施萬細(xì)胞條件敲除SEMA3B 通過AKT/GSK3β 信號(hào)通路抑制神經(jīng)損傷后的華勒變性

徐元濤，許逸舟，許淑怡，馬心蕊，王祥海，朱立新，郭家松

1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院脊柱外科，廣州 510510；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，廣州510515

Semaphorin 3B(SEMA3B)是Semaphorin 家族成員，過去認(rèn)為它主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育時(shí)引導(dǎo)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)[1,2]，也能對(duì)中樞神經(jīng)損傷后的軸突再生發(fā)揮抑制作用[3]。過表達(dá)SEMA3B 可減輕神經(jīng)元凋亡并且增加突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而改善小鼠的抑郁行為[4]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它還可以參與調(diào)節(jié)血管或淋巴管生成以及腫瘤進(jìn)展等生物學(xué)功能[5,6]。然而SEMA3B 在周圍神經(jīng)損傷后華勒變性過程中的作用以及對(duì)施萬細(xì)胞去分化的影響尚未有人報(bào)道。

周圍神經(jīng)損傷后，受損神經(jīng)遠(yuǎn)端的軸突和髓鞘出現(xiàn)崩解和清除，這一過程被稱為華勒變性，這可為隨后的神經(jīng)再生提供有利微環(huán)境。而施萬細(xì)胞在這過程中扮演著非常重要角色，周圍神經(jīng)的髓鞘由施萬細(xì)胞形成，隨著髓鞘崩解，施萬細(xì)胞開始去分化。去分化的施萬細(xì)胞能夠分泌因子募集巨噬細(xì)胞，其本身也能夠協(xié)助巨噬細(xì)胞共同清理軸突和髓鞘碎片。文獻(xiàn)顯示SEMA3B 在不同細(xì)胞的不同生物學(xué)活動(dòng)中可能通過不同的信號(hào)分子發(fā)揮作用[5,7～9]。在分析已知的SEMA3B 下游信號(hào)分子時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)其中AKT、ERK和JNK 等與施萬細(xì)胞分化或去分化有著密切關(guān)系[10～13]，這提示SEMA3B 可能通過調(diào)控施萬細(xì)胞去分化而影響神經(jīng)損傷后華勒變性過程。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，本研究采用施萬細(xì)胞條件敲除小鼠，通過體內(nèi)外模型檢測(cè)SEMA3B 基因敲除對(duì)施萬細(xì)胞去分化及華勒變性的影響并探討了其中的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及模型建立

本實(shí)驗(yàn)使用的施萬細(xì)胞條件敲除SEMA3B 小鼠基因型為dhh-Cre+/SEMA3Bflox/flox（cKO,來自Jackson 實(shí)驗(yàn)室），其同窩的dhh-Cre+(Cre)小鼠用作對(duì)照組。小鼠采用常規(guī)PCR 方法進(jìn)行鑒定，8 周齡時(shí)用于建立體內(nèi)外華勒變性模型：小鼠經(jīng)三溴乙醇（180 mg/kg）麻醉后，對(duì)坐骨神經(jīng)進(jìn)行鈍性分離，于坐骨切跡外側(cè)0.5 cm 將神經(jīng)完全橫斷，術(shù)后5 d 取材，將橫斷遠(yuǎn)端神經(jīng)用于免疫熒光或蛋白免疫印跡檢測(cè)。另外，由于體內(nèi)模型中巨噬細(xì)胞對(duì)華勒變性的影響巨大，為了更加清晰顯示施萬細(xì)胞本身對(duì)華勒變性的影響，我們還建立了能排除巨噬細(xì)胞募集的體外模型，即將坐骨神經(jīng)分離后取出并裁剪為5 mm 長(zhǎng)的小段，然后用含10%血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)5 d，然后也進(jìn)行免疫熒光或蛋白免疫印跡檢測(cè)。

1.2 冰凍切片制作

體內(nèi)模型動(dòng)物術(shù)后5 d 按常規(guī)方法經(jīng)心臟使用4%多聚甲醛灌注固定后取橫斷傷處遠(yuǎn)端坐骨神經(jīng)并進(jìn)行24 h 后固定。體外模型的神經(jīng)培養(yǎng)5 d 后直接用4%多聚甲醛固定24 h。固定后的標(biāo)本經(jīng)30%蔗糖脫水24 h、OCT 包埋后進(jìn)行冰凍切片，制成厚度為10μm的橫切片，然后進(jìn)行常規(guī)免疫熒光染色。

1.3 免疫熒光染色

用PBS 清洗神經(jīng)組織冰凍切片3 次，每次10 min。用0.1%Triton X-100 透膜30 min，5 % Gelatin 封閉1 h。加入以下一抗：NF (1:400,Sigma-Aldrich)、MBP (1: 400，Merck Millipore)、c-Jun（1: 200,BD Biosciences）、MAG(1:200，Abcam)，4℃孵 育24h 后PBS 漂洗3 次，Alexa 488 或568 熒光標(biāo)記二抗（1:800）室溫避光孵育2 h，最后使用封片劑封片。

1.4 蛋白免疫印跡

體內(nèi)模型動(dòng)物術(shù)后5 d 再次麻醉動(dòng)物，取出橫斷遠(yuǎn)端神經(jīng)（1.0 cm），體外模型則在第5 天直接取出培養(yǎng)的神經(jīng)。組織經(jīng)PBS 清洗后用RIPA 裂解液常規(guī)技術(shù)提取總蛋白。蛋白質(zhì)樣本在10%十二烷基硫酸鈉鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。然后，用5%脫脂牛奶封閉1 h、與一抗孵育過夜、二抗孵育2 h。最后，使用ECL 化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯影。所使用的抗體如下：NF (1:800,Sigma-Aldrich)、MBP (1:1000，Merck Millipore)、c-Jun（1:800,BD Biosciences）、MAG(1:800,Abcam)、AKT（1:1000,Abclonal）、P-AKT(1:1000,Abclonal)、GSK3β（1:1500,Cell signaling）、p-GSK3β(1:1500,Cell signaling)、JNK（1:1000,Abclonal）、p-JNK(1:1500,Abclonal)、ERK（1:1000,Abclonal）、p-ERK(1:1500,Abclonal)。

1.5 逆轉(zhuǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按上述方法建立體外華勒變性模型，然后在培養(yǎng)液中加入濃度為79 μmol/L 的SC79 (SF2730,碧云天)，對(duì)照組不做加藥處理，培養(yǎng)5 d 后按上述方法進(jìn)行免疫熒光或蛋白免疫印跡檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

本研究使用SPSS 20.0 軟件（IBM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用于t檢驗(yàn)來比較兩組之間數(shù)值差異。方差分析（one-way ANOVA,Bonferroni post hoc comparison）比較多組間差異，P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SEM）展示，用Photoshop CS5(Adobe)軟件處理熒光圖片以及論文作圖，用GraphPad Prism (GraphPad Software)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。

2 結(jié)果

2.1 施萬細(xì)胞敲除SEMA3B 增加了華勒變性過程中軸突及髓鞘的殘留

以往的報(bào)道以及我們的研究均顯示損傷遠(yuǎn)端神經(jīng)中的NF 和MBP 的蛋白表達(dá)水平隨著華勒變性進(jìn)程而逐漸減低，且NF 和MBP 陽性的軸突或髓鞘逐漸減少[14,15]。所以本研究通過蛋白免疫印跡和免疫熒光比較了體內(nèi)和體外模型中NF 和MBP 的蛋白表達(dá)水平和NF 陽性軸突和MBP 陽性髓鞘殘留在cKO 和Cre組之間的差異。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，不論是體內(nèi)模型還是體外模型，cKO 組的NF 和MBP 蛋白水平均顯著高于Cre 組（圖1A-C,G-I）。免疫熒光則顯示體內(nèi)和體外模型中軸突和髓鞘結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)不同程度的腫脹、松散及崩解狀態(tài)，但是它們的殘留量均是cKO組大于Cre 組(圖1D-F,J-M)。

圖1 施萬細(xì)胞敲除SEMA3B 可增加華勒變性過程中軸突及髓鞘的殘留A-C:蛋白質(zhì)印跡顯示損傷后5d 的NF 和MBP 水平,n=3 D-F:免疫熒光染色顯示受損神經(jīng)中殘留的軸突和髓鞘,n=4 G-I:體外外植塊培養(yǎng)5d 蛋白質(zhì)印跡,n=3 J-M:體外免疫熒光染色結(jié)果, n=4 *P＜0.05Fig.1 Schwann cellspecific knockout of SEMA3B increased the residual axon and myelin during Wallerian degeneration.A-C: Western blotting showed that the levels of NF and MBP after 5 days of injury (dpi),n=3; D-F:Immunofluoresence showed that the NF positive axons and MBP positive myelin in the injured nerve, n=4; G-I: Western blotting results of the in vitro model at 5 days,n=3; J-M:Immunofluorescence results of the in vitro model, n=4;*P＜0.05

2.2 敲除SEMA3B 可抑制施萬細(xì)胞去分化

在正常神經(jīng)中成熟分化的施萬細(xì)胞中高表達(dá)MAG、MBP 和P0 等標(biāo)志性蛋白，而幼稚或去分化狀態(tài)的施萬細(xì)胞則表達(dá)c-Jun、p75 等蛋白[16]。所以本研究選擇c-Jun 和MAG 分別作為施萬細(xì)胞去分化和分化程度的標(biāo)志物在體外模型評(píng)判SEMA3B 敲除對(duì)施萬細(xì)胞去分化的影響。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，cKO組c-Jun 水平低于Cre 組，而cKO 組MAG 水平明顯升高(圖2A-C)。免疫熒光結(jié)果同樣顯示cKO 組的c-Jun陽性熒光強(qiáng)度明顯低于Cre 組，而MAG 熒光強(qiáng)度明顯高于Cre 組(圖2D-F)。這些數(shù)據(jù)表明SEMA3B 缺失延緩了損傷神經(jīng)中的施萬細(xì)胞去分化。

圖2 特異性敲除SEMA3B 可抑制施萬細(xì)胞去分化A-C:體外植塊培養(yǎng)5 d 后檢測(cè)c-Jun 和MAG 蛋白質(zhì)水平表達(dá), n=3 D-F:免疫熒光染色檢測(cè)c-Jun 和MAG 結(jié)果, n=4 *P＜0.05Fig.2 Specific SEMA3B knockout inhibited Schwann cells dedifferentiationA-C: Western blotting showed the protein levels of c-Jun and MAG in the nerve explants, n=3; D-F: Immunofluorescence showed the c-Jun and MAG expression in the cross sections of the nerve explants, n=4;*P＜0.05

2.3 SEMA3B 通過AKT/GSK3β 影響華勒變性

如前所述，文獻(xiàn)顯示SEMA3B 可以影響AKT、GSK3β、ERK、JNK 等信號(hào)分子的表達(dá)，且這些分子與施萬細(xì)胞分化和去分化有密切關(guān)系，所以我們通過蛋白免疫印跡檢測(cè)了這幾個(gè)分子的總蛋白及其磷酸化水平。結(jié)果顯示，Cre 組與cKO 組之間ERK 和JNK的總蛋白和磷酸化水平均無顯著差異。而cKO 組的AKT 和GSK3β 的磷酸化水平（p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β）均顯著低于Cre 組（圖3）。

圖3 Western blotting 顯示AKT、GSK3β、ERK、JNK 總蛋白及其磷酸化水平的差異, n=4,*P＜0.05Fig.3 Western blotting showed the expression level of AKT,GSK3β,ERK,JNK and their phosphorylation levels, n=4,*P＜0.05

為了進(jìn)一步確認(rèn)SEMA3B 敲除是否因?yàn)锳KT 通路活性下降導(dǎo)致華勒變性的進(jìn)展減慢，我們?cè)赾KO組體外模型中添加AKT 激動(dòng)劑（SC79）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與不加激動(dòng)劑的cKO 組相比，加入SC79的cKO 組中NF 陽性軸突和MBP 陽性髓鞘的數(shù)量明顯減少，比較接近Cre 組的水平（圖4A-C）。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示NF 及MBP 的蛋白的變化也呈現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)(圖4D-F)。這些結(jié)果提示，激活A(yù)KT 信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)SEMA3B 條件敲除對(duì)華勒變性的抑制作用。

圖4 SC79 處理對(duì)NF 和MBP 表達(dá)的影響A-C:免疫熒光顯示體外模型中的NF 陽性軸突殘余和MBP 陽性的髓鞘殘余,n=4 D-F:蛋白質(zhì)印跡顯示NF 及MBP 的蛋白水平, n=4 *P＜0.05Fig.4 Effects of SC79 treatment on the NF and MBP expressionA-C: Immunofluoresence showed that the NF positive axons and MBP positive myelin in vitro model, n=4; D-F:Western blotting results of the in vitro model, n=4;*P＜0.05

3 討論

Semaphorin 家族是一類能夠具有軸突指導(dǎo)作用的家族，而SEMA3B 屬于其中的第3 類，主要在軸突指導(dǎo)、血管生成、免疫調(diào)節(jié)以及腫瘤抑制方面起到十分重要的作用[1,5,8]。研究發(fā)現(xiàn)SEMA3B 在神經(jīng)系統(tǒng)中能夠起到調(diào)節(jié)軸突伸長(zhǎng)的作用[17]，但在周圍神經(jīng)損傷華勒變性過程作用卻未見人報(bào)道?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)顯示加速華勒變性在神經(jīng)再生中的作用非常重要[18]。華勒變性主要表現(xiàn)在受損神經(jīng)遠(yuǎn)端的軸突和髓鞘潰變、崩解和被清除[19]。施萬細(xì)胞去分化在上述過程發(fā)揮主要的作用，而文獻(xiàn)提示SEMA3B 已知的下游信號(hào)分子中AKT、ERK 和JNK 能夠調(diào)控施萬細(xì)胞去分化，于是我們推測(cè)SEMA3B 可能通過影響施萬細(xì)胞去分化從而影響華勒變性。

本研究發(fā)現(xiàn)施萬細(xì)胞敲除SEMA3B 小鼠的損傷神經(jīng)中華勒變性減慢，主要表現(xiàn)為殘留的軸突和髓鞘增多。由于周圍神經(jīng)損傷后會(huì)有大量巨噬細(xì)胞被募集到損傷處參與軸突和髓鞘碎片的吞噬和清除。所以僅憑體內(nèi)實(shí)驗(yàn)很難判斷施萬細(xì)胞本身清除軸突和髓鞘碎片的能力如何，因此我們又建立了體外華勒變性模型，這個(gè)模型可以排除巨噬細(xì)胞的募集，軸突和髓鞘碎片的清除主要是依靠施萬細(xì)胞。結(jié)果顯示體外模型得到了與體內(nèi)模型一致的結(jié)果，這就能非常明確提示SEMA3B 在施萬細(xì)胞參加華勒變性過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

接下來本研究檢測(cè)了施萬細(xì)胞的去分化。因?yàn)樵谥車窠?jīng)損傷后的華勒變性過程中，施萬細(xì)胞發(fā)生去分化、增殖、遷移和分泌等活動(dòng)進(jìn)而影響華勒變性和神經(jīng)再生[20]。然而，這些功能都必須是在完成去分化的前提下，所以施萬細(xì)胞去分化的意義重大。本研究的蛋白質(zhì)印跡以及免疫熒光染色結(jié)果均顯示敲除SEMA3B 會(huì)導(dǎo)致c-Jun 表達(dá)下調(diào)而MAG 表達(dá)升高，提示施萬細(xì)胞的去分化程度減慢。隨后對(duì)可能信號(hào)分子的檢測(cè)顯示SEMA3B 敲除并不影響ERK 和JNK 的表達(dá)水平和磷酸化水平，但是降低了p-AKT/AKT 和p-GSK3β/GSK3β 的比值，這些結(jié)果表明SEMA3B 敲除可抑制AKT 和GSK3β 的活化。已知AKT 可以通過GSK3β 對(duì)施萬細(xì)胞的多項(xiàng)生物學(xué)功能發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這提示我們SEMA3B 很有可能是通過AKT/GSK3β發(fā)揮了對(duì)華勒變性的影響。因 為SEMA3B 敲除會(huì)降低AKT 的活性，于是我們使用AKT 的激動(dòng)劑進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示它確實(shí)能逆轉(zhuǎn)SEMA3B 敲除導(dǎo)致的華勒變性減慢。綜合本研究所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出結(jié)論，施萬細(xì)胞敲除SEMA3B 后延緩了華勒變性過程，這可能是SEMA3B施萬細(xì)胞去分化減慢導(dǎo)致的結(jié)果。