同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境中的分化及存活

張 靜，魏 峰，吳忠東，王亭忠，倪雅娟，馬愛群

缺血性心臟病通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植修復(fù)或替代嚴(yán)重受損或壞死的心肌細(xì)胞來改善心臟功能、逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)已成為目前的研究熱點(diǎn)［1］。已有大量動物實(shí)驗(yàn)研究［2－4］表明，心肌梗死區(qū)域同種異體 MSCs的局部移植可改善心臟功能，但同時也有研究［2］觀察到部分心肌梗死患者接受移植后發(fā)生心律失常等異質(zhì)性改變。移植的MSCs分化具有微環(huán)境依賴性［5］，在心肌缺血微環(huán)境下，移植的MSCs是向正常心肌細(xì)胞方向分化還是向受損或異常的心肌細(xì)胞或纖維瘢痕組織分化需要進(jìn)一步探討。該研究擬觀察同種異體的MSCs在大鼠體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境下心肌特異性標(biāo)志物的表達(dá)及分化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 80 g清潔級雄性SD大鼠1只，180～200 g清潔級雄性SD大鼠62只，均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。80 g大鼠用于骨髓供體，分離培養(yǎng)MSCs，180～200 g大鼠用于建立心肌梗死(myocardial infarction，MI)模型。

1.2 主要儀器及試劑 BX51型正置光學(xué)顯微鏡購于日本Olympus公司;BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購于成都泰盟科技有限公司;HM325石蠟切片機(jī)購于德國MICROM公司;激光顯微切割儀購于瑞士LEICA 公司;MYH、Cx43、cTnI、α-actin抗體購于美國Santa Cruz公司;兔抗山羊IgG-FITC購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司;山羊抗兔IgG-Cy3購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;TUNEL試劑盒購于美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 MSCs的分離培養(yǎng)與標(biāo)記 采用Percoll密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化SD大鼠MSCs，采用文獻(xiàn)［6］的方法，以攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染標(biāo)記純化的MSCs。

1.3.2 MI模型的建立 100 g/L水合氯醛以3 ml/kg的劑量腹腔注射麻醉健康成年SD大鼠，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，剪開皮膚，鈍性分離胸大肌和前鋸肌，用血管彎鉗穿透肋間肌進(jìn)入胸腔并沿肋間隙方向撐開，另一血管彎鉗沿垂直肋間隙方向撐開肋骨，適當(dāng)用力將心臟擠出，迅速在左心耳與肺動脈圓錐交界處平左心耳下緣2 mm處，以7/0無損傷縫合線結(jié)扎左冠狀動脈前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)近端，結(jié)扎后立即將心臟歸位并置入接注射器的引流管，對合皮膚的同時抽出胸腔內(nèi)氣體約2 ml，立即拔管并行胸外按壓，體表心電圖觀察有無心肌梗死后的心電圖改變，待心律、心率恢復(fù)正常且呼吸平穩(wěn)后，縫合皮膚，術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素鈉。

1.3.3 MSCs的體內(nèi)移植 將成功建立MI模型的53只大鼠2周后接受MSCs移植，采用建立MI模型的同樣方法麻醉、開胸、暴露心臟，用1 ml胰島素注射器于MI周邊區(qū)均勻迅速注射6×106個MSCs(約0.15 ml細(xì)胞懸液)，注射后的心臟歸位、恢復(fù)胸腔負(fù)壓、關(guān)胸及術(shù)后護(hù)理同MI模型的建立步驟。

1.3.4 心肌組織標(biāo)本的提取 將以上成功建立移植模型的41只大鼠于第3、5、7、9天分別隨機(jī)處死10、10、10、11只。前 3 d處死的 10只中，5只用于免疫熒光染色，5只用于Real-time PCR法檢測，第9天處死的11只中，6只用于免疫熒光染色，5只用于TUNEL凋亡染色。

1.3.5 免疫熒光染色 將第3、5、7、9天處死的大鼠心臟取出，沖凈殘血，切取注射部位的心肌組織，40 g/L多聚甲醛固定12 h，200 ml/L蔗糖溶液脫水12 h，OCT包埋組織，冰凍，連續(xù)組織切片，行常規(guī)免疫熒光染色;一抗稀釋濃度為1∶100，二抗稀釋濃度為1∶100;激光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.3.6 Real-time PCR 法檢測 同 1.3.5 中方法取出心臟，切取注射部位的心肌組織，制備連續(xù)冰凍組織切片，方法同免疫熒光染色。應(yīng)用激光顯微切割儀捕獲切片上GFP標(biāo)記的MSCs，采用單細(xì)胞PCR試劑盒中說明書推薦的方法裂解其RNA，并行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為:25℃ 10 min;50℃ 20 min;85℃5 min;Real-time PCR反應(yīng)條件為:50℃2 min;95℃ 2 min;95℃ 15 s;60℃ 30 s;共50個循環(huán)，內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。計算GFP標(biāo)記的MSCs相對于未移植MSCs的基因拷貝數(shù)。采用2－ΔΔCt的方法計算其相對表達(dá)量。

1.3.7 TUNEL凋亡染色 處死9 d的大鼠，分離注射部位的心肌組織，沖洗數(shù)次，40 g/L多聚甲醛固定12 h，200 ml/L蔗糖溶液脫水12 h;用OCT包埋組織，－80℃保存;連續(xù)冰凍切片，吸附到用多聚賴氨酸處理過的載玻片上;添加100 μl的20 μg/ml蛋白酶K稀釋液(10 mg/ml蛋白酶K原液，用PBS 500∶1稀釋)，室溫孵育30 min;再次固定，滴入E-quilibration緩沖液10 min后滴加rTdT反應(yīng)混合物同時覆蓋塑料蓋膜，37℃濕盒中孵育60 min;避光環(huán)境下加入 Streptavidin HRP稀釋液(用 PBS 500∶1稀釋 Streptavidin HRP)，室溫孵育 30 min;PBS沖洗后加入DAB稀釋液，室溫干燥30 min;熒光顯微鏡結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計量資料采用±s表示，兩組均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，可采用檢驗(yàn)水準(zhǔn)取0.05。

2 結(jié)果

2.1 移植MSCs的分布特點(diǎn)及其主要心肌特異性標(biāo)志物蛋白的表達(dá) 通過免疫熒光染色觀察移植的MSCs在心肌組織內(nèi)呈帶狀分布，排列方向與心肌細(xì)胞一致，于移植后3 d開始持續(xù)表達(dá)MYH、Cx43，移植后5 d開始持續(xù)表達(dá)cTnI，不表達(dá)α-actin，見圖1。

圖1 GFP標(biāo)記的MSCs在心肌缺血微環(huán)境中心肌特異性標(biāo)志物蛋白的表達(dá) 免疫熒光染色×600

2.2 移植的MSCs主要心肌特異性標(biāo)志物mRNA的表達(dá) 與未移植 MSCs相比，移植的 MSCs中MYH、Cx43于移植后3 d表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，cTnI于移植后5 d表達(dá)明顯增多(P＜0.05)。其中，MYH于移植后5、7 d較3 d表達(dá)量明顯增多(P＜0.05)，Cx43、cTnI于移植后7 d較5 d表達(dá)量均增多 (P＜0.05)，見圖2。

圖2 Real-time PCR法測定特異性標(biāo)志物的mRNA相對表達(dá)量

2.3 移植的MSCs數(shù)量的變化 移植的MSCs起初數(shù)量眾多、存活良好，但隨著移植時間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，于移植后第9天基本全部丟失，見圖3。

圖3 移植的MSCs數(shù)量變化 免疫熒光染色×600

2.4 TUNEL凋亡染色 9 d時移植的MSCs細(xì)胞數(shù)量明顯減少，行TUNEL凋亡染色示移植的MSCs在光鏡下呈棕褐色，見圖4。

3 討論

MSCs因具備儲量豐富、易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、無染色體異常或端粒酶缺失、不易刺激異體免疫細(xì)胞增殖等優(yōu)點(diǎn)而成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)細(xì)胞［7］，大量的動物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)已證實(shí)MSCs的移植可以修復(fù)壞死的心肌細(xì)胞，從而改善心臟功能。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植的MSCs的分化具備環(huán)境誘導(dǎo)依賴性［8］。移植的MSCs所處環(huán)境是病態(tài)環(huán)境，周圍既有正常的心肌細(xì)胞，也有受損或異常的心肌細(xì)胞以及纖維瘢痕組織等，然而，MSCs具有多向分化潛能，是否能向正常心肌細(xì)胞方向分化有待證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植的MSCs可以表達(dá)心肌特異性蛋白 cTnI、MYH、Cx43，未觀察到α-actin的表達(dá)。

圖4 移植的MSCs凋亡染色 TUNEL凋亡染色×600

cTnI是肌鈣蛋白3種基因亞基之一，具有較高的心肌特異性。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植的MSCs隨著移植時間的延長，cTnI表達(dá)且表達(dá)量不斷增加，這初步驗(yàn)證了移植的MSCs朝著心肌樣細(xì)胞方向分化。

與心肌收縮有關(guān)的肌原纖維的主要成分是肌球蛋白與肌動蛋白。MYH是肌球蛋白重要組成部分，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植的MSCs于移植后3 d開始表達(dá)MYH，并隨著時間的延長，表達(dá)有所增加，這為移植的MSCs收縮及與宿主心肌細(xì)胞協(xié)調(diào)運(yùn)動提供了結(jié)構(gòu)蛋白基礎(chǔ)。然而本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了移植的MSCs不表達(dá)作為肌動蛋白主要亞型之一的α-actin，但Fukuda［9］研究發(fā)現(xiàn)MSCs在體外可分化為心肌細(xì)胞和肌小管，表達(dá)α-actin。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符合，究其原因，α-actin的未表達(dá)考慮可能與移植細(xì)胞存活時間短而未完成分化相關(guān)，同時α-actin的缺失表達(dá)致使移植的MSCs缺乏結(jié)構(gòu)蛋白的支持而逐漸丟失，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步證實(shí)。

Cx43是機(jī)械偶聯(lián)主要的中間連接蛋白，在與宿主心肌細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)方面起著重要作用。Shake et al［10］將 Di-I標(biāo)記的自體 MSCs 注射入豬心肌梗死模型的梗死心肌內(nèi)，2周后可檢測到Cx43與宿主心肌細(xì)胞發(fā)生電-機(jī)械偶聯(lián)。Pijnappels et al［11］發(fā)現(xiàn)上調(diào)Cx43的表達(dá)可以提高心肌細(xì)胞間電偶聯(lián)及心肌間傳導(dǎo)速度增加，可以減少心肌梗死后心律失常的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植的MSCs于3 d后即可觀察到Cx43的表達(dá)，移植細(xì)胞及宿主細(xì)胞之間提供了信號通道，與宿主心肌之間初步形成了電-機(jī)械偶聯(lián)，為改善心臟的功能奠定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)同時證實(shí)MSCs隨著移植時間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，移植后第9天基本全部丟失。既往已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs免疫原性低，其誘導(dǎo)分化的組織免疫排斥反應(yīng)弱，且可來源于異體，避免了組織配型和免疫排斥反應(yīng)的問題［12］。這就為同種異體之間的安全及有效移植奠定了基礎(chǔ)。但有實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs移植后24 h，超過50%的細(xì)胞發(fā)生了凋亡，1周后超過90%的細(xì)胞發(fā)生了凋亡［13］。凋亡的具體機(jī)制尚不明確，推測微環(huán)境可能是影響MSCs存活的主要因素。第一，移植區(qū)域周邊心肌細(xì)胞因壞死而肌纖維的斷裂、細(xì)胞間網(wǎng)格結(jié)構(gòu)破壞以及移植的MSCs自身結(jié)構(gòu)框架蛋白如α-actin的表達(dá)缺失或不完全等均可導(dǎo)致移植的MSCs失去存活的空間;第二，移植的MSCs在微環(huán)境中缺乏足夠的營養(yǎng)能量供給，某些心肌標(biāo)志物的表達(dá)缺失可能會引起MSCs向心肌細(xì)胞分化的過程中線粒體能量代謝障礙，導(dǎo)致能量缺失;第三，局部注射的移植方法可能會導(dǎo)致移植的MSCs炎癥細(xì)胞聚集于移植區(qū)、分布高度不均勻而引起心肌細(xì)胞的急性炎癥反應(yīng);第四，可能與移植的MSCs的GFP表達(dá)沉默相關(guān)，致使GFP標(biāo)記的原位細(xì)胞綠色熒光消失而觀察不到，Schierling et al［14］研究表明移植后3 d其標(biāo)記的GFP表達(dá)沉默。

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