久久久久久成人av| 黄色视频,在线免费观看| 精品熟女少妇av免费看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 综合色av麻豆| 久久精品91蜜桃| 99热这里只有精品一区| 日韩强制内射视频| 色哟哟哟哟哟哟| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费观看人在逋| 在线观看av片永久免费下载| 午夜久久久久精精品| 综合色丁香网| 日韩av不卡免费在线播放| 日本一本二区三区精品| 久久韩国三级中文字幕| 村上凉子中文字幕在线| 丝袜喷水一区|