呂紅娟,張璇,李立恒,孟媛媛,趙亭亭 (河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科,河北 張家口 075000)
口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是來源于上皮組織的惡性腫瘤,其生長速度緩慢,可發(fā)生于口腔不同部位,部分患者會出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的潰瘍和腫塊,伴有感染及疼痛等并發(fā)癥[1-2]。由于部分患者身體狀況差不能耐受手術(shù),或經(jīng)濟(jì)條件不允許使用比較先進(jìn)的治療手段,因此,建立相應(yīng)的體外模型,篩選有效的治療藥物具有重要臨床意義[3-5]。大豆苷元來源于豆科植物的種子,其主要成分為大豆異黃酮類,是一種已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床各類疾病治療的藥物成分[6-7]。有研究顯示,大豆苷元具有良好的心血管保護(hù)作用和抗腫瘤活性,已在前列腺癌、乳腺癌治療等方面取得了較好療效,其抗腫瘤作用已得到臨床認(rèn)可,為臨床腫瘤治療提供了新的研究方向[8-10]。因此,大豆苷元作為治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的潛在藥物,有望為無法進(jìn)行手術(shù)的患者帶來新的希望,但目前有關(guān)大豆苷元抗口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究報(bào)道較少,其發(fā)揮抗口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用機(jī)制也尚未闡明。因此,本研究分析了大豆苷元抗口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用機(jī)制,旨在為臨床綜合治療提供新的方向,現(xiàn)報(bào)告如下。
CO2培養(yǎng)箱、全自動酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司;人口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27和Tca8113細(xì)胞均購自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司;大豆苷元購自上海韻泰信息科技有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS購自武漢益普生物科技有限公司;CCK-8檢測試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司;MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司;小鼠抗β-actin單克隆抗體、MMP12單克隆抗體均購自英國Abcam公司。SPF級BALC/c裸鼠18只,雌雄各半,5~7周齡,體質(zhì)量約20 g,由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供,許可證號:生產(chǎn)許可SCXK(冀)2018-004。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析大豆苷元靶點(diǎn)及其與口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床表型的相關(guān)性。利用SwissTarget(取Top18)和TargetNet(取pro>0)預(yù)測大豆苷元的靶點(diǎn),二者取并集,得到115個(gè)大豆苷元靶點(diǎn)。利用GEO2R分析口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE138206和GSE74530中具有表達(dá)差異的基因(logFC≥1,P<0.05),三者取交集,選擇表達(dá)水平最高的基因進(jìn)一步研究。
下載TCGA_HNSC數(shù)據(jù),對口腔鱗狀細(xì)胞癌的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以MMP12表達(dá)水平中位數(shù)進(jìn)行分組,將口腔鱗狀細(xì)胞癌患者分為MMP12高表達(dá)組和MMP12低表達(dá)組,進(jìn)行GSEA分析,以探討MMP12表達(dá)與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的關(guān)系。
采用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CAL-27和Tca8113細(xì)胞,培養(yǎng)條件:37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2,隔天換液。取一部分培養(yǎng)的CAL-27和Tca8113細(xì)胞,分別加入不同濃度的大豆苷元(CAL-27細(xì)胞中大豆苷元濃度為0~200 μmol/L,濃度梯度為50 μmol/L;Tca8113細(xì)胞中大豆苷元濃度為0~240 μmol/L,濃度梯度為60 μmol/L),置于37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察不同濃度大豆苷元對CAL-27和Tca8113細(xì)胞生長的影響。隨后,將CAL-27和Tca8113細(xì)胞分為對照組(CAL-27和Tca8113細(xì)胞均予以等量生理鹽水)、大豆苷元組(CAL-27細(xì)胞中添加大豆苷元150 μmol/L,Tca8113細(xì)胞中添加大豆苷元180 μmol/L)以及大豆苷元+MMP12組(MMP12過表達(dá)CAL-27細(xì)胞中添加大豆苷元150 μmol/L,MMP12過表達(dá)Tca8113細(xì)胞中添加大豆苷元180 μmol/L)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將攜帶MMP12編碼序列的CAL-27質(zhì)粒、Tca8113質(zhì)粒和空白質(zhì)粒通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染24 h,向細(xì)胞中加入10 μg/mL G418進(jìn)行篩選,以沒有轉(zhuǎn)染的MMP12細(xì)胞為參照,維持篩選2周,通過Western blot檢測驗(yàn)證過表達(dá)是否成功。取過表達(dá)成功的CAL-27和Tca8113細(xì)胞置于37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
取各組對數(shù)生長期的CAL-27和Tca8113細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液(2×104/mL),接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔加入100 μL,與相應(yīng)濃度的大豆苷元進(jìn)行孵育,置于37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,檢測450 nm波長處各孔的吸光度值。
取各組對數(shù)生長期的CAL-27和Tca8113細(xì)胞(2×103/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中,與相應(yīng)濃度的大豆苷元進(jìn)行孵育,于37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),每孔加入10 μL的CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,檢測450 nm波長處各孔的吸光度值。連續(xù)培養(yǎng)5 d后,繪制細(xì)胞增殖曲線。
將各組對數(shù)生長期CAL-27和Tca8113細(xì)胞(2×103/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中,與相應(yīng)濃度的大豆苷元進(jìn)行孵育,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待約90%單個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)達(dá)50個(gè)后,采用多聚甲醛(質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%)室溫固定10 min,1%結(jié)晶紫染色5 min,顯微鏡下觀察每孔內(nèi)細(xì)胞克隆數(shù)目,計(jì)算克隆細(xì)胞數(shù)。
收集各組CAL-27和Tca8113細(xì)胞,以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至5×105/mL,于上室(無Matrigel基質(zhì)膠)中添加100 μL,下室加入500 μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,24 h后以無菌棉簽去除多余細(xì)胞,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定15 min,0.1%結(jié)晶紫染色15 min,顯微鏡觀察并記錄遷移的細(xì)胞數(shù)。檢測細(xì)胞侵襲能力時(shí),采用100 μL Matrigel基質(zhì)膠與500 μL無血清培養(yǎng)基充分混合,吸取50 μL于上室恒溫37 ℃靜置4 h,其余步驟同上。
SPF條件下,裸鼠皮下注射人口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞株(8×106/mL)0.2 mL構(gòu)建人口腔鱗狀細(xì)胞癌裸鼠皮下移植瘤模型,移植瘤在接種60 d內(nèi)體積達(dá)800 mm3并進(jìn)行傳代視為建模成功。根據(jù)是否注射大豆苷元進(jìn)行分組,daidzein組(n=9)每隔1 d注射大豆苷元1次,每次100 mg/kg,control組(n=9)注射等量生理鹽水,接種后每隔2 d觀察移植瘤體積,共觀察14 d。然后處死全部裸鼠,小心剝離腫瘤并稱重。用卡尺測量瘤體長短徑,計(jì)算瘤體體積,瘤體體積=長×寬2/2。
取daidzein組和control組裸鼠移植瘤組織,常規(guī)固定,制作切片,采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物試劑盒檢測移植瘤組織中Ki67蛋白表達(dá)。對移植瘤組織進(jìn)行免疫組化染色,然后將載玻片沖洗、脫水,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)由黃色變?yōu)樽厣拿庖叻磻?yīng)細(xì)胞,每張切片觀察10個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)Ki67染色呈陽性的細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算陽性細(xì)胞率。陽性細(xì)胞率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。
收集各組細(xì)胞,棄培養(yǎng)液,采用細(xì)胞裂解液裂解,提取總蛋白,嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量,取50 ng蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,室溫封閉2 h,采用洗膜緩沖液洗膜并加MMP12一抗(1:1 000),4 ℃孵育過夜,洗膜加二抗(1:10 000),室溫孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光顯影,用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析對比條帶強(qiáng)弱,選用β-actin作為內(nèi)參。
采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,重復(fù)測量方差分析不同時(shí)間對照組、大豆苷元組和大豆苷元組+MMP12組細(xì)胞活性和MMP12表達(dá)間的差異;Mann-Whitney檢驗(yàn)比較daidzein組和control組克隆細(xì)胞數(shù)、Ki67蛋白表達(dá)的差異;采用單因素方差分析比較對照組、大豆苷元組和大豆苷元+MMP12組的MMP12表達(dá)水平、細(xì)胞活性、克隆細(xì)胞數(shù)、遷移和侵襲間的差異,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
GEO2R分析顯示,MMP12在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)(P<0.05),且MMP12表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。GSEA分析表明,與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的基因集均富集在MMP12高表達(dá)組,即MMP12可能促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖、遷移和侵襲,見圖1。
圖1 MMP12與口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系
MTT實(shí)驗(yàn)顯示,大豆苷元濃度越高,CAL-27和Tca8113細(xì)胞存活率越低(P<0.05),當(dāng)CAL-27和Tca8113細(xì)胞中大豆苷元濃度分別為150 μmol/L和180 μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率降低至約50%。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著大豆苷元作用時(shí)間的延長,CAL-27和Tca8113的細(xì)胞活性較對照組明顯下降(P<0.05)??寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示,大豆苷元作用后,CAL-27和Tca8113克隆細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,大豆苷元組發(fā)生侵襲和遷移的CAL-27和Tca8113細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少(P<0.05),見圖2。
圖2 大豆苷元體外抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移
裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示,隨著時(shí)間延長,daidzein組和control組腫瘤體積均明顯增加(P<0.05),但daidzein組的腫瘤體積和質(zhì)量均明顯小于control組(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,daidzein組的移植瘤組織中Ki67蛋白表達(dá)水平明顯低于control組(P<0.05),見圖3。
圖3 大豆苷元體內(nèi)抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖
Western blot顯示,大豆苷元能夠抑制CAL-27和Tca8113細(xì)胞中MMP12的表達(dá),且隨著作用時(shí)間延長和濃度升高,該抑制作用會更明顯(P<0.05),見圖4。
圖4 大豆苷元抑制MMP12表達(dá)的濃度依賴和時(shí)間依賴
與對照組相比,大豆苷元組CAL-27和Tca8113細(xì)胞中MMP12蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞活性、克隆細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均明顯降低/減少(P<0.05);與大豆苷元組比較,大豆苷元+MMP12組中MMP12表達(dá)水平、細(xì)胞活性、克隆細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)明顯升高/增加(P<0.05),見圖5。
圖5 大豆苷元通過MMP12抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
口腔鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部惡性程度極高、危害性極大的腫瘤??谇击[狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展與患者生活方式密切相關(guān),并容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,對患者生活質(zhì)量甚至生命安全有巨大影響[11-13]。CAL-27和Tca8113細(xì)胞株傳代數(shù)較多且容易培養(yǎng),是基礎(chǔ)研究常用的細(xì)胞株,本研究以CAL-27和Tca8113細(xì)胞株為研究對象,分析大豆苷元抗口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用機(jī)制。
大豆苷元具有良好的抗腫瘤活性,可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡,提高機(jī)體免疫力[14]。為了闡明大豆苷元的可能作用機(jī)制,本研究通過數(shù)據(jù)庫對大豆苷元的可能作用靶點(diǎn)進(jìn)行初步分析,結(jié)果顯示MMP12為大豆苷元靶點(diǎn)之一,并且其表達(dá)水平與口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān),提示大豆苷元可能通過靶向MMP12抑制腫瘤的生長、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示,隨著大豆苷元濃度升高,作用時(shí)間延長,口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞存活率明顯降低,細(xì)胞克隆數(shù)、侵襲和遷移數(shù)也明顯減少,說明大豆苷元可以有效抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為,并且該抑制效果與大豆苷元的作用時(shí)間和濃度有關(guān)。研究表明,大豆苷元的抗腫瘤作用機(jī)制主要體現(xiàn)在抑制腫瘤增殖,其通過抑制血管增生并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長;同時(shí),大豆苷元可以激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ,從而抑制腫瘤細(xì)胞遷移[15-16]。本研究結(jié)果與上述研究基本一致,說明大豆苷元在抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲方面具有良好作用。
Ki67是一種與細(xì)胞增殖有關(guān)的蛋白,可反映腫瘤生長情況,其陽性表達(dá)率還可以用來判斷腫瘤的侵襲情況,陽性表達(dá)率越高說明腫瘤的惡性程度越強(qiáng)[17-18]。本研究中裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,daidzein組的移植瘤體積、質(zhì)量以及移植瘤組織中Ki67蛋白表達(dá)水平均明顯小/低于control組,說明大豆苷元干預(yù)后Ki67蛋白表達(dá)水平明顯下降,提示大豆苷元在抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性增殖方面具有一定作用,且這種作用并不僅局限于體外培養(yǎng)細(xì)胞,在動物實(shí)驗(yàn)中也初見成效,進(jìn)一步推動了大豆苷元的臨床應(yīng)用進(jìn)程。
MMP12主要由炎癥細(xì)胞主動分泌,具有分解細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁的作用,因而利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲,其在正常細(xì)胞中少量表達(dá)甚至不表達(dá),而在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[19]。本研究初步明確了大豆苷元對口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性增殖、遷移和侵襲等行為具有抑制作用后,進(jìn)一步探討了其對作用靶點(diǎn)MMP12的影響,結(jié)果顯示,隨著大豆苷元作用時(shí)間延長或濃度升高,口腔鱗狀細(xì)胞癌中MMP12的表達(dá)水平明顯下降,說明大豆苷元對MMP12的抑制作用具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性;當(dāng)MMP12過表達(dá)時(shí),大豆苷元的抗腫瘤活性被逆轉(zhuǎn),說明大豆苷元是通過作用于MMP12靶點(diǎn),下調(diào)MMP12表達(dá)水平,從而發(fā)揮對口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的抑制作用,提示臨床可以通過抑制MMP12表達(dá)發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。
綜上所述,大豆苷元可能通過靶向MMP12,下調(diào)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中MMP12的表達(dá)水平,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,阻止其轉(zhuǎn)移與侵襲,進(jìn)而發(fā)揮抗口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用。