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    長鏈非編碼RNA DLX6-AS1調控喉癌細胞的機制研究

    2023-06-09 02:35:36穆妮熱賈帕爾阿依恒曲庫爾汗皮力東庫亞西穆扎排爾米爾扎克木新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科新疆烏魯木齊830000
    局解手術學雜志 2023年6期
    關鍵詞:喉癌熒光素酶極化

    穆妮熱·賈帕爾,阿依恒·曲庫爾汗,雍 軍,皮力東·庫亞西,穆扎排爾·米爾扎克木 (新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科,新疆 烏魯木齊 830000)

    喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤,飲酒和吸煙是喉癌的主要誘因,研究發(fā)現(xiàn)在過去30年里,早期喉癌患者主要通過手術及放化療手段進行治療,但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時為中晚期,治療效果不佳,導致患者的生存率有所下降[1-2]。因此,找到喉癌靶向治療的有效標志物至關重要。有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤樣本被大量的炎癥細胞浸潤,如I型輔助性T淋巴細胞、調節(jié)性T細胞和腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)[3]。TAMs是腫瘤微環(huán)境中至關重要的免疫細胞,與腫瘤不良預后相關,根據巨噬細胞的激活狀態(tài)可分為M1表型和M2表型。一般情況下,M1極化的巨噬細胞能夠分泌促炎細胞因子來消滅腫瘤細胞,以白細胞介素10(interleukin 10,IL-10)和精氨酸酶1(arginase 1,Arg-1)為主要標記物,參與血管生成和腫瘤進展[4]。TAMs主要屬于M2極化的巨噬細胞,可促進腫瘤生長、侵襲和轉移[5-6],在腫瘤進展中起重要作用,但其在喉癌發(fā)展中的分子機制尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)與多種病理過程密切相關,特別是腫瘤發(fā)生[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA DLX6-AS1作為一種新型的lncRNA參與了肺癌、胃癌、膀胱癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展[8-10],然而lncRNA DLX6-AS1對喉癌發(fā)展的影響及其作用機制尚不明確,因此本研究深入探討了lncRNA DLX6-AS1在喉癌細胞發(fā)展中的生物學功能。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器與試劑

    人喉表皮樣癌細胞Hep-2購自中國科學院上海細胞庫。qRT-PCR儀器購自西安天隆生物科技有限公司,酶標儀購自美國賽默飛世爾科技有限公司,細胞培養(yǎng)箱購自上海航佩儀器有限公司。Transwell Insert小室(膜孔徑為0.4 μm)購自美國Corning公司,lncRNA DLX6-AS1干擾質粒(si-lncRNA DLX6-AS1)及其陰性對照(si-NC)、lncRNA DLX6-AS1過表達質粒(pcDNA-lncRNA DLX6-AS1)及其過表達對照[pcDNA-3.1(+)]、miR-144抑制劑(miR-144 inhibitor)和miR-144模擬物(miR-144 mimics)購自上海吉瑪基因有限公司,CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司,RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和Taq-Man microRNA購自杭州沃森生物技術有限公司,CD163、E-cadherin和N-cadherin抗體購自英國Abcam公司,LipofectamineTM2000購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

    1.2 人外周血單核細胞(peripheral blood mono?nuclear cells,PBMCs)和TAMs的分離

    本研究經我院醫(yī)學倫理委員會批準(K202104-05)。采集健康志愿者新鮮外周血,使用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)密度梯度離心法分離PBMCs,將稀釋的全血加入分離層的上層,離心后吸出囊泡細胞,PBS沖洗,沉淀重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1.5 h,收集貼壁細胞。將新鮮的腫瘤組織用膠原酶消化得到單細胞懸液,抗CD11b磁珠孵育。使用MACS-LS色譜柱分離CD11b陽性細胞。細胞培養(yǎng)1 h,采用流式細胞術檢測CD11b陽性的TAMs。

    1.3 細胞培養(yǎng)和細胞轉染

    人喉表皮樣癌細胞Hep-2在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2的濕室中。將人單核細胞白血病細胞THP-1置于含10%胎牛血清、10 000 U/mL青霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 000 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將THP-1細胞與100 ng/mL佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)孵育48 h,誘導THP-1向巨噬細胞分化后,用白細胞介素4(interleu?kin 4,IL-4)20 ng/mL繼續(xù)誘導THP-1細胞,使其分化為M2型巨噬細胞。共培養(yǎng)實驗中,THP-1細胞(M2型巨噬細胞)接種于Transwell Insert小室中,Hep-2細胞在底孔中培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞分為Control組(THP-1與Hep-2細胞共培養(yǎng),Hep-2細胞不作任何處理)和IL-4組(20 ng/mL IL-4作用于THP-1細胞,THP-1與Hep-2細胞共培養(yǎng))。為了檢測下調lncRNA DLX6-AS1對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響,將IL-4組細胞分為IL-4+si-NC組(Hep-2細胞轉染4 μg si-NC質粒)與IL-4+si-DLX6-AS1組(Hep-2細胞轉染4 μg si-DLX6-AS1質粒)。為了檢測lncRNA DLX6-AS1與miR-144的關系,將Control組細胞分為DLX6-AS1 WT+mimics NC組(Hep-2細胞轉染4 μg lncRNA DLX6-AS1 WT+mimics NC質粒)、DLX6-AS1 WT+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg DLX6-AS1 WT+miR-144 mimics質粒)、DLX6-AS1 MUT+mimics NC組(Hep-2細胞轉染4 μg DLX6-AS1 MUT+mimics NC質粒)、DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics質粒)。為了檢測上調lncRNA DLX6-AS1通過miR-144對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響,將IL-4組細胞分為pcDNA-3.1(+)+mimics NC組[Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-3.1(+)+mimics NC質粒]、pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC組(Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC質粒)、pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics質粒)、pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics質粒)。為了檢測上調miR-144對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響,將IL-4組細胞分為IL-4+mimics NC組(Hep-2細胞轉染4 μg mim?ics NC質粒)、IL-4+miR-144 mimics組(Hep-2細胞轉染4 μg miR-144 mimics質粒)。用LipofectamineTM2000將質粒共轉染到細胞中。

    1.4 qRT-PCR檢測lncRNA DLX6-AS1、miR-144、IL-10和Arg-1的表達

    分離總RNA,逆轉錄酶反應合成cDNA。采用TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和Taq-Man microRNA進行qRT-PCR。以U6或GAPDH分別作為內源對照,采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.5 Western blot檢測CD163、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達

    提取的40 μg蛋白經SDS-PAGE轉移到硝酸纖維素膜上,用5%脫脂乳阻斷,與抗CD163(1∶1 000)、E-cadherin(1∶5 000)、N-cadherin(1∶6 000)和GAPDH(1∶4 000)的一抗于4 ℃孵育12 h,用二抗室溫孵育2 h,對免疫復合物進行可視化檢測。

    1.6 CCK-8實驗檢測Hep-2細胞增殖活力

    與THP-1細胞(M2型巨噬細胞)共培養(yǎng)48 h后,收集Hep-2細胞,接種于96孔板。在每孔中加入100 μL CCK-8,置于細胞培養(yǎng)箱孵育4 h,按說明書測定細胞增殖活力。

    1.7 Transwell實驗檢測Hep-2細胞侵襲數(shù)目

    在Transwell上腔室中添加200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)Hep-2細胞(4×104細胞)。將含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入下腔,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h,對侵襲的細胞進行固定和結晶紫染色,隨機選取6個區(qū)域計數(shù)侵襲的細胞。

    1.8 雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定熒光素酶活性

    使用在線軟件miRcode進行生物信息學分析,預測lncRNA DLX6-AS1與靶基因miR-144的結合位點。Hep-2細胞置于24孔板過夜。用LipofectamineTM2000分別將DLX6-AS1 WT+mimics NC、DLX6-AS1 WT+miR-144 mimics、DLX6-AS1 MUT+mimics NC和DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics質粒共轉染至Hep-2細胞,48 h后檢測熒光素酶活性。

    1.9 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據采用SPSS 17.0軟件進行分析,結果以3次重復獨立實驗的均數(shù)±標準差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 lncRNA DLX6-AS1與miR-144在PBMCs與TAMs中的表達

    與PBMCs相比,TAMs中IL-10和Arg-1的mRNA表達明顯升高(P<0.01),見圖1a。與PBMCs相比,TAMs中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1表達顯著升高(P<0.01),miR-144表達顯著降低(P<0.01),見圖1b。

    圖1 qRT-PCR檢測PBMCs和TAMs中IL-10、Arg-1、lncRNA DLX6-AS1和miR-144的表達

    2.2 下調lncRNA DLX6-AS1抑制IL-4誘導的巨噬細胞M2極化

    qRT-PCR結果顯示,與Control組相比,IL-4組THP-1巨噬細胞的lncRNA DLX6-AS1 mRNA表達顯著上調(P<0.01);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組THP-1巨噬細胞的lncRNA DLX6-AS1 mRNA表達顯著下調(P<0.01),見圖2a。與Control組相比,IL-4組THP-1巨噬細胞IL-10和Arg-1的mRNA表達顯著上調(P<0.01);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組THP-1巨噬細胞IL-10和Arg-1的mRNA表達則顯著下調(P<0.01),見圖2b、c。在THP-1巨噬細胞中,與Control組相比,IL-4組M2巨噬細胞標志物CD163蛋白的表達顯著增加(P<0.01);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組CD163蛋白的表達顯著降低(P<0.01),見圖2d、e。

    圖2 下調lncRNA DLX6-AS1抑制IL-4誘導的巨噬細胞M2極化

    2.3 下調lncRNA DLX6-AS1抑制巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

    CCK-8實驗結果顯示,與Control組相比,IL-4組Hep-2細胞活力顯著增加(P<0.05);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組Hep-2細胞活力顯著下降(P<0.05),說明巨噬細胞M2極化促進了Hep-2細胞增殖,見圖3a。與Control組相比,IL-4組Hep-2細胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01),N-cadherin表達顯著上調(P<0.01),E-cadherin表達顯著下調(P<0.01);與IL-4+si-NC組相比,IL-4+si-DLX6-AS1組Hep-2細胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01),N-cadherin表達顯著下調(P<0.01),E-cadherin表達顯著上調(P<0.01),見圖3b~e。

    圖3 下調lncRNA DLX6-AS1抑制巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

    2.4 lncRNA DLX6-AS1可與miR-144相互作用

    使用在線軟件miRcode進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn),lncRNA DLX6-AS1與miR-144之間存在潛在的結合位點(圖4a)。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測顯示,lncRNA DLX6-AS1與miR-144之間存在直接相互作用,與DLX6-AS1 WT+mimics NC組相比,DLX6-AS1-WT+miR-144 mimics組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),與 DLX6-AS1 MUT+mimics NC組相比,DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics組熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05),圖4b。

    圖4 lncRNA DLX6-AS1與miR-144的靶點預測和相互關系分析

    2.5 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進巨噬細胞M2極化

    qRT-PCR結果顯示,與Control組相比,IL-4組THP-1巨噬細胞中的miR-144表達水平降低(P<0.01),與IL-4+mimics NC組相比,IL-4+miR-144 mimics組THP-1巨噬細胞中的miR-144 mRNA表達水平顯著上調(P<0.01),見圖5a。IL-4處理THP-1巨噬細胞后,與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC組細胞內IL-10和Arg-1的mRNA表達以及CD163蛋白表達顯著上調(P<0.01);與pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組相比,pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics組細胞內L-10和Arg-1的mRNA表達以及CD163蛋白表達顯著上調(P<0.01),見圖5b~e。

    圖5 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進巨噬細胞M2極化

    2.6 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

    IL-4處理THP-1巨噬細胞后,與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC組Hep-2細胞活力及細胞侵襲數(shù)目顯著增加(P<0.01),N-cadherin表達顯著上調(P<0.01),E-cadherin表達顯著下調(P<0.01);與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組Hep-2細胞活力顯著下降(P<0.01),細胞侵襲數(shù)目顯著減少(P<0.01),N-cadherin表達顯著下調(P<0.01),E-cadherin表達顯著上調(P<0.01);與pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組相比,pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics組Hep-2細胞活力及細胞侵襲數(shù)目顯著增加(P<0.01),N-cadherin表達顯著上調(P<0.01),E-cadherin表達顯著下調(P<0.01),見圖6。

    圖6 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

    3 討論

    有研究表明,在前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥中,巨噬細胞極化均與預后不良具有很強的相關性[11-13]。TAMs參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和腫瘤血管生成。李旭等[12]報道TAMs可通過促進MCF-7細胞發(fā)生上皮間質轉化進而促進乳腺癌的浸潤轉移。由于TAMs主要為M2表型,有研究表明,來自單核細胞的M2型巨噬細胞比M1型巨噬細胞更能促進腫瘤的生長和侵襲[13]。M2型巨噬細胞可明顯減少依托泊苷誘導的癌細胞凋亡,而與M1型巨噬細胞共培養(yǎng)的THP-1細胞凋亡顯著增加[14]。有研究發(fā)現(xiàn),M2型巨噬細胞依賴于M2型巨噬細胞來源的外泌體調節(jié)結直腸癌細胞遷移和侵襲;同時,M2型巨噬細胞來源的外泌體還可促進結腸癌細胞的遷移和侵襲[15]。因此,本研究深入探討了M2型巨噬細胞在喉癌細胞發(fā)展過程中的生物學功能,結果發(fā)現(xiàn),THP-1巨噬細胞衍生的M2型巨噬細胞進一步促進了Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化。

    lncRNA通過調節(jié)人單核細胞/巨噬細胞的分化和極化,在多種病理過程中發(fā)揮調節(jié)作用。Zeng等[16]研究發(fā)現(xiàn),M2型腫瘤相關巨噬細胞分泌的表皮生長因子通過激活EGFR-ERK信號通路和抑制lncRNA LIMT表達促進上皮性卵巢癌轉移。M2型巨噬細胞來源的外泌體lncRNA AFAP1-AS1和microRNA-26a會影響食管癌細胞的遷移和轉移[17]。此外,lncRNA可能通過調節(jié)單核細胞/巨噬細胞極化而發(fā)揮致癌或抑癌的作用。lncRNA COX-2可通過改變M1/M2巨噬細胞極化來阻止肝癌的免疫逃逸和轉移[18]。lncRNA LINC00662可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進M2型巨噬細胞極化和肝癌進展[19]。然而,目前關于lncRNA對喉癌進展中巨噬細胞極化的作用和機制的研究還很有限。本研究首先用qRT-PCR實驗檢測了lncRNA DLX6-AS1在PBMCs與TAMs中的差異表達,結果發(fā)現(xiàn)與PBMCs相比,TAMs中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1表達顯著升高。隨后我們使用干擾技術下調了lncRNA DLX6-AS1的表達,進一步分析了lncRNA DLX6-AS1的作用機制,結果表明下調lncRNA DLX6-AS1表達可抑制IL-4誘導的THP-1巨噬細胞M2極化。本研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞進一步促進了Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化,而下調lncRNA DLX6-AS1表達對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響尚不明了,因此我們繼續(xù)探討了下調lncRNA DLX6-AS1表達后的影響,結果提示lncRNA DLX6-AS1表達降低可通過抑制巨噬細胞M2極化抑制Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化。本研究結果初步揭示了lncRNA DLX6-AS1對喉癌Hep-2細胞惡性發(fā)展的影響及其作用機制,提示lncRNA DLX6-AS1在喉癌發(fā)展過程中發(fā)揮了明顯的促癌作用。

    在后續(xù)的研究中我們發(fā)現(xiàn)lncRNA DLX6-AS1可以與miR-144相互作用。miR-144已在多項研究中被證實參與了調控巨噬細胞極化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如miR-144可通過減輕M1型巨噬細胞相關炎癥來阻止實驗性腹主動脈瘤的形成[20];miR-144可通過調控PBX3抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲[21];此外,miR-144可通過下調激活增強因子結合蛋白4抑制胃癌細胞增殖和侵襲[22]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-144在喉癌患者分離出的TAMs中表達上調,且過表達lncRNA DLX6-AS1可通過miR-144促進IL-4誘導的THP-1巨噬細胞M2極化,并增強Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化能力,這表明miR-144在lncRNA DLX6-AS1調節(jié)M2極化和Hep-2細胞增殖、侵襲及上皮間質轉化過程中扮演了非常重要的角色。

    綜上所述,lncRNA DLX6-AS1可通過調控miR-144表達來促進M2型巨噬細胞的激活,而M2型巨噬細胞激活后可促進Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化。這些結果表明,lncRNA DLX6-AS1通過誘導喉癌巨噬細胞M2極化,在喉癌細胞發(fā)展進程中發(fā)揮了重要作用。

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