mCIM和碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測CRE和CRPA產(chǎn)酶表型的方法學(xué)評(píng)價(jià)

尚佳文，徐文娜，許南松，劉曉敏，曾秋耀，鄭 炘（.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東東莞 53808；.中山大學(xué)腫瘤防治中心檢驗(yàn)科，華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣州 50060）

細(xì)菌耐藥一直是全球衛(wèi)生健康領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)，在目前臨床醫(yī)治G-菌感染的藥物選擇中，碳青霉烯類抗生素仍是最有效的抗生素之一。根據(jù)CHINET 中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)的數(shù)據(jù)分析，亞胺培南和美羅培南在普通G-菌中的抗菌效果相近，但二者均屬廣譜抗生素，濫用極易造成細(xì)菌耐藥。近年來，由于廣譜抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致了耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌（carbapenem-resistantEnterobacterales,CRE）和耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（carbapenem-resistantPseudomonasaeruginosa,CRPA）的檢出率呈逐年上升趨勢，根據(jù)吳義娟等[1]人于2021年的研究統(tǒng)計(jì)，國內(nèi)外CRE 檢出率均逐年遞增，并且CRE 感染后的死亡率高達(dá)50%。

CRE 與CRPA 的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，其中腸桿菌目細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶[2]，而銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制更加復(fù)雜，主要表現(xiàn)在生物膜形成、外排系統(tǒng)過度表達(dá)、產(chǎn)碳青霉烯酶等方面[3]。目前用于治療感染的新的抗生素：頭孢他啶/阿維巴坦（CZA）對(duì)產(chǎn)KPC 和OXA-48 型絲氨酸碳青霉烯酶的菌株具有較高的抑菌作用，而對(duì)生產(chǎn)B類金屬-β-內(nèi)酰胺酶的菌株則沒有抑菌作用[4]。此外，目前正處于研究階段的亞胺培南/雷利巴坦（imipenem/relebactam）[5]和美羅培南/韋博巴坦（meropenem/vaborbactam）[6]對(duì)產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶以及OXA-48 型碳青霉烯酶的菌株無抗菌活性，但對(duì)產(chǎn)KPC 型碳青霉烯酶的菌株有較強(qiáng)的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確、迅速地檢測和分類耐碳青霉烯菌株中的碳青霉烯酶是治療過程中非常關(guān)鍵的一步[7]。本研究通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的mCIM 和增強(qiáng)試驗(yàn)進(jìn)行多方位比較，并用新型膠體金法進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，以期得出更適用于臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的檢測方法，以供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 本研究菌株均來自中山大學(xué)腫瘤防治中心2019～2022年臨床分離的47 株CRE 和42株CRPA，其中CRE 菌株包括22 株大腸埃希菌、13 株肺炎克雷伯菌、4 株陰溝腸桿菌、3 株產(chǎn)氣腸桿菌、3 株產(chǎn)酸克雷伯菌和2 株陰溝腸桿菌復(fù)合群。全部菌株均用全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定及藥物敏感性測試。所有菌株均采用干燥紙片法保存并存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。陰性?duì)照所用的大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853 標(biāo)準(zhǔn)菌株來自國家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與試劑 VITEK2-compact 全自動(dòng)微生物分析儀（法國梅里埃生物公司）；1μl 和10μl定量接種環(huán)（標(biāo)普生物）；亞胺培南和美羅培南（10μg/片）藥敏紙片（英國OXOID 公司）；血平板、MH 培養(yǎng)液、肉湯培養(yǎng)液（TSB）（廣州市迪景微生物科技有限公司）；APB-EDTA 緩沖液（上海原科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；VIM，KPC，NDM，OXA-23，IMP，OXA-48 膠體金試劑（北京金山川科技發(fā)展有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 紙片擴(kuò)散法復(fù)核：按類別分為CRE 和CRPA兩組分批次進(jìn)行檢測，復(fù)蘇保存的菌株經(jīng)紙片擴(kuò)散法（K-B 法）復(fù)核CRE 和CRPA 耐藥情況，K-B法試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2020版CLSI M100執(zhí)行。

1.3.2 mCIM 檢測碳青霉烯酶：CRE 與CRPA 分別作為實(shí)驗(yàn)組，大腸埃希菌ATCC25922 和銅綠假單胞菌ATCC27853 標(biāo)準(zhǔn)菌株作陰性對(duì)照，嚴(yán)格按照CLSI 操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑6～15 mm 或在16～18 mm 抑菌圈內(nèi)有針尖樣菌落為碳青霉烯酶陽性；抑菌圈直徑≥19 mm 為碳青霉烯酶陰性；抑菌圈直徑16～18 mm 或抑菌圈直徑≥19 mm 抑菌圈內(nèi)存在針尖樣菌落為碳青霉烯酶不確定。

1.3.3 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)：檢測酶型實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同上，將0.5 麥?zhǔn)蠞岫饶繕?biāo)菌懸液涂布于MH 平板，干燥后貼4 張亞胺培南紙片編號(hào)A，B，C，D。紙片A：不加任何液體（空白對(duì)照）；紙片B：滴加10μl EDTA 溶液；紙片C：滴加10μl 3-氨基苯硼酸（APB）溶液；紙片D：滴加APB 和EDTA 溶液各10μl。35℃過夜孵育后量取結(jié)果。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn): 紙片B 抑菌圈直徑與A 相差≥5mm，則該菌株產(chǎn)B 類碳青霉烯酶；紙片C 抑菌圈直徑與A 相差≥5mm，則該菌株產(chǎn)A類碳青霉烯酶；如僅紙片D 抑菌圈直徑與A 相差≥5mm，則該菌株同時(shí)產(chǎn)A 類碳青霉烯酶和B 類金屬β 內(nèi)酰胺酶；如紙片B，C，D 抑菌圈直徑與A 相差均＜5mm，則該菌不產(chǎn)A 或B 類碳青霉烯酶。

1.3.4 膠體金法驗(yàn)證結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組為CRE，對(duì)照組為大腸埃希菌ATCC25922 標(biāo)準(zhǔn)菌株。參照說明書步驟進(jìn)行操作并按說明書結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 mCIM 和碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)的結(jié)果資料及膠體金法分別對(duì)兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果資料均屬于自身配對(duì)設(shè)計(jì)方案，為比較兩種測定方法結(jié)果是否有差別，應(yīng)采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。利用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Pearsonχ2檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 待測菌對(duì)碳青霉烯類耐藥情況 K-B 法復(fù)核結(jié)果與VITEK2-compact 所用的MIC 法基本一致，菌株均可入組。

2.2 mCIM 檢測碳青霉烯酶結(jié)果 見表1，檢測部分結(jié)果見圖1。根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn)判讀，得到mCIM檢測CRE 中的碳青霉烯酶陽性率為70.2%，不確定為25.5%，陰性率為4.3%；檢測CRPA 得碳青霉烯酶的陽性率為35.7%，陰性率為52.4%，11.9%不確定。

表1 mCIM 對(duì)47 株CRE 和42 株CRPA 的檢測結(jié)果［n(%)］

圖1 mCIM 改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)圖

2.3 增強(qiáng)試驗(yàn)檢測碳青霉烯酶結(jié)果 根據(jù)增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，47 株CRE 中，產(chǎn)B 類金屬β-內(nèi)酰胺酶占44.7%，不產(chǎn)A 類或B 類碳青霉烯酶占38.3%；42 株CRPA 中，產(chǎn)A 類碳青霉烯酶占90.4%，同時(shí)產(chǎn)A 類碳青霉烯酶和B 類金屬β-內(nèi)酰胺酶占4.8%，不產(chǎn)A 類或B 類碳青霉烯酶占2.4%。

2.4 mCIM 與碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果比對(duì)配對(duì)設(shè)計(jì)χ2檢驗(yàn)比較47 株CRE mCIM 與增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果得到P＜0.05，按α=0.05 水準(zhǔn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.803，P=0.01），即兩種方法結(jié)果存在差異，且mCIM 法檢出率高于增強(qiáng)試驗(yàn)，兩種方法檢測陽性符合率為53.2%；比較42 株CRPA mCIM 與增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果，得到P＞0.05，按α=0.05水準(zhǔn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.632，P=0.592），即兩種方法結(jié)果無差異，兩種方法檢測陽性符合率為35.7%。

2.5 膠體金法檢測47 株CRE 進(jìn)行驗(yàn)證 部分結(jié)果見圖2，數(shù)據(jù)見表2。檢測47 株CRE 得到產(chǎn)NDM型20 株（42.6%），產(chǎn)KPC 型4 株（8.5%），產(chǎn)IMP 型1 株（2.1%），產(chǎn)OXA-48 型1 株（2.1%），21 株（44.7%）陰性。膠體金結(jié)果與mCIM 結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，陽性符合率為84.6%（22/26），與增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，產(chǎn)金屬酶的陽性符合率為100%（21/21），產(chǎn)絲氨酸酶的陽性符合率為80%（4/5）。

表2 CRE 的mCIM 和增強(qiáng)試驗(yàn)與膠體金結(jié)果比對(duì)結(jié)果［n(%)］

圖2 膠體金結(jié)果圖

3 討論

據(jù)CHINET 2020年公布的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，腸桿菌目中肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物的平均耐藥率已經(jīng)上升到了25.7%，銅綠假單胞菌對(duì)其的平均耐藥率28.3%，且耐藥性比例均逐年增加[8]。產(chǎn)碳青霉烯酶是導(dǎo)致腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因[3]，且為了加快新的抗生素在臨床治療中的推廣，要求臨床微生物實(shí)驗(yàn)室要進(jìn)一步了解耐碳青霉烯類菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶及其型別，從而使用藥更有針對(duì)性，故找到一種快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好且價(jià)格適中的檢測方法至關(guān)重要。

目前，實(shí)驗(yàn)室多采用mCIM 法或結(jié)合eCIM 法對(duì)菌株產(chǎn)酶及其表型進(jìn)行常規(guī)測定，但mCIM 不能區(qū)分酶型，eCIM 需額外試劑，也存在不能區(qū)分具體型別等弊端，且兩種方法所需溫育時(shí)間較長，不利于早期產(chǎn)酶的診斷[9]。本次研究發(fā)現(xiàn)，mCIM 對(duì)于CRPA 的檢出率較低（35.7%），如謝國艷等[10]人報(bào)道m(xù)CIM 對(duì)產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌的陽性檢出率僅為11.9%，李軍等[11]人發(fā)現(xiàn)mCIM 檢測碳青霉烯酶基因陽性的銅綠假單胞菌得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，這是因?yàn)殂~綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素常表現(xiàn)為多種耐藥機(jī)制共存的形式[12]，說明單一mCIM 法不適用于CRPA 產(chǎn)酶的檢出。同時(shí)在本次mCIM 法判定過程中發(fā)現(xiàn)，CRPA的抑菌圈邊緣內(nèi)側(cè)有均勻致密的針尖樣物質(zhì)，見圖3。該物質(zhì)的存在影響抑菌圈直徑量取，導(dǎo)致主觀誤差增大，而mCIM 法測CRE 無該物質(zhì)干擾，綜上所述，推薦用mCIM 法檢測CRE，不建議用該方法檢測CRPA。

圖3 mCIM 測CRPA 中出現(xiàn)的邊緣致密針尖樣物

增強(qiáng)試驗(yàn)利用酶抑制劑硼酸（APB）抑制KPC酶活性，EDTA 抑制金屬酶活性原理，從而區(qū)分金屬酶和絲氨酸酶，但增強(qiáng)試驗(yàn)不能檢測D 類OXA-48 型碳青霉烯酶且APB 對(duì)高產(chǎn)AmpC 酶合并膜孔蛋白缺失的菌株假陽性[13]。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)碳青霉烯酶不同型別特征，開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)以供臨床制定更為精準(zhǔn)的治療方案，如金屬β-內(nèi)酰胺酶不能水解氨曲南，阿維巴坦、韋博巴坦能抑制產(chǎn)KPC 型碳青霉烯酶的菌株活性等[14]。此外，不同酶抑制劑的抑酶活性也不同，如阿維巴坦對(duì)三乙烯二胺類的抑酶效果可逆，且對(duì)A,C,D 類β 內(nèi)酰胺酶有抑菌作用，對(duì)B 類β-內(nèi)酰胺酶無抑菌作用[15]，提示臨床可以根據(jù)不同酶抑制劑的不同抑酶活性建立針對(duì)性更強(qiáng)的治療方案。

膠體金法采用的酶免疫層析技術(shù)被定義為檢測碳青霉烯酶的金標(biāo)法[9]。但因CRPA 耐藥機(jī)制復(fù)雜，常出現(xiàn)多種耐藥機(jī)制共存現(xiàn)象，TENOVER 等[12]人的研究表明CRPA 除產(chǎn)碳青霉烯酶、高表達(dá)OprD 基因外，還存在其他例如AmpC 酶生產(chǎn)過剩和OprD 外膜蛋白缺乏活力等耐藥機(jī)制，并且隨著碳青霉烯類藥物進(jìn)一步的選擇壓力，其他耐藥機(jī)制也可能出現(xiàn)，故本研究未對(duì)CRPA 進(jìn)行膠體金驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。本研究中47 株CRE 中 mCIM，增強(qiáng)試驗(yàn)與膠體金比對(duì)結(jié)果說明三種方法均適用，但要警惕膠體金法若待測基因和目標(biāo)基因不符則會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

綜合來看，對(duì)于CRE 菌株三種方法各有優(yōu)缺，mCIM 法所需材料價(jià)格相對(duì)低廉，但所需溫育時(shí)間較長，操作較為復(fù)雜，培養(yǎng)孵育共需要28h，時(shí)間成本高，若一菌株同時(shí)產(chǎn)絲氨酸型碳青霉烯酶和金屬β 內(nèi)酰胺酶會(huì)導(dǎo)致結(jié)果假陰性；增強(qiáng)試驗(yàn)需要額外購買EDTA 和APB 碳青霉烯酶抑制劑，操作較mCIM 法簡單，但仍需要過培養(yǎng)，且不能檢測D 類OXA-48 型碳青霉烯酶；膠體金法雖然具有簡便、快速、精確、結(jié)果易讀的特點(diǎn)，但試劑價(jià)格昂貴，臨床選取檢測方法時(shí)應(yīng)結(jié)合實(shí)際，如危重癥患者需要快速得到CRE 產(chǎn)酶表型時(shí)，推薦用膠體金，方便臨床快速確定感染治療方案進(jìn)行救治。對(duì)于CRPA，雖然CLSI 中說明mCIM 方法適用于CRPA，但此次研究發(fā)現(xiàn)，量取結(jié)果時(shí)內(nèi)緣均勻致密的針尖樣物質(zhì)的存在會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差，增強(qiáng)試驗(yàn)陽性檢出率較高，更推薦使用。

綜上所述，要控制多重耐藥的檢出，需對(duì)碳青霉烯等廣譜抗生素施行更嚴(yán)格的用藥制度，而臨床微生物實(shí)驗(yàn)室需不斷探討、比較，采用高效優(yōu)質(zhì)的檢驗(yàn)方法，為臨床提供快、精、準(zhǔn)的用藥依據(jù)，讓危重感染患者更快得到有效治療。