基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念優(yōu)化都梁方滲漉提取工藝

李燕燕，周瑋玲，侯寓森，趙淋仙，徐純藝，馬 川，劉 兵，代文東，何 瑤*，胡慧玲*

1. 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

2. 四川全泰堂中藥飲片有限公司，四川 遂寧 629000

都梁方源于宋代王璆集民間驗(yàn)方所著《是齋百一選方》[1]，由白芷研末加煉蜜為丸而成。后人在此基礎(chǔ)上加入川芎作為臣藥，以4∶1 的質(zhì)量配比制成蜜丸劑（《北京市中藥成方選集》），能散風(fēng)止痛，主治感冒風(fēng)寒、頭痛眩暈、鼻塞不通、身熱倦怠[2]。方中白芷與川芎配伍，白芷善入頭部，祛風(fēng)散寒、通竅止痛，多用于眉棱骨痛，治陽明經(jīng)頭痛，為君藥；川芎乃血中之氣藥，能上行頭目，下行血海，活血行氣，為臣藥。二藥合用，共奏祛風(fēng)散寒、活血止痛之效，臨床上用于風(fēng)寒瘀血阻滯脈絡(luò)所致的頭痛，癥見頭脹痛或刺痛，痛有定處，反復(fù)發(fā)作，遇風(fēng)寒誘發(fā)或加重。研究表明，都梁方中白芷、川芎配伍在鎮(zhèn)痛、抗炎等方面具有良好的協(xié)同作用[3-4]，醇提部位是其發(fā)揮藥效的重要部位，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)包括白芷香豆素類成分、川芎苯酞類及有機(jī)酸類成分等[5-7]。都梁方作為經(jīng)典頭痛驗(yàn)方，研究人員對(duì)其進(jìn)行了不同的劑型改良研究，如都梁口服液[8]、都梁顆粒[9]等?！吨袊幍洹?020 年版收錄有都梁丸、都梁軟膠囊及都梁滴丸[10]。然而，現(xiàn)有的都梁方制劑提取工藝優(yōu)化往往以方中1 個(gè)或2 個(gè)成分為指標(biāo)，且溶劑用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度等參數(shù)范圍選擇不一[11-12]。都梁軟膠囊和都梁滴丸的提取工藝均采用了乙醇為提取溶媒，但乙醇的體積分?jǐn)?shù)不一，工藝參數(shù)不明確，且《中國藥典》2020 年版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定白芷歐前胡素和異歐前胡素為含量測(cè)定指標(biāo)成分，未對(duì)川芎有效成分做定量質(zhì)量檢測(cè)要求，其質(zhì)量控制和工藝研究有待加強(qiáng)。

中藥質(zhì)量是保證中藥功效穩(wěn)定性及應(yīng)用安全性的基礎(chǔ)，其規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化，是推動(dòng)中藥走向國際化的重要前提[13]。近年來國家高度重視中藥全過程質(zhì)量控制體系的建設(shè)，《國務(wù)院辦公廳關(guān)于全面加強(qiáng)藥品監(jiān)管能力建設(shè)的實(shí)施意見》《國家藥監(jiān)局關(guān)于促進(jìn)中藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的實(shí)施意見》等均明確提出要加強(qiáng)中藥全過程質(zhì)量控制，促進(jìn)中藥傳承創(chuàng)新發(fā)展。質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）是一種用于藥品研發(fā)生產(chǎn)的科學(xué)理念，注重于對(duì)源頭、過程的控制，將藥品質(zhì)量控制從成品檢驗(yàn)移至前期工藝設(shè)計(jì)、生產(chǎn)過程當(dāng)中，從設(shè)計(jì)層次保證藥品質(zhì)量。QbD 的核心在于建立設(shè)計(jì)空間，其本質(zhì)在于獲得一個(gè)參數(shù)操作和原料質(zhì)量波動(dòng)的優(yōu)化范圍，各因素在可接受的范圍內(nèi)變動(dòng)，均不會(huì)影響工藝所得產(chǎn)物的質(zhì)量穩(wěn)定性。在中藥制劑工藝環(huán)節(jié)中，提取工藝是中藥復(fù)方藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制領(lǐng)域的核心環(huán)節(jié)，優(yōu)化中藥復(fù)方提取工藝參數(shù)，是高效充分提取藥效物質(zhì)，保障臨床有效性的前提，也是影響中藥制劑質(zhì)量的關(guān)鍵因素[14]。因而，本實(shí)驗(yàn)在QbD 理念下明確關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameters，CPPs）和關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs），以白芷中歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯和川芎中阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A為指標(biāo)成分，采用Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化滲漉提取工藝，建立設(shè)計(jì)空間并進(jìn)行驗(yàn)證，以保證都梁方滲漉提取工藝的穩(wěn)定，為促進(jìn)都梁方制劑質(zhì)量控制水平提升及其改良型新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，8321033DAD 型檢測(cè)器，7120988 型四元泵，8738269型自動(dòng)進(jìn)樣器，6280773 型柱溫箱，美國Thermo Fisher 公司；PS-100A 型超聲清洗機(jī)，深圳潔康超聲波清洗器有限公司；SQP 型十萬分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UPK-I-10T 型優(yōu)普系列超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司；800A 型佰好佳多功能粉碎機(jī)，永康市紅太陽機(jī)電有限公司；DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；101-2B 型電熱恒溫干燥箱，尚誠儀器制造有限責(zé)任公司。

1.2 試藥

白芷飲片（批號(hào)21110103）購自四川翼方中藥飲片有限公司，執(zhí)行《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)；酒川芎飲片（批號(hào)210701）購自四川德仁堂中藥科技股份有限公司，執(zhí)行《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》2015 年版標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定專業(yè)劉薇副教授鑒定，白芷為傘形科當(dāng)歸屬植物杭白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook.f. var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan 的干燥根，川芎為傘形科藁本屬植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖。

對(duì)照品歐前胡素（批號(hào)21070702）、異歐前胡素（批號(hào)21091802）、佛手柑內(nèi)酯（批號(hào)21031001）、阿魏酸（批號(hào) 22032207）、Z-藁本內(nèi)酯（批號(hào)wkq20051709）、洋川芎內(nèi)酯A（批號(hào)22021701），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，購自成都普菲德對(duì)照品科技有限公司。色譜純冰乙酸（批號(hào)2021092701）、分析純乙醇（批號(hào)2022091501）購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；色譜純甲醇（批號(hào)WXBD8013V）購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 都梁方的提取工藝

稱取白芷粗粉40.0 g，川芎粗粉10.0 g，采用滲漉法提取。加適量一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，浸漬一定時(shí)間后，以適宜的速度滲漉，收集滲漉液，調(diào)整體積至500 mL（飲片量0.1 g/mL）。

2.2 CPPs 和CQAs 的確定

2.2.1 CPPs 的的篩選及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 都梁方采用滲漉法提取過程中主要受4 個(gè)方面的因素影響：環(huán)境、設(shè)備、飲片和提取條件，將以上4 個(gè)因素細(xì)化，繪制成魚骨圖，初步確定潛在關(guān)鍵工藝參數(shù)（potential critical process parameters，pCPPs），結(jié)果見圖1。采用失效模式及效應(yīng)分析（failure modes and effect analysis，F(xiàn)MEA），根據(jù)魚骨圖提供的pCPPs 進(jìn)行篩選，通過嚴(yán)重程度（S）、發(fā)生概率（O）和檢測(cè)難易程度（D）對(duì)工藝參數(shù)的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行量化，評(píng)分細(xì)則見表1。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研和前期研究基礎(chǔ)，對(duì)各工藝參數(shù)的S、O及D賦值并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先系數(shù)（risk priority number，RPN），RPN＝S×O×D。根據(jù)RPN 值高低確定CPPs，每個(gè)參數(shù)的RPN 值見表2，當(dāng)RPN 值大于10 時(shí)，認(rèn)定其為都梁方滲漉提取過程中的高風(fēng)險(xiǎn)因素，將被識(shí)別為CPPs。由FMEA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、滲漉體積流量、浸漬時(shí)間的RNP 值較大，因此，選定乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、滲漉體積流量、浸漬時(shí)間為影響都梁方滲漉提取工藝的CPPs。

圖1 都梁方提取工藝參數(shù)風(fēng)險(xiǎn)辨識(shí)魚骨圖Fig. 1 Fishbone diagram for risk identification of Duliang formula extraction process parameters

表1 都梁方滲漉提取工藝S、O 及D 的評(píng)分原則Table 1 Scoring principles of S, O and D in percolation extraction process of Duliang formula

表2 都梁方滲漉提取工藝FMEA 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果Table 2 FMEA risk assessment results of percolation extraction process in Duliang formula

2.2.2 CQAs 的確定 根據(jù)劉昌孝院士[15]提出的質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）概念，基于有效性、特有性、質(zhì)量傳遞與溯源、可測(cè)性和復(fù)方配伍的“五原則”，通過文獻(xiàn)研究預(yù)測(cè)歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 為都梁方的質(zhì)量標(biāo)志物[4,16-20]。同時(shí)，考慮中藥提取物的干膏率，最終將6 個(gè)成分的提取量（Y1～Y6）和干膏率作為都梁方提取工藝的CQAs。

2.3 都梁方中6 個(gè)CQAs 成分含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 對(duì)照品2.92、1.08、0.46、0.82、7.93、9.20 mg，加入甲醇定容到10 mL，溶解制成質(zhì)量濃度分別為292、108、46、82、793、920 μg/mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，混勻備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取白芷粗粉40.0 g、川芎粗粉10.0 g，加入一定量一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，以適宜的滲漉速度提取，收集滲漉液，調(diào)整體積至500 mL（飲片量0.1 g/mL），混勻，0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.3.3 陰性供試品溶液的制備 分別稱取缺白芷、川芎的粗粉，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備缺白芷和缺川芎陰性供試品溶液。

2.3.4 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相為甲醇-1%醋酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，35%～75%甲醇；8～23 min，75%甲醇；檢測(cè)波長為300 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1 mL/min。

2.3.5 專屬性試驗(yàn) 精密移取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液、“2.3.3”項(xiàng)下陰性供試品溶液各10 μL，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，供試品溶液中歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A分別與對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間對(duì)應(yīng)一致，各色譜峰均能較好分離（R＞1.5），陰性對(duì)照無明顯干擾，色譜圖見圖2。

圖2 6 種成分的混合對(duì)照品溶液 (A)、都梁方供試品溶液 (B)、缺白芷陰性樣品 (C)、缺川芎陰性樣品 (D) 的HPLC 圖Fig. 2 HPLC diagrams of six components mixed reference solution (A), Duliang formula sample solution (B), negative sample without Angelicae Dahuricae Radix (C) and negative sample without Chuanxiong Rhizoma (D)

2.3.6 線性關(guān)系考察 取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，用甲醇制得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定不同質(zhì)量濃度下歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 的色譜峰峰面積，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分別對(duì)歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程分別為歐前胡素Y＝453.58X－0.761 8，R2＝0.999 8；異歐前胡素Y＝458.36X－0.084 1，R2＝0.999 8；佛手柑內(nèi)酯Y＝539.26X－0.049 1，R2＝0.999 8；阿魏酸Y＝728.41X－0.453 9，R2＝0.999 9；Z-藁本內(nèi)酯Y＝200.75X＋0.082 1，R2＝0.999 7；洋川芎內(nèi)酯AY＝64.306X－0.764 3，R2＝0.999 5。結(jié)果表明，歐前胡素在18.250～292.000 μg/mL，異歐前胡素在6.750～108.000 μg/mL，佛手柑內(nèi)酯在 2.875 ～46.000 μg/mL，阿魏酸在5.125～82.000 μg/mL，Z-藁本內(nèi)酯在49.612～793.800 μg/mL，洋川芎內(nèi)酯A 在57.500～920.000 μg/mL 與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液1份，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別計(jì)算歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 的峰面積RSD 值為0.64%、0.74%、0.69%、0.48%、0.65%、0.63%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液1份，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件分別在制備后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 的峰面積RSD 值為1.06%、0.95%、1.11%、0.96%、1.09%、1.23%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 依據(jù)“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值為1.29%、1.60%、1.42%、1.59%、1.18%、1.17%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 依據(jù)“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，分別加入與供試品溶液中相應(yīng)成分含量約1∶1 的對(duì)照品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到供試品溶液中歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 的平均加樣回收率分別為102.09%、102.69%、101.20%、107.67%、105.69%、104.13%，RSD 分別為3.48%、4.06%、1.49%、1.79%、1.18%、1.60%，符合試驗(yàn)要求。

2.3.11 樣品測(cè)定 按照“2.3.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.3.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各指標(biāo)成分的含量（各指標(biāo)成分質(zhì)量/總投藥量）。

2.4 干膏率的測(cè)定

按干燥失重法進(jìn)行測(cè)定，精密量取都梁方滲漉液25 mL 于已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質(zhì)量，再于105 ℃干燥1 h，冷卻稱定質(zhì)量，反復(fù)干燥至恒定質(zhì)量（即±0.3 mg），計(jì)算干膏得率。

m為25 mL 提取液中干浸膏質(zhì)量，V為提取液總體積，M為總投藥量

2.5 CPPs 與CQAs 的相關(guān)性研究

2.5.1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 為探討都梁方醇提工藝中CPPs［乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、乙醇用量（B）、滲漉體積流量（C）、浸漬時(shí)間（D）］與CQAs［歐前胡素（Y1）、異歐前胡素（Y2）、佛手柑內(nèi)酯（Y3）、阿魏酸（Y4）、Z-藁本內(nèi)酯（Y5）、洋川芎內(nèi)酯A（Y6）含量和干膏率］的相關(guān)性，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)，Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值見表3。

表3 都梁方滲漉提取工藝Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken response surface experimental design and results of Duliang formula percolation extraction process

2.5.2 綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重的確立

（1）層次分析（analytic hierarchy process，AHP）法：AHP 是主觀確定權(quán)重的方法[21]?，F(xiàn)代研究表明，歐前胡素、異歐前胡素是君藥白芷中重要的香豆素類成分，具有鎮(zhèn)痛作用，是其關(guān)鍵藥效物質(zhì)；阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯是臣藥川芎發(fā)揮活血止痛的關(guān)鍵藥效成分。故根據(jù)都梁方藥味君臣配伍、各成分藥效作用的重要性以及各成分含量的多少，將這6 種指標(biāo)成分及干膏率作為權(quán)重指標(biāo)予以量化，即將7 項(xiàng)指標(biāo)分成7 個(gè)層次，并確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序：歐前胡素＝異歐前胡素＞佛手柑內(nèi)酯＞阿魏酸＝Z-藁本內(nèi)酯＞洋川芎內(nèi)酯A＝干膏率，以此構(gòu)成成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣，并獲得各項(xiàng)指標(biāo)的相對(duì)評(píng)分，指標(biāo)成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣見表4。根據(jù)表4 評(píng)分結(jié)果，AHP 法計(jì)算得到歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A含量及干膏率7 項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.304 5、0.304 5、0.152 2、0.076 1、0.076 1、0.052 8、0.038 1，一致性比例因子（CR＝CI/RI，其中，CR 為隨機(jī)一致性比率，CI 為一致性指標(biāo)，RI 為平均隨機(jī)一致性指標(biāo)）＝0.037/1.36＝0.027＜0.10，即指標(biāo)成對(duì)比較判斷矩陣具有滿意的一致性，權(quán)重系數(shù)有效[22]。

表4 AHP 法指標(biāo)成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣Table 4 Judgment priority matrix of AHP index comparison in pairs

（2）基于指標(biāo)相關(guān)性的權(quán)重確定方法（criteria importance through intercriteria correlation，CRITIC）法：中藥復(fù)方在提取過程中配伍的變化及成分間的相互作用致使各指標(biāo)性成分對(duì)復(fù)方總體提取效果的貢獻(xiàn)不同，主觀確定其權(quán)重系數(shù)有失偏頗。CRITIC法是一種以評(píng)價(jià)指標(biāo)間的對(duì)比強(qiáng)度及沖突性作為基礎(chǔ)綜合衡量的客觀賦權(quán)分析法，對(duì)比強(qiáng)度以標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表現(xiàn)，即標(biāo)準(zhǔn)差的大小表明在同一指標(biāo)內(nèi)，各方法取值差距的大?。欢髦笜?biāo)間的沖突性是以指標(biāo)之間的相關(guān)性為基礎(chǔ)。故CRITIC 法既考慮了指標(biāo)變異大小對(duì)權(quán)重的影響，又考慮了各指標(biāo)間的沖突性。采用CRITIC 法計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，首先需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，即評(píng)價(jià)指標(biāo)值＝(實(shí)測(cè)值－最小值)/(最大值－最小值)×100，用SPSS 在線統(tǒng)計(jì)軟件處理無量綱化數(shù)據(jù)，計(jì)算得到歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 含量及干膏率7 項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.127 8、0.212 9、0.090 0、0.130 6、0.213 5、0.097 4、0.127 9。

（3）AHP-CRITIC 混合加權(quán)法：根據(jù)都梁方功能主治及君臣佐使的分析，AHP 法量化了評(píng)價(jià)指標(biāo)兩兩間比較判斷的優(yōu)先信息，得到了以主觀信息為基礎(chǔ)的權(quán)重系數(shù)（ωAHP），基本體現(xiàn)了都梁方各指標(biāo)的主次順序及君臣佐使的順序；同時(shí)采用CRITIC法求得相應(yīng)指標(biāo)的客觀權(quán)重系數(shù)（ωCRITIC），這不僅考慮到了各樣本數(shù)據(jù)的變異性及指標(biāo)間的相關(guān)性對(duì)賦權(quán)的影響，而且避免了主觀賦權(quán)存在的偏頗。但評(píng)價(jià)權(quán)重既要注重客觀又要不失主觀，故而將二者結(jié)合起來，計(jì)算綜合權(quán)重系數(shù)（ω復(fù)合），即ω復(fù)合ij＝ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij，以期評(píng)價(jià)結(jié)果更加客觀、真實(shí)[23]。通過計(jì)算得歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A含量及干膏率7 項(xiàng)指標(biāo)的綜合權(quán)重系數(shù)分別為0.254 2、0.423 4、0.089 5、0.064 9、0.106 1、0.033 6、0.028 2。

（4）綜合評(píng)價(jià)結(jié)果的比較：分別采用經(jīng)AHP法、CRITIC 法及AHP-CRITIC 混合加權(quán)法分析得到的權(quán)重系數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分比較，結(jié)果見表5。通過相關(guān)系數(shù)分析，AHP 法與CRITIC 法之間的相關(guān)系數(shù)為0.933，AHP 法與AHP-CRITIC混合加權(quán)法的相關(guān)系數(shù)為0.997，CRITIC 法與AHPCRITIC 混合加權(quán)法之間的相關(guān)系數(shù)為0.921，三者相關(guān)性顯著（P＜0.05），說明3 種權(quán)重法得到的評(píng)分結(jié)果具有一致性。從權(quán)重系數(shù)分析，CRITIC 法與AHP 法的相關(guān)系數(shù)為0.289，相關(guān)性不顯著（P＝0.529＞0.05），說明二者所反映信息不具有疊加性。相比之下，AHP-CRITIC 混合加權(quán)法是從主觀和客觀2 個(gè)方面加以考慮，所體現(xiàn)的信息量也就更為全面[24]，所得綜合評(píng)分結(jié)果更為科學(xué)、合理、更接近實(shí)際情況，因此本研究采用AHP-CRITIC 法計(jì)算綜合評(píng)分。

表5 AHP、CRITIC、AHP-CRITIC 3 種賦權(quán)法的綜合評(píng)分結(jié)果Table 5 Comprehensive scoring results of AHP, CRITIC and AHP-CRITIC three weighting methods

2.5.3 CQAs 的回歸模型及方差分析結(jié)果 利用Design-Expert.V8.0.6 軟件對(duì)AHP-CRITIC 綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行2 次多元回歸擬合，得到4 個(gè)自變量的2次多元回歸模型，其回歸方程：綜合評(píng)分＝89.31＋6.93 A＋4.37 B－0.67 C－1.64 D－0.79 AB＋0.45 AC＋0.47 AD－0.75 BC－0.07 BD＋3.15 CD－7.89 A2－2.75 B2＋0.88 C2＋1.43 D2，回歸模型方差分析結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance results of Box-Behnken response surface experiment

根據(jù)方差分析結(jié)果，2 次多元模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.103 9＞0.05），說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用于表示各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。方程的擬合相關(guān)系數(shù)R2＝0.933 8，Radj2＝0.867 7，變異系數(shù)（CV）＝3.10%，表明模型擬合效果良好，因此，可用此模型進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。提取工藝考察的4 個(gè)因素中，乙醇體積分?jǐn)?shù)A（P＜0.000 1）和乙醇用量B（P＜0.000 1）為極顯著項(xiàng)，滲漉體積流量C（P＝0.399 8）以及浸漬時(shí)間D（P＝0.051 5）為不顯著項(xiàng)；二次項(xiàng)中，A2（P＜0.000 1）和B2（P＝0.019 7）為顯著項(xiàng)，C2（P＝0.412 6）和D2（P＝0.193 0）為不顯著項(xiàng)，表明所選因素與響應(yīng)值并非簡單的線性關(guān)系；交互項(xiàng)CD（P＝0.033 2）顯著，其交互作用不明顯。根據(jù)各因素F值大小，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響為A＞B＞D＞C。

通過軟件繪制各因素對(duì)都梁方滲漉提取工藝綜合評(píng)分影響的3D 響應(yīng)面圖，如圖3 所示。乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、乙醇用量（B）對(duì)都梁方滲漉提取工藝綜合評(píng)分影響較大，形成的3D 響應(yīng)面曲線圖較陡峭。從圖的顏色變化可以初步判定，變化趨勢(shì)增加，其顏色也呈加深趨勢(shì)，顏色越接近紅色表明綜合評(píng)分越高。運(yùn)用Design-Expert.V8.0.6 軟件優(yōu)化所得的都梁方滲漉提取最佳工藝的預(yù)測(cè)值為乙醇體積分?jǐn)?shù)51.48%，乙醇用量7.98 倍，滲漉體積流量為3.00 mL/min、浸漬時(shí)間為12.02 h，在此條件下歐前胡素為1.577 2 mg/g，異歐前胡素為0.568 9 mg/g，佛手柑內(nèi)酯為0.144 2 mg/g，阿魏酸為0.377 1 mg/g，Z-藁本內(nèi)酯為3.244 4 mg/g，洋川芎內(nèi)酯A 3.081 9 mg/g，干膏率為20.190 6%，綜合評(píng)分為97.728 9分。結(jié)合實(shí)際，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中所得提取工藝參數(shù)最優(yōu)值為乙醇體積分?jǐn)?shù)52%，乙醇用量8 倍，滲漉體積流量為3 mL/min、浸漬時(shí)間為12 h。

圖3 4 因素對(duì)綜合評(píng)分的響應(yīng)面圖Fig. 3 Response surface of four factors to comprehensive score

2.6 設(shè)計(jì)空間的建立

由于工業(yè)生產(chǎn)中最佳提取條件具有一定的局限性，故根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，設(shè)定綜合評(píng)分≥88 分為優(yōu)化目標(biāo)，建立設(shè)計(jì)空間，為工業(yè)生產(chǎn)確定提取條件范圍，以滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。由于根據(jù)模型建立的設(shè)計(jì)空間是一個(gè)動(dòng)態(tài)的設(shè)計(jì)空間，乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、滲漉體積流量、浸漬時(shí)間都是調(diào)節(jié)設(shè)計(jì)空間的因素，任一因素的改變都會(huì)造成設(shè)計(jì)空間范圍的波動(dòng)。故有必要協(xié)調(diào)4 個(gè)因素之間的關(guān)系以獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但是平面設(shè)計(jì)空間僅能體現(xiàn)2 個(gè)因素，故選擇滲漉體積流量、浸漬時(shí)間為固定因素，構(gòu)建影響顯著的乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑用量的設(shè)計(jì)空間。

結(jié)合實(shí)際，分別選擇滿足優(yōu)化目標(biāo)的滲漉體積流量4、3 mL/min 和浸漬時(shí)間12、24 h 為固定水平，建立都梁方提取工藝參數(shù)的設(shè)計(jì)空間。由于模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值存在一定差異，使設(shè)計(jì)空間的邊界具有不確定性，因此在定義設(shè)計(jì)空間參數(shù)時(shí)加入置信水平α＝0.05 的置信區(qū)間，對(duì)設(shè)計(jì)空間進(jìn)行優(yōu)化，通過Overlay plot 展示，黃色部分即為設(shè)計(jì)空間，結(jié)果見圖4。實(shí)際生產(chǎn)過程中，考慮到對(duì)滲漉液質(zhì)量進(jìn)行控制的難易程度以及適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，因此最終確定操作空間為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%～55%、乙醇用量為8～10 倍、滲漉體積流量為3～4 mL/min、浸漬時(shí)間為12～24 h。

圖4 都梁方提取工藝設(shè)計(jì)空間圖Fig. 4 Space diagram of extraction process design of Duliang formula

2.7 控制空間的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所建立模型的有效性以及設(shè)計(jì)空間的可靠性，隨機(jī)選取設(shè)計(jì)空間4 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，其中1～2 號(hào)在空間內(nèi)，3 號(hào)在置信區(qū)間，4 號(hào)在空間外，實(shí)驗(yàn)條件的選取見表7，驗(yàn)證結(jié)果見表8。結(jié)果顯示，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的偏差均小于5%，可見模型具有良好的預(yù)測(cè)能力；設(shè)計(jì)空間及置信區(qū)間內(nèi)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)綜合評(píng)分均達(dá)到要求，而設(shè)計(jì)空間外的點(diǎn)均不達(dá)要求，表明在設(shè)計(jì)空間內(nèi)操作能保證提取工藝的穩(wěn)定可靠。

表7 設(shè)計(jì)空間驗(yàn)證試驗(yàn)點(diǎn)的選取Table 7 Selection of verification test sites in design space

表8 設(shè)計(jì)空間驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of space verification test

3 討論

3.1 提取方法的選擇與確定

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心發(fā)布的《中藥復(fù)方制劑生產(chǎn)工藝研究指導(dǎo)原則（試行）》[25]中，明確指出中藥復(fù)方制劑生產(chǎn)工藝研究應(yīng)基于“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的理念以及體現(xiàn)復(fù)方整體質(zhì)量特性。目前，QbD 理念在中藥提取工藝優(yōu)化[26]、中藥制備及制劑優(yōu)化[27-28]、中藥分離純化[29]中研究較多，旨在提高工藝穩(wěn)健性和產(chǎn)品質(zhì)量可控性，故本研究采用QbD 理念優(yōu)化都梁方提取工藝。都梁方由白芷、川芎2 味組成，其中白芷主要藥效成分為香豆素、揮發(fā)油等[30]，川芎主要藥效成分為揮發(fā)油、有機(jī)酸、生物堿等[18]。白芷香豆素雖可溶于沸水，但其中歐前胡素和異歐前胡素受熱不穩(wěn)定，前者易發(fā)生Claisen 烯丙基重排，生成別歐前胡素，即使在真空中加熱也會(huì)如此[31]，故長時(shí)間較高溫度的提取不利于香豆素類成分的提取。滲漉法是一種動(dòng)態(tài)浸出方法，提取率高，一般在常溫下進(jìn)行，尤為適用于熱不穩(wěn)定成分的提取，在中藥生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。有學(xué)者認(rèn)為借鑒QbD 理念對(duì)滲漉工藝進(jìn)行優(yōu)化，是今后的發(fā)展趨勢(shì)[32]。因此，本研究采用乙醇滲漉法提取都梁方，能較好地保留其有效成分，充分發(fā)揮其臨床療效。

關(guān)于乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇，前期單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6 個(gè)指標(biāo)成分含量均在50%乙醇處出現(xiàn)極大值。在30%～90%乙醇時(shí)，阿魏酸提取量在50%乙醇處取得最優(yōu)水平，而后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高其含量逐漸降低；歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 這5 個(gè)成分含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)整體一致，在30%～50%乙醇時(shí)均隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而升高，在50%乙醇處取得較優(yōu)水平，而后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高其含量先降低后升高，在90%乙醇處的含量非常接近于50%乙醇水平。可能是以50%乙醇為提取溶媒時(shí)，提取液中成分豐富、各成分間產(chǎn)生“助溶”現(xiàn)象。故本研究以50%乙醇為0 水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

3.2 CQAs 的選擇及綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的賦權(quán)

本研究基于劉昌孝院士提出的中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）的有效性、特有性、質(zhì)量傳遞與溯源、可測(cè)性和復(fù)方配伍“五原則”，進(jìn)行CQAs 的篩選?！坝行А笔荙-Marker 的核心要素。研究表明，香豆素類成分是治療偏頭痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[16-17]，歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯為君藥白芷中香豆素類成分，具有鎮(zhèn)痛抗炎的作用，能明顯降低偏頭痛模型大鼠血和腦中一氧化氮水平。Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 為臣藥川芎中苯酚類成分，具有擴(kuò)血管、鎮(zhèn)痛等藥理作用[18]。阿魏酸也來源于臣藥川芎，具有抗凝血、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[19]。

從質(zhì)量傳遞與溯源的角度，血中的效應(yīng)成分是質(zhì)量傳遞體系的最終環(huán)節(jié)，也是中藥Q-Marker 確定的重要依據(jù)。有研究對(duì)都梁丸的入血成分進(jìn)行分析研究[20]，通過對(duì)照品鑒別出歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 等原型入血成分，表明這6 個(gè)成分都可入血，可作為都梁方質(zhì)量控制的重要參考。復(fù)方配伍方面，有研究發(fā)現(xiàn)川芎作為臣藥可以促進(jìn)君藥白芷中香豆素類化合物歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯等的吸收，同時(shí)減緩其在體內(nèi)的消除速率，提高其生物利用度[4]。最后，這6 個(gè)成分均具有可測(cè)性。因而選擇這6 個(gè)成分作為Q-Marker 進(jìn)行含量控制。

在加權(quán)評(píng)分方面，歐前胡素、異歐前胡素為都梁滴丸和都梁軟膠囊在《中國藥典》2020 年版的含量測(cè)定指標(biāo)成分，且都梁方滲漉液中佛手柑內(nèi)酯含量低于歐前胡素、異歐前胡素，故AHP 法賦權(quán)時(shí)君藥白芷中3 個(gè)指標(biāo)成分的優(yōu)先順序?yàn)闅W前胡素＝異歐前胡素＞佛手柑內(nèi)酯。Z-藁本內(nèi)酯含量高且鎮(zhèn)痛作用較強(qiáng)，阿魏酸為偏頭痛藥效成分之一，且為川芎在《中國藥典》2020 年版的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分，故AHP 法賦權(quán)時(shí)臣藥川芎中3 個(gè)指標(biāo)成分的優(yōu)先順序?yàn)榘⑽核幔絑-藁本內(nèi)酯＞洋川芎內(nèi)酯A。同時(shí)，根據(jù)中藥制劑特性，將干膏率納入質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。

3.3 設(shè)計(jì)空間的建立

QbD 理念的核心在于設(shè)計(jì)空間的建立。常規(guī)中藥提取工藝多采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳的工藝參數(shù)，并采取固定的提取工藝參數(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，易導(dǎo)致不同批次或同一批次間質(zhì)量波動(dòng)范圍較大。設(shè)計(jì)空間的構(gòu)建則是基于風(fēng)險(xiǎn)思維確定CPPs 的可接受范圍，在設(shè)計(jì)空間范圍內(nèi)可根據(jù)生產(chǎn)設(shè)備條件、原料藥材的質(zhì)量以及不同的環(huán)境對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行靈活調(diào)節(jié)，保證中間體、最終產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。本研究在定義設(shè)計(jì)空間參數(shù)時(shí)加入置信水平α＝0.05 的置信區(qū)間，建立顯著影響因素A、B 的設(shè)計(jì)空間，分別固定另2 個(gè)因素。當(dāng)固定滲漉體積流量在5 mL/min 時(shí)，在浸漬時(shí)間12～20 h 過程中設(shè)計(jì)空間面積隨浸泡時(shí)間增加的變化幅度明顯，而浸泡時(shí)間20～36 h 過程中，設(shè)計(jì)空間面積隨浸泡時(shí)間增加的變化幅度較緩和。當(dāng)固定滲漉體積流量在4 mL/min 時(shí)，在浸漬時(shí)間12～24 h 過程中設(shè)計(jì)空間面積隨浸泡時(shí)間增加的變化幅度較緩和；當(dāng)固定滲漉體積流量在3 mL/min 時(shí)，在浸漬時(shí)間16～20 h 過程中設(shè)計(jì)空間面積隨浸泡時(shí)間增加的變化幅度較緩和。

以綜合評(píng)分88 分為下限，發(fā)現(xiàn)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)中滿足條件的以滲漉體積流量4、3 mL/min 為絕大多數(shù)，浸漬時(shí)間12、24 h 為絕大多數(shù)，另外在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中滲漉體積流量為5 mL/min 不易控制，滲漉提取工藝參數(shù)中的浸漬時(shí)間多數(shù)為12～48 h[32]。故選擇滲漉體積流量4、3 mL/min，浸漬時(shí)間12、24 h 分別構(gòu)建A、B 的設(shè)計(jì)空間，確定A、B 的操作空間分別為50%～55%、8～10 倍。同時(shí)，選擇A、B為固定因素，分別以A 為50%、55%和B 為8 倍、10 倍為固定水平，構(gòu)建影響不顯著的滲漉體積流量和浸漬時(shí)間的設(shè)計(jì)空間，結(jié)果表明浸漬時(shí)間在12～24 h 均可滿足優(yōu)化目標(biāo)。故結(jié)合實(shí)際確定最佳提取工藝范圍為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%～55%、乙醇用量為8～10 倍、滲漉體積流量為3～4 mL/min、浸漬時(shí)間為12～24 h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值符合良好，表明在設(shè)計(jì)空間內(nèi)操作能保證都梁方滲漉提取液質(zhì)量的均一可控；設(shè)計(jì)空間法運(yùn)用于都梁方滲漉提取工藝穩(wěn)定可行，為實(shí)際大生產(chǎn)中工藝參數(shù)的篩選提供思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突