基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討PP2治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

張浩 趙琦 李曉強(qiáng) 黃昊 李奕廷 劉佳

【摘要】 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究PP2對骨性關(guān)節(jié)炎（OA）的潛在治療作用及具體機(jī)制。方法 從PharmMappe和Swiss target prediction在線數(shù)據(jù)庫中收集PP2靶點(diǎn)，而致病性O(shè)A靶點(diǎn)則從GeneCards databases、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、PharmGkb、Therapeutic Target Database（TTD）、DrugBank 5個在線數(shù)據(jù)庫中獲得。通過VENNY在線工具找出PP2和OA的交集基因，通過基因分類學(xué)（gene ontology，GO）、京都基因和基因組百科全書 （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，預(yù)測與PP2相關(guān)的潛在功能和信號通路。構(gòu)建PP2的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以篩選出PP2的核心基因。通過分子對接模擬研究驗(yàn)證預(yù)測；通過大鼠軟骨細(xì)胞中加不同濃度PP2（0，20 μM），然后進(jìn)行qRT-PCR對差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 PP2中的活性成分221個，與疾病共同靶基因?yàn)?7個，其中篩選出核心靶基因15個。GO富集和KEGG通路富集中涉及MAPK信號通路、EGFR信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路、JAK-STAT信號通路、AGE-RAGE信號通路和ErbB信號通路等多種信號通路。結(jié)論 PP2能夠調(diào)節(jié)多種信號通路從而達(dá)到治療OA的作用。其中mTOR、EGFR、SRC、MAPK8、PIK3CA、MAPK14、SDHA、EGF、CREBBP JAK1、CSNK2A2、ERBB2、PDGFRA、KIT和SOD2基因是值得關(guān)注的靶基因。MAPK信號通路和PI3K-Akt信號通路是主要調(diào)控通路。

【關(guān)鍵詞】 骨性關(guān)節(jié)炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；PP2；MAPK信號通路；PI3K-Akt信號通路

中圖分類號：R684.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.05.004

【Abstract】 Objective To explore the potential therapeutic effect and mechanism of PP2 on osteoarthritis （OA） based on network pharmacology.Methods PP2 targets were collected from PharmMappe and Swiss target prediction online databases. However， pathogenic OA targets were obtained from 5 online databases， namely， GeneCards databases， Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM）， PharmGkb， Therapeutic Target Database （TTD） and DrugBank online databases. The intersection genes of PP2 and OA were found by VENNY online tool. And then， the potential functions and signal pathways related to PP2 were predicted by gene ontology （GO） and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） enrichment analysis. The protein interaction network of PP2 was constructed to screen the core genes of PP2. Then， the prediction was verified by molecular docking simulation. Different concentrations of PP2 （0， 20 μM） were added to rat chondrocytes， and then the differential genes were confirmed by qRT-PCR.Results There were 221 active components in PP2， and 67 shared common target genes with the disease， of which 15 core target genes were screened. GO enrichment and KFGG pathway enrichment involved many signal pathways， such as MAPK signal pathway， EGFR signal pathway， PI3K-Akt signal pathway， Ras signal pathway， Rap1 signal pathway， JAK-STAT signal pathway， AGE-RAGE signal pathway and ErbB signal pathway， etc.Conclusion PP2 can regulate various signal pathways to achieve therapeutic effects on OA. mTOR， EGFR， SRC， MAPK8， PIK3CA， MAPK14， SDHA， EGF， CREBBP JAK1， CSNK2A2， ERBB2， PDGFRA， KIT and SOD2 genes are target genes which are worthy of attention. MAPK signalling pathway and PI3K-Akt signalling pathway are main regulatory pathways.

【Key words】 osteoarthritis （OA）; network pharmacology; PP2; MAPK signaling pathway; PI3K-Akt signaling pathway

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種能夠嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，多見于中老年人，并隨年齡增長其發(fā)病率也呈增長趨勢［1］。盡管我們已經(jīng)知道，在OA的發(fā)生發(fā)展過程中，多種因素對其有影響，如遺傳、代謝、環(huán)境和創(chuàng)傷等［2］，但其具體的發(fā)病分子機(jī)制尚未有明確的闡述。近年來研究人員對OA發(fā)病的具體機(jī)制研究越來越多［3］，認(rèn)為在OA的不同發(fā)病階段可能存在多種致病機(jī)制［4］，但到目前為止還未找到有效的疾病治療方法。

PP2是一種可逆的ATP競爭性Src家族激酶抑制劑，Lck和Fyn的IC50分別為4 nM和5 nM［5］。有報道表明PP2在抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗炎等方面都具有一定作用［6-7］，并且能在多靶點(diǎn)上對疾病的發(fā)展產(chǎn)生影響［8-9］。PP2的這些效果表明，它可能在OA中發(fā)揮積極作用。但PP2對OA的具體治療機(jī)制未有過報道，所以，為了弄清PP2與OA的相互作用靶點(diǎn)，并闡明其具體機(jī)制，有必要對其進(jìn)行進(jìn)一步探索。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新的藥理學(xué)分析方法，能夠研究藥物的潛在靶點(diǎn)和相互作用［10］。因此在OA治療藥物的開發(fā)中發(fā)揮很大作用［11］。考慮到PP2可以通過多種靶點(diǎn)影響疾病進(jìn)程，所以通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究PP2在OA中的潛在作用機(jī)制是非常有價值的。因此，本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和大鼠軟骨細(xì)胞，研究PP2對OA的影響，并探索其潛在機(jī)制，以便為了解PP2治療OA和藥物多靶點(diǎn)提供新的觀點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 PP2和OA相關(guān)靶點(diǎn)的收集

利用PharmMappe（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和Swiss target prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）在線數(shù)據(jù)庫中收集PP2靶點(diǎn)［12］。先從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中檢索到PP2的2D結(jié)構(gòu)，然后使用PharmMappe和Swiss Target Prediction database預(yù)測可能存在的靶點(diǎn)。OA相關(guān)靶基因從GeneCards databases（https：//www.genecards.org/）、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）（https：//omim.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、Therapeutic Target Database（TTD）（https：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/） 5個數(shù)據(jù)庫中收集。合并5個數(shù)據(jù)庫并刪除重復(fù)基因得到OA相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 候選靶點(diǎn)的確定

為了了解PP2的有關(guān)靶點(diǎn)和OA相關(guān)靶點(diǎn)之間的相互作用，使用jvenn（https：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html）在線工具，以獲得PP2和OA的共同靶點(diǎn)，并繪制Venn圖［13］和PP2治療OA 的潛在靶點(diǎn)列表。

1.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更好地了解PP2治療OA的分子機(jī)制，將PP2和OA的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.5數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型［14］。物種設(shè)置為人，置信度的最小交互閾值設(shè)定＞0.7，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中，用以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，使用APP-CytoNCA評估PP2在治療OA中的核心靶點(diǎn)。按介數(shù)中心性（Betweenness）值＞90歸為核心靶點(diǎn)，同時將核心節(jié)點(diǎn)設(shè)為紅色［15］。

1.4 GO和KEGG富集分析

使用R/Bioconductor clusterProfiler（版本4.2.1），基因分類學(xué)（GO）、京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，對PP2和OA重疊基因進(jìn)行功能注釋和通路富集分析。富集GO項(xiàng)分為生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）。

1.5 利用分子對接驗(yàn)證PP2與靶點(diǎn)的相互作用

通過分子對接模擬每個假定靶點(diǎn)與PP2相互作用來驗(yàn)證PP2與靶點(diǎn)的結(jié)合。確定小分子配體，先從PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索出PP2的2D結(jié)構(gòu)，使用ChemBio3D（版本14.0.0.117）將PP2的2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)。蛋白受體的準(zhǔn)備，將預(yù)測的靶點(diǎn)基因輸入PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/），下載基因蛋白PDB格式的三維結(jié)構(gòu)，通過PyMOL（版本2.4.0）軟件去除水分子和小分子配體，然后使用AutoDock工具（版本1.5.6）對其添加極性氫，同時將受體和配體都轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。使用AutoDock Vina軟件（版本1.1.2）進(jìn)行對接計算。對接結(jié)構(gòu)中自由能最低的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是最佳對接構(gòu)象，然后使用PyMOL（版本2.4.0）進(jìn)行可視化。

1.6 SD大鼠軟骨細(xì)胞的分離

超凈臺下取剛出生1～3天小鼠的肋軟骨，剝離組織后加入胰酶37 ℃消化30 min，然后使用Ⅱ型膠原酶繼續(xù)37 ℃消化過夜。第二天經(jīng)100 μm濾網(wǎng)過濾后，在1000 rmb下離心5 min。軟骨細(xì)胞在含10%FBS的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.7 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

用TRIzol試劑（Life Technologies）從軟骨細(xì)胞中提取總RNA。使用NanoDrop分光光度計（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）測量RNA濃度?？俁NA（每個樣本1 μg）使用 PrimeScriptTMRT-PCR kit （Takara，Shiga，Japan）根據(jù)制造商說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃冷卻。隨后使用SYBR-green試劑和適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行RT-PCR。PCR熱循環(huán)條件為：95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40次循環(huán)。采用2-ΔΔCq方法進(jìn)行比較定量評估。對于每個目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平歸一化為β-actin，并表示為相對于指示對照的折疊變化。qRT-PCR所用引物見表1。

1.8 Western blotting

軟骨組織標(biāo)本和軟骨細(xì)胞在含有PMSF、蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Keygen）的RIPA裂解緩沖液中裂解。將蛋白與負(fù)載緩沖液混合，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE處理，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在TBST中封閉1 h后，用一抗檢測印跡。用Western blot法測定靶蛋白collagen Ⅱ（1∶1000，ab188570，Abcam，USA），Aggrecan（1∶1000，ab36861，Abcam，USA），SOX9（1∶1000，A19710，ABclonal，China），ADAMTS5（1∶250，ab41037，Abcam，USA），MMP13（1∶1000，18165-1-Ap，Proteintech，China），MMP9（1∶1000，ab283575，Abcam，USA），GAPDH（1∶10000，ab181602，Abcam，USA）相對于對照GAPDH的表達(dá)水平。結(jié)合抗體用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗體檢測，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑觀察。使用ImageJ軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行密度分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS（25.0版本，IBM公司）和Graph Prism Software（8.0版本，圖棱鏡軟件公司）。兩組樣本的比較采用雙向方差分析，然后采用Tukey檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 PP2活性成分和共同靶基因分析

從PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索到PP2的2D結(jié)構(gòu)（如圖1A），將PP2的2D結(jié)構(gòu)錄入PharmMappe和Swiss target prediction在線數(shù)據(jù)庫中，并收集PP2相關(guān)靶基因，共獲得221個基因。OA相關(guān)靶基因從GeneCards databases、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、PharmGkb、Therapeutic Target Database（TTD）、DrugBank 5個數(shù)據(jù)庫中收集。合并5個數(shù)據(jù)庫并刪除重復(fù)基因共獲得2343個OA相關(guān)基因。使用jvenn在線工具繪制韋恩圖，共得到67個交集基因（如圖1B）。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因分析

將PP2和OA的交集基因?qū)氲絊TRING 11.5數(shù)據(jù)庫中，把物種設(shè)置為人，置信度的最小交互閾值設(shè)定＞0.7，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖（如圖2A）。然后將結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape軟件中，用以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，再使用CytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)中BC進(jìn)行分析得到核心靶點(diǎn)。其中紅色代表核心靶點(diǎn)，共得到15個最相關(guān)基因（如圖2B）。

2.3 GO 和 KEGG富集分析

使用R/Bioconductor clusterProfiler軟件，并按照P≤0.05，Q≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行富集。GO富集結(jié)果顯示，在BP上主要富集在肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸修飾、激酶活性的正向調(diào)節(jié)等項(xiàng)目；在CC方面主要富集在膜筏、膜微域、焦點(diǎn)粘連等項(xiàng)目；在MF上主要富集在蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等項(xiàng)目（如圖3A）。KEGG通路富集分析顯示，主要富集在PI3K-Akt信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、卡波西肉瘤-相關(guān)的皰疹病毒感染、胰腺癌、表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等通路上（如圖3B）。

2.4 驗(yàn)證PP2與靶點(diǎn)的相互作用

通過分子對接模擬PIK3CA、MAPK8、EGFR和SRC四種靶點(diǎn)與PP2相互作用來驗(yàn)證PP2與靶點(diǎn)的結(jié)合。通常認(rèn)為，結(jié)合能越低，結(jié)合親和力越高。我們的結(jié)果顯示，所選定的四種靶點(diǎn)與PP2的最小結(jié)合能都遠(yuǎn)低于-5.0 kJ/mol。與PIK3CA對接后的結(jié)合能為-8.9；與MAPK8對接后的結(jié)合能為-7.6；與EGFR對接后的結(jié)合能為-6.8；與SRC對接后的結(jié)合能為-6.5。圖4為對接結(jié)果的可視化，分子對接結(jié)果表明，PP2與這四種核心靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合力。

2.5 PP2能夠促進(jìn)軟骨生成

為了確定PP2是否促進(jìn)軟骨生成，提取大鼠原代軟骨細(xì)胞，加入不同濃度的（0，20 μM PP2共處理24小時后，提取細(xì)胞總RNA和蛋白進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，PP2顯著上調(diào)了軟骨生成的主轉(zhuǎn)錄因子SOX9，也上調(diào)了COL2A1和Aggrecan，同時下調(diào)了ADAMTS5、MMP13和MMP9水平（如圖5A）。Western blotting 結(jié)果也得到相同結(jié)論（如圖5B）。

3 討 論

PP2是一種SRC家族激酶廣泛抑制劑，在抗腫瘤、抗炎、抗氧化應(yīng)激方面都有一定作用。PP2可抑制肺癌A549細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113等癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［16-17］。SRC激酶抑制劑PP2對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用。PP2還可顯著改善LPS誘導(dǎo)的腎功能喪失和包括炎癥及氧化應(yīng)激在內(nèi)的損傷，同時還能降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8等的表達(dá)。研究表明，PP2能夠抑制EGFR、JAM-A Y280和酪氨酸等的磷酸化［18］。OA是一種最常見的關(guān)節(jié)疾病，能夠嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)OA的不同發(fā)病階段可能存在多種致病機(jī)制，包括TGF-β通路、NF-kB通路、β-catenin通路和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路等，但到目前為止還未找到一種有效的用于臨床的治療藥物。

在本研究中，我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PP2和OA的交集基因有67種。PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果顯示，mTOR、EGFR、SRC、MAPK8、PIK3CA、MAPK14、SDHA、EGF、CREBBP JAK1、CSNK2A2、ERBB2、PDGFRA、KIT和SOD2為最核心靶點(diǎn)。mTOR是細(xì)胞代謝的主要調(diào)節(jié)因子，它能控制細(xì)胞的生長、增殖和存活。mTOR包含兩種不同的復(fù)合物：mTORC1和mTORC2［19］。研究發(fā)現(xiàn)滑膜中mTORC1的活化增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞，并加重了膠原酶誘導(dǎo)的OA的癥狀［20］。EGFR是OA中最值得研究的信號通路之一。軟骨中缺乏EGFR會導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨表面缺陷，明顯加重OA發(fā)展［21］。MAPK是細(xì)胞病理學(xué)和生理學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子，在軟骨分化過程中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，通過部分抑制p38/ERK MAPK和p65/NF-κB信號傳導(dǎo)可起到緩解OA進(jìn)展的作用［21］。以上說明這些核心基因在OA進(jìn)展過程中都起著重要調(diào)節(jié)作用。

GO富集分析表明，PP2和OA的交集基因，在BP上能夠調(diào)節(jié)肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸修飾、激酶活性的正向調(diào)節(jié)和MAPK級聯(lián)反應(yīng)的正向調(diào)控等項(xiàng)目。在CC方面能調(diào)節(jié)膜筏、膜微域、焦點(diǎn)粘連和細(xì)胞-底物連接等項(xiàng)目。在MF方面能夠調(diào)節(jié)蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和跨膜受體蛋白激酶活性等項(xiàng)目。KEGG通路富集分析表明，核心基因?qū)I3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、JAK-STAT信號通路和AGE-RAGE信號通路等起到調(diào)節(jié)作用。其中PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路和EGFR信號通路值得我們重點(diǎn)關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞方面，低濃度（10 μM）下PP2對癌細(xì)胞增殖的影響不顯著，超過20 μM濃度時癌細(xì)胞生長越來越受到抑制，這一發(fā)現(xiàn)與其他人類癌細(xì)胞系的報告一致［22］。所以我們在大鼠原代軟骨細(xì)胞中加入PP2（20 μM）后，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，通過qRT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PP2能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生成，同時下調(diào)了降解細(xì)胞基質(zhì)的蛋白，如ADAMTS5、MMP13和MMP9。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為PP2治療OA提供新的方法。本研究結(jié)果也表明，PP2可通過調(diào)控多種靶基因，達(dá)到多途徑、多種通路緩解OA進(jìn)展。但本次研究還存在一定局限性，由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是從在線數(shù)據(jù)庫中獲取并進(jìn)行分析，其數(shù)據(jù)的實(shí)時性存在局限性，導(dǎo)致預(yù)測結(jié)果不同。所以后期還會進(jìn)行更多、更全面的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-12-11 修回日期：2023-02-15）

（編輯：潘明志）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32160209，82160357）

作者簡介：張浩，男，在讀碩士研究生，研究方向：骨與關(guān)節(jié)退行性疾病研究。E-mail：251084491@qq.com

通信作者：劉佳。E-mail：634886252@qq.com