Livin、Caspase-9在十二指腸腺癌中的表達及臨床意義

倪文凱，于東風，劉 弋

凋亡是正常機體細胞保持穩(wěn)定的重要措施之一，是調(diào)節(jié)機體組織平衡的重要機制，是一個受到嚴密監(jiān)控的過程?；虻漠惓８淖儠е录毎蛲鍪艿揭种?，最終導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［1］。凋亡抑制蛋白Livin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成員，特異的高表達于某些實體腫瘤組織和腫瘤細胞系中［2］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)是一種促凋亡因子，是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶族中的一員，是執(zhí)行細胞凋亡的主要酶類之一［3］。為了研究兩者對十二指腸腺癌發(fā)生發(fā)展的影響，該研究通過免疫組化法檢測十二指腸腺癌中兩者的表達情況，旨在探討二者在十二指腸腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用，從而為十二指腸腺癌的診斷與臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集我院2006年1月～2012年12月經(jīng)手術切除并經(jīng)病理驗證的有完整臨床資料的十二指腸腺癌患者的存檔組織蠟塊60例作為實驗組，其中男32例，女28例，年齡36～84歲，平均45.4歲。所有患者術前均未接受化療及放療。同時選取同組病例癌旁正常組織標本30例作為對照組。

1.2 主要試劑 兔抗人Livin多克隆抗體及兔抗人Caspase-9多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;通用型二步法檢測試劑盒(PV-6000)、PBS緩沖液、枸櫞酸緩沖液、DAB顯色液等均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化PV-6000兩步法。每次染色均設立陽性及陰性對照組，(以PBS液代替一抗作為陰性對照)。結果判斷:Livin以細胞質(zhì)和(或)細胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。Caspase-9以細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。選擇合適部位選取5個高倍視野，每個高倍鏡視野計數(shù)100個細胞，高倍鏡下計數(shù)陽性細胞比例，以＞20%為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組之間比較相關性檢驗和χ2檢驗，并計算Pearson列聯(lián)系數(shù)r。

2 結果

2.1 Livin及Caspase-9在十二指腸腺癌及癌旁組織中的表達情況 Livin及Caspase-9在十二指腸腺癌及癌旁組織均有陽性表達，其中Livin在實驗組中的陽性率明顯高于對照組(P＜0.01)，Caspase-9在實驗組中的陽性率明顯低于對照組(P＜0.01)。見表1、圖1。

2.2 Livin、Caspase-9在十二指腸腺癌中的表達與臨床病理參數(shù)的關系 Livin的表達與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤發(fā)生部位比較差異無統(tǒng)計學意義，與腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，Caspase-9的表達與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤發(fā)生部位及浸潤深度比較差異無統(tǒng)計學意義，與淋巴結轉(zhuǎn)移、腫瘤的分化程度比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 Livin與Caspase-9在十二指腸腺癌中表達相關性分析 43例Livin蛋白陽性表達的十二指腸腺癌組織中7例Caspase-9表達陽性，17例Livin蛋白陰性的十二指腸腺癌中有8例Caspase-9表達陽性。Livin與Caspase-9的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，r=－0.320)，見表3。兩者的表達呈負相關性。

表1 Livin在十二指腸腺癌及癌旁組織中的表達情況［n(%)］

圖1 十二指腸腺癌及癌旁正常組織中Livin及Caspase-9的表達 SP×400

表2 Livin、Caspase-9的表達與臨床病理參數(shù)之間的關系［n(%)］

表3 十二指腸腺癌中Livin與Caspase-9表達之間的關系［n(%)］

3 討論

細胞凋亡是機體重要的生理過程，對維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有著關鍵的作用。細胞凋亡功能的異常最終導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Livin基因位于人染色體20q13.3，全長4 600 bp，包含6個內(nèi)含子和7個外顯子。其編碼的Livin蛋白含有IAP家族成員中特有的BIR結構和RING指結構。其中RING結構調(diào)控著Livin蛋白在細胞內(nèi)的合理分布，BIR結構是Livin蛋白發(fā)揮抗凋亡作用的重要結合部位，通過與Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 以及凋亡前體蛋白SMAC等酶的結合，達到阻斷凋亡受體以及以線粒體為基礎的凋亡途徑而起到抑制細胞凋亡的作用［4］。Yagihashi et al［5］通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測癌癥患者血清中抗Livin抗體，發(fā)現(xiàn)肺癌、乳腺癌、腎癌、食管癌、胃癌、膽管癌和結直腸癌患者血清中抗Livin抗體高表達 。Xi et al［6］用免疫組化法發(fā)現(xiàn)在結直腸癌患者中Livin呈高表達，其表達水平與患者總體生存率呈負相關。本實驗結果表明Livin在對照組中低表達，實驗組中高表達，并與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移呈正相關，與腫瘤的分化程度呈負相關，提示Livin表達的升高可能與十二指腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關系，同時Livin的表達可能影響十二指腸癌的生物學行為，使其發(fā)生轉(zhuǎn)移等惡性轉(zhuǎn)化行為，有可能成為癌癥預后及治療情況的判斷指標之一。

Caspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑中的關鍵蛋白酶，當細胞接收到凋亡信號后，線粒體釋放Cyt C及凋亡活化因子(Apaf-1)。兩者結合以后形成凋亡小體，共同激活Caspase-9，活化后的Caspase-9進一步激活下游的效應Caspase，從而參與調(diào)節(jié)過程［7］。本研究顯示Caspase-9在實驗組的陽性表達明顯低于對照組，并且與腫瘤有無淋巴結轉(zhuǎn)移呈負相關，與腫瘤的分化程度呈正相關。提示Caspase-9的異常表達參與了十二指腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

Kasof et al［8］通過實驗證明:Livin 能夠直接抑制 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的水解作用，Livin蛋白的BIR結構能夠與Caspase結合從而抑制其功能。同時Livin還能直接在凋亡的起始點干擾Procaspase-9或者直接干擾Caspase-9的活性［9］。本研究表明Livin與Caspase-9的表達呈負相關性。Livin蛋白和Caspase-9的具體作用機制以及兩者之間的關系還有待進一步的研究證實。二者的聯(lián)合檢測可視為判斷患者預后以及治療效果的重要標志和預測因子。

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