基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術(shù)結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)快速篩查3種薊屬藥用植物化學(xué)成分

王宇航，黃曉欣，葉定紅，劉勇*（. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 02488；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 02488；. 寧波甬薊農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 寧波 558）

大薊Cirsium japonicumFisch.ex DC和小薊Cirsium setosum（Willd）MB.大多以全草、地上部分或根入藥，近年來(lái)，大量藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明該屬植物具有保肝、止血、抗炎、抗疲勞等多種藥理作用[1-10]。杭薊Cirsium tianmushanicumShih與兩者同為菊科薊屬植物，是寧海力洋、胡陳一帶的地方用藥，具有顯著的止血、去黃疸、降血壓的功效[8]。

大薊、小薊在《中國(guó)藥典》中的功效主治描述完全一致，未能起到指導(dǎo)臨床應(yīng)用的作用[11-12]。且兩者化學(xué)成分研究大部分都集中于單一成分的分離和鑒定，無(wú)法系統(tǒng)地從成分層面研究大小薊差別；而杭薊因野生資源有限，暫未發(fā)現(xiàn)大規(guī)模群居，其成分和藥效的研究還處于停滯階段，僅憑民間用藥理論無(wú)法為杭薊作為藥用植物提供科學(xué)依據(jù)。

在藥用植物中，許多代謝物具有相同的分子亞結(jié)構(gòu)，并形成不同化學(xué)類(lèi)型的結(jié)構(gòu)相關(guān)分子家族，從而增加了對(duì)藥用植物中復(fù)雜成分體系定性分析的難度。全球天然產(chǎn)物分子網(wǎng)絡(luò)集群數(shù)據(jù)庫(kù)GNPS（Global Ntatural Product Social Molecular Networking，https：//gnps.ucsd.edu/）是在現(xiàn)有的多個(gè)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)基礎(chǔ)上，進(jìn)行新的譜圖注釋，最終建立的包括 272 個(gè)公共數(shù)據(jù)集和8400萬(wàn)個(gè)二級(jí)圖譜的公共數(shù)據(jù)分析平臺(tái)[13]；利用GNPS創(chuàng)建基于各成分質(zhì)譜二級(jí)碎片相似性的分子網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)與液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)相結(jié)合，可以更直觀地觀測(cè)到測(cè)試樣品中所有能夠檢測(cè)到的化合物準(zhǔn)分子離子，反映串聯(lián)質(zhì)譜試驗(yàn)中捕獲的分子多樣性[14]；同時(shí)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因其高通量和高靈敏度多被用于藥用植物成分的快速篩查研究，更有助于復(fù)雜成分體系的定性分析[15-16]。本研究擬采用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜質(zhì)譜結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對(duì)大薊、小薊、杭薊化學(xué)成分進(jìn)行快速篩查鑒定，為后續(xù)薊屬藥用植物的質(zhì)量控制和藥效評(píng)價(jià)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Q-Exactive-Orbitrap-MS四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（美國(guó)Thermo Scientific 公司），配有熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur4.1化學(xué)工作站（美國(guó)Thermo公司）；Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused 超高液相色譜系統(tǒng)（含Chromeleon 7 工作站，Evolution220型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技公司）；Millipore Synergy UV 型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；Sartorious BT 25S型萬(wàn)分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

蘆?。ㄘ浱?hào)B20771-20 mg）、新綠原酸（貨號(hào)B25371-20 mg）、Pectolinarin（貨號(hào)B20249-20 mg）、綠原酸（貨號(hào)B20782-20 mg）、Buddloside（貨號(hào)B20860-20 mg）、槲皮素（貨號(hào)B20527-20 mg）、山柰酚（貨號(hào)B21126-20 mg）（HPLC測(cè)純度均≥98%，上海源葉生物科技有限公司），大薊、小薊（北京同仁堂藥業(yè)公司），杭薊采自浙江寧波，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉勇教授鑒定為菊科薊屬大薊Cirsium japonicumFisch.ex DC，小薊Cirsium setosum（Willd）MB和杭薊Cirsium tianmushanicumShih的干燥地上部分。甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)ishier Scientific公司），質(zhì)譜純甲酸、氯仿（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣品制備

供試品制備：取樣品約1 g研磨（過(guò)4號(hào)篩），精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚適量（50 mL），加熱回流2 h，棄去石油醚液；待藥渣揮干后加入70%甲醇20 mL，索氏提取2 h，濾過(guò)，濾渣用70%甲醇5 mL洗滌，合并洗液與濾液，濃縮溶液至10 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用微孔濾膜（0.45 μm），濾過(guò)，即得。

對(duì)照品制備：稱取山柰酚、綠原酸、蘆丁、Pectolinarin、Buddloside、槲皮素對(duì)照品適量分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得單一對(duì)照品溶液，試驗(yàn)前混合各溶液得混合對(duì)照品溶液，稀釋至各對(duì)照品質(zhì)量濃度為1 mg·L－1。過(guò)0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱 Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動(dòng)相：A為乙腈溶液，B為甲酸水溶液；梯度洗脫（0.0～3.0 min，5%A；3.0～35.0 min，5%～75%A；35.0～40.1 min 75%～5%A；40.1～45 min，5%A）；流速0.3 mL·min－1，柱溫 35℃，進(jìn)樣量3 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

HESI離子源，負(fù)離子檢出模式，掃描范圍m/z50～1500；離子源溫度350℃，電離源電壓4 kV，毛細(xì)管電壓35 V，管透鏡電壓110 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)猓兌龋?9.99%），鞘氣流速40 arb，輔助氣流速20 bar；數(shù)據(jù)采用傅里葉變換高分辨全掃描方式（TF，full scan，Resolution 30 000）數(shù)據(jù)依賴性（data-dependent acquisistion）ddMS2；碰撞模式：運(yùn)用CID和HCD相結(jié)合的碎解方式；碰撞能量：Stepped NCE 50%；母離子列表（parent ion list）PIL-MS2。

3 結(jié)果與分析

3.1 杭薊成分鑒別

按照“2.3”項(xiàng)下方法分析3種薊屬藥用植物提取物，得到其負(fù)離子模式下的總離子流圖（見(jiàn)圖1）。結(jié)合對(duì)照品（見(jiàn)圖2）和參考文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行成分確認(rèn)，在Parallel Reaction Monitoring（PRM）模式下快速篩查到3種植物中的71種化合物。其中包括22種有機(jī)酸類(lèi)、24種黃酮類(lèi)、3種醌類(lèi)、5種三萜類(lèi)、3種揮發(fā)油類(lèi)及14種其他類(lèi)化合物，詳情見(jiàn)表1。

表1 3種植物地上部分化學(xué)成分負(fù)離子模式下質(zhì)譜信息Tab 1 Mass spectrometric information in the above ground part of three plants under negative ion mode

圖1 樣品負(fù)離子模式下的總離子流圖Fig 1 Total ion flow diagram of sample in negative ion mode

圖2 混合對(duì)照品總離子流圖（A）及杭薊中各對(duì)照品提取離子流圖（B）Fig 2 Total ion flow diagram of reference substance（A）and ion flow chart of reference substances extracted from Cirsium tianmushanicum Shih（B）

3.2 對(duì)照品的質(zhì)譜裂解行為

奎寧酸類(lèi)衍生物：結(jié)合參考文獻(xiàn)[17-20]和二級(jí)圖譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在HCD和CID碰撞裂解下，綠原酸和新綠原酸均會(huì)產(chǎn)生m/z191.1571 [M-caffeoyl-H]—和m/z179.3615 [caffeic acid-H]—兩個(gè)特征碎片離子，其中m/z191.1571進(jìn)一步碎裂形成m/z173.2372 [M-caffeoyl-H2O-H]—。兩者的主要裂解區(qū)別是由于?；恢貌煌?，綠原酸產(chǎn)生的碎片離子m/z135.4260的豐度大于新綠原酸。綜上，奎寧酸類(lèi)化合物的質(zhì)譜碎裂規(guī)律主要是圍繞酯鍵斷裂形成奎寧酸母核碎片和各類(lèi)酚酸如咖啡酸、阿魏酸的碎片為主，此類(lèi)衍生物主要結(jié)構(gòu)單元如圖3所示。

圖3 奎寧酸類(lèi)衍生物的結(jié)構(gòu)單元Fig 3 Structure units of quinic acid derivatives

黃酮類(lèi)化合物：根據(jù)參考文報(bào)道[21-23]和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)黃酮化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行歸納總結(jié)：黃酮類(lèi)化合物裂解方式主要為糖苷鍵的解離和黃酮母核C環(huán)的斷裂；對(duì)于糖苷鍵的解離，常存在中性丟失糖殘基而得到苷元離子；對(duì)于黃酮母核上C環(huán)的1/3、1/4、0/2、0/3、0/4 鍵斷裂會(huì)產(chǎn)生i，jA－和i，jB－兩類(lèi)碎片離子[24]。還可以觀察到常見(jiàn)的中性丟失，如 CO（28 Da）、CO2（44 Da）、H2O（18 Da）等中性丟失；分子中帶有甲氧基（·OCH3）等基團(tuán)時(shí)還可以發(fā)生自由基（·CH3，15 Da）丟失。

3.3 奎寧酸衍生物快速篩查

3.3.1 單咖啡?？鼘幩?化合物10、18、22的準(zhǔn)分子離子峰m/z353.0881、353.0893、353.0890，推測(cè)其元素組成為C16H18O9（0.28、0.85、0.57），主要碎片離子m/z191.1571 [M-H-caffeoyl]－、179.3615 [caffeic acid-H]－和173.2372 [M-H-caffeoyl-H2O]－符合咖啡?？鼘幩幔╟affeoylquinic acide，CQA）的裂解規(guī)律，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)（見(jiàn)圖4），推斷化合物10、18分別為綠原酸、新綠原酸；結(jié)合參考文獻(xiàn)[25-27]，當(dāng)?；恢迷?-位時(shí)m/z179.3615豐度比在5-位上高[28]，根據(jù)極性大小和上述規(guī)律初步判斷化合物22為隱綠原酸。CQA類(lèi)化合物具有能清除自由基、抗菌消炎的活性，170 余種具有清熱解毒、抗菌消炎的中成藥均含有CQA且為主要成分[29]。

圖4 奎寧酸類(lèi)衍生物對(duì)照品質(zhì)譜圖以及裂解規(guī)律Fig 4 Standard mass spectra and pyrolysis rules of quinine compounds

3.3.2 雙咖啡酰奎寧酸（DiCQA） 化合物42、46、51準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z515.1224、515.1226、515.1219，推測(cè)其元素組成為C25H24O12（0.78、0.58、0.97），主要碎片離子m/z353.2473 的MS3碎片離子與綠原酸的MS2碎片離子基本一致，初步判斷此類(lèi)化合物為DiCQA，母核結(jié)構(gòu)如表2所示。根據(jù)報(bào)道，4-位取代時(shí)二級(jí)碎片離子基峰為m/z173、而3-位取代的離子碎片m/z179.3613豐度為m/z191.1573的一半、5-位取代時(shí)，m/z179.3617相對(duì)豐度較1-和3-位取代要高，結(jié)合表1中的碎片離子初步推斷化合物42、46、51分別為3、5-O-二咖啡?？鼘幩?、4、5-O-二咖啡?？鼘幩岷?、4-O-二咖啡酰奎寧酸[28]。以3、4-O-二咖啡?？鼘幩釣槔唧w的碎片離子信息和裂解規(guī)律如圖5A所示。

圖5 推斷化合物的質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑Fig 5 Spectrum and possible fragmentation pathway of chemical substances

3.3.3 肉桂?？鼘幩幔╬CoQA） 化合物14、27、31精確準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z337.0931、337.0932、337.7819，分子式C16H18O8，結(jié)合文獻(xiàn)和母離子分子離子質(zhì)量[29]推斷化合物可能為pCoQA類(lèi)化合物。3-pCoQA、5-pCoQA、4-pCoQA二級(jí)碎片離子基峰分別是m/z163.3838、173.7508、191.1561，結(jié)合保留時(shí)間和參考文獻(xiàn)[30-31]判斷化合物14、27、31分別為3-香豆?；鼘幩帷?-香豆?；鼘幩?、4-香豆?；鼘幩?。以3-香豆?；鼘幩釣槔?，其具體的碎片離子信息和裂解規(guī)律見(jiàn)圖5B。

3.3.4 阿魏?？鼘幩幔‵QA） 化合物 20、28、30準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z367.1039、367.1037、367.1021，二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中產(chǎn)生m/z191.3647、191.5971、191.5971 [M-H-feruloyl]－和m/z173.7420、173.5543、173.5543 [M-H-feruloyl-H2O]－等二級(jí)碎片離子，根據(jù)參考文獻(xiàn)和母離子分子離子質(zhì)量推斷為FQA[32]；而根據(jù)基峰的不同可判斷FQA的同分異構(gòu)體3-FQA、4-FQA、5-FQA的二級(jí)碎片基峰分別為m/z193.8710、173.5543和191.5971，初步推測(cè)化合物20、28、30分別為3-O-阿魏酰奎寧酸、4-O-阿魏?？鼘幩帷?-O-阿魏?？鼘幩帷?/p>

從3種菊科薊屬植物中分離出多種以奎寧酸為母核具有藥效活性的化合物，此類(lèi)成分普遍具有抗菌、抗病毒、保肝和心血管保護(hù)等作用[33]，推測(cè)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為奎寧酸衍生物成分群，可能與抗炎保肝作用相關(guān)。

3.4 黃酮類(lèi)化合物快速篩查

化合物33、35、55部分二級(jí)離子與槲皮素碎片離子相同，初步推斷為槲皮素和苷元分別為槲皮素的黃酮苷，3個(gè)化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z609.1458、463.0877、301.0353，結(jié)合對(duì)照品質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖6）和參考文獻(xiàn)[34]分析判斷化合物33、35、55分別為蘆丁、金絲桃苷和槲皮素，其中金絲桃苷裂解途徑如圖5C所示。

圖6 黃酮類(lèi)對(duì)照品質(zhì)譜圖以及裂解途徑Fig 6 Standard mass spectrum of flavonoids and fragmentation pathway

化合物34、36、37、39、40、60準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z593.1523、461.0733、577.2875、593.1523、447.0948、285.0408，上述化合物的MS2均產(chǎn)生m/z285、257等山柰酚對(duì)照品碎片離子相同二級(jí)離子，且主要碎片離子強(qiáng)度與山柰酚對(duì)照品二級(jí)圖譜相同，判斷化合物36、38、40、42、43的苷元為山柰酚或者以山柰酚為苷元的黃酮苷，結(jié)合參考文獻(xiàn)[35]和對(duì)照品初步判斷化合物分別為山柰酚-7-O-新橘皮糖苷、山柰酚葡萄糖醛酸苷、山柰苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山柰酚。以山柰酚葡萄糖醛酸苷為例，其具體的碎片離子信息和裂解規(guī)律。

同理，根據(jù)該類(lèi)化合物在質(zhì)譜條件下有相似的裂解規(guī)律在薊屬植物中共篩查到黃酮類(lèi)化合物24種，詳情見(jiàn)表1。

3.5 3種薊屬植物分子網(wǎng)絡(luò)分析

在快速篩查薊屬植物化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)雜成分的類(lèi)別分析[36-38]。本研究中分別使用綠原酸、山柰酚、蘆丁、槲皮素等對(duì)照品作為“種子”節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分類(lèi)篩選，然后根據(jù)“種子”成分的二級(jí)碎片圖譜進(jìn)而計(jì)算各成分與“種子”成分的相似度，根據(jù)相似度的值進(jìn)行聚類(lèi)分析，并可以在分析的過(guò)程中計(jì)算同一化合物在不同植物中的相對(duì)含量[39]。如圖7所示，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表 1 種化合物，運(yùn)用豐度歸一化算法可以通過(guò)顯示不同顏色所占面積的大小表示該化合物在不同樣品中的相對(duì)含量[40]。結(jié)果將網(wǎng)絡(luò)圖劃為A、B、C、D 4個(gè)主要簇，A區(qū)域中檢測(cè)到的所有化合物都含有m/z191奎寧酸碎片離子，對(duì)照品山柰酚、新綠原酸出現(xiàn)在該區(qū)域；B區(qū)域主要為蒽醌母核碎片離子m/z208、180[41]；C區(qū)域所有化合物都含有m/z300碎片離子，對(duì)照品蘆丁、槲皮素出現(xiàn)在該區(qū)域；D區(qū)域所有化合物都含有m/z285的山柰酚碎片離子，對(duì)照品山柰酚出現(xiàn)在該區(qū)域。同時(shí)也在各區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)準(zhǔn)分子離子峰m/z505.2981、415.0897、823.4723等一系列未知化合物，由于暫無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，難以確定相關(guān)構(gòu)型，有待后續(xù)通過(guò)制備分離和核磁鑒定等方法進(jìn)行研究。

圖7 3種薊屬中主要成分網(wǎng)絡(luò)圖Fig 7 Molecular network of main compounds from 3 Cirsium mill medicinal plant

3.6 基于分子網(wǎng)絡(luò)分析主要化合物在3種薊屬中的分布情況

奎寧酸類(lèi)在3種薊屬植物的分布較廣，新綠原酸、綠原酸、3，4-O-二咖啡酰基奎寧酸甲酯、3-O-阿魏?？鼘幩岬榷挤植荚诖笏E、小薊、杭薊3種薊屬中，在大薊、杭薊中奎寧酸類(lèi)化合物相對(duì)含量較高；蒽醌類(lèi)化合物分布差異較明顯、主要分布在小薊中，主要成分蘆薈大黃素在小薊中含量也相對(duì)較高；C、D區(qū)域中黃酮類(lèi)化合物在大薊、小薊中分布較廣，特別是以山柰酚為苷元的黃酮苷類(lèi)化合物在小薊中具有較高的相對(duì)含量。上述相比于大薊、小薊在相對(duì)含量上具有一定程度差異的成分可能是未來(lái)研究杭薊藥理作用并區(qū)別于大薊、小薊藥效的重要有效成分。

在已篩查化合物中，共有36個(gè)化合物是3種薊屬植物的共有成分；43個(gè)化合物為大薊和小薊的共有成分；杭薊與大薊、小薊的共有成分分別為39個(gè)、38個(gè)化合物，結(jié)合圖7所示，對(duì)3種薊屬植物中成分分布研究得出，大薊、小薊、杭薊3種薊屬相似度較高，前兩者可在臨床用藥中替代入藥，而杭薊作為寧海力洋、胡陳一帶傳統(tǒng)民間滋補(bǔ)藥材在成分層面上證明了具有一定的藥用價(jià)值，為今后進(jìn)一步闡明杭薊藥效提供了科學(xué)依據(jù)。

4 討論

本研究利用UHPLC-Q-Exactive-Plus-Orbitrap-MS結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)首次對(duì)大薊、小薊、杭薊中的化學(xué)成分進(jìn)行快速定性鑒別，通過(guò)對(duì)照品、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照和質(zhì)譜裂解規(guī)律共快速篩查出3種植物71種化合物，包括22種有機(jī)酸類(lèi)、24種黃酮類(lèi)、3種醌類(lèi)、5種三萜類(lèi)、3種揮發(fā)油類(lèi)及14種其他類(lèi)化合物，并使用分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對(duì)有效成分進(jìn)行相對(duì)含量的評(píng)價(jià)，對(duì)質(zhì)譜復(fù)雜體系的成分量化有一定的參考價(jià)值[42]。但不足之處在于ESI作為一種軟電離方式，不同單體成分的離子化效率不同，量化的結(jié)果存在一定的誤差，后續(xù)還需要通過(guò)對(duì)照品進(jìn)行絕對(duì)含量的比較。

大薊、小薊作為傳統(tǒng)藥用植物，為同科不同屬植物，本研究提供了兩者主要有效成分的異同，為大薊、小薊后續(xù)的藥效研究從化學(xué)成分水平上提供思路。而研究結(jié)果同時(shí)表明杭薊在有效成分層面上與成熟的藥用植物大薊、小薊高度相似，具有較高的臨床研究?jī)r(jià)值和藥用潛力，有利于杭薊作為藥用植物更好地推廣，并為在當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益和科技成果轉(zhuǎn)化作出貢獻(xiàn)。本研究進(jìn)一步加深了對(duì)薊屬植物的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)薊屬藥用植物的質(zhì)量控制和藥理作用研究提供了科學(xué)依據(jù)。