病毒樣顆粒疫苗在豬病防控中的應(yīng)用

楊希川

（山東省臨沭縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東臨沂 276700）

病毒樣顆粒（VLPs）是一種空心顆粒，由病毒結(jié)構(gòu)蛋白自動(dòng)組合而成，結(jié)構(gòu)蛋白可以是1 個(gè)或多個(gè)，在形態(tài)上與天然病毒粒子相似，被稱為“假病毒”或“偽病毒”。病毒樣顆粒雖然具有較強(qiáng)的免疫原性，但沒有傳染性，其主要通過與病毒感染一致的途徑呈遞到T、B淋巴細(xì)胞群體中，從而對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)進(jìn)行誘導(dǎo)[1]?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外針對(duì)動(dòng)物的病毒性疾病，至少研發(fā)了35 種病毒樣顆粒疫苗進(jìn)行預(yù)防。豬傳染性疾病種類較多，對(duì)生豬養(yǎng)殖產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，科學(xué)防控豬傳染性疾病是穩(wěn)定養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要任務(wù)。疫苗是防控動(dòng)物疾病的最佳方法，但是也會(huì)產(chǎn)生一定的副作用，如疫苗所選用輔料溶劑的純度、安全性及弱毒疫苗的返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)等。因此，科研人員需要對(duì)疫苗研發(fā)多加關(guān)注，為研發(fā)更多安全的疫苗而努力。近年來，隨著DNA 應(yīng)用技術(shù)的不斷發(fā)展和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，用于豬病防控的新型疫苗數(shù)量逐漸增多，病毒樣顆粒疫苗也逐漸受到關(guān)注。本文以幾種常見的豬病為切入點(diǎn)，對(duì)病毒樣顆粒疫苗在豬病防控中的應(yīng)用進(jìn)展加以分析，為養(yǎng)豬企業(yè)在疫苗選擇方面提供參考。

1 病毒樣顆粒及其表達(dá)系統(tǒng)

病毒樣顆粒是由一種或多種組織蛋白、衣殼蛋白通過自我組裝而成的，具有特定空間構(gòu)象的空心顆粒，直徑約為20～150 nm，不含遺傳物質(zhì)和病毒核酸，既不能自主復(fù)制，也不具有感染力，但是該空間結(jié)構(gòu)和形態(tài)與活病毒極其相似，具有納米材料特性[2]。根據(jù)病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)，可將其分為2 類，一類是無囊膜病毒樣顆粒，一類是有囊膜病毒樣顆粒。無囊膜病毒樣顆粒不含宿主成分，主要是由病毒衣殼蛋白自我組裝而成，如豬圓環(huán)病毒、乙肝病毒、人類乳頭狀瘤病毒的衣殼蛋白均能形成無囊膜病毒樣顆粒[3]。有囊膜病毒樣顆粒由表面宿主細(xì)胞膜、衣殼蛋白組成，其可同時(shí)對(duì)異源病原體及同源病原體的多種抗原進(jìn)行整合，并從細(xì)胞膜中釋放，如丙肝病毒、流感病毒可形成有囊膜的病毒樣顆粒。病毒樣顆粒有3 個(gè)突出的優(yōu)勢(shì)：一是病毒樣顆粒以基因工程或者化學(xué)交聯(lián)等方式對(duì)自身結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾（或改造）；二是病毒樣顆粒能夠?qū)怂岱肿樱姾蓴?shù)量適中）、非核酸分子及分子質(zhì)量進(jìn)行包裹；三是部分病毒的病毒樣顆?？煞謩e在原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行自我組裝。上述優(yōu)勢(shì)的發(fā)現(xiàn)，為病毒樣顆粒疫苗的研發(fā)提供一定支持?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)，病毒樣顆粒在制備過程中，表達(dá)系統(tǒng)的選擇對(duì)其產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，在不同表達(dá)系統(tǒng)中，衣殼蛋白特性存在較大差異，因此，對(duì)其組裝和折疊產(chǎn)生一定影響[4]。自20 世紀(jì)80 年代開始，病毒樣顆?？乖磉_(dá)中已經(jīng)廣泛使用了多種表達(dá)系統(tǒng)，在已經(jīng)成功表達(dá)的病毒樣顆粒中，植物類、哺乳動(dòng)物類、酵母類、昆蟲細(xì)胞類、細(xì)菌類等的病毒樣顆粒占比分別為9%、15%、20%、28%、28%。

2 病毒樣顆粒疫苗在豬病防控中的應(yīng)用

2.1 對(duì)豬圓環(huán)病毒病的防控研究

在豬圓環(huán)病毒病中，2 型豬圓環(huán)病毒（PCV2）是引起6～12 周齡仔豬PMWS 的典型病原。目前，PCV2 的感染嚴(yán)重危害生豬健康，對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成不良影響。趙曉云等[5]根據(jù)PCV2 ORF2 基因的編碼特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)PCV2免疫原性蛋白Cap 能夠在體外自我合成病毒樣顆粒，結(jié)合SUMO 表達(dá)技術(shù)，首次體外制備成Cap 蛋白病毒樣顆粒，為豬圓環(huán)病毒病病毒樣顆粒疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)，并且通過其他學(xué)者的驗(yàn)證表明，PCV2 病毒樣顆粒疫苗能夠?qū)C(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生刺激作用，并且具有刺激機(jī)體體液產(chǎn)生免疫反應(yīng)的功能[6]。徐 嫄等[7]研究發(fā)現(xiàn)，采用Bac-to-Bac 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，能夠獲得PCV2b 重組桿狀病毒，其感染HighFiveTM 細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)中檢測到相關(guān)蛋白，并且自動(dòng)組裝成病毒樣顆粒，直徑在15～17 nm，此研究從側(cè)面證實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液中存在大量病毒樣顆粒，為目的蛋白純化處理及疫苗研制提供了理論基礎(chǔ)。王宇[8]研究發(fā)現(xiàn)，在無免疫佐劑的遷移下，用帶有2 型豬圓環(huán)病毒抗原表位的豬細(xì)小病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠，不僅能夠誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生2 型豬圓環(huán)病毒特異性的CTLA 反應(yīng)，還能使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生豬細(xì)小病毒特異性抗體，并且這種抗體是高效價(jià)的。何至遠(yuǎn)等[9]研究證實(shí)，將2 型豬圓環(huán)病毒ORF2 蛋白插入豬細(xì)小病毒VP2 蛋白的2 個(gè)位點(diǎn)，形成了2 個(gè)重組體，該重組體對(duì)病毒樣顆粒疫苗位點(diǎn)的形成并不產(chǎn)生影響，且具有較好的免疫原性，為病毒樣顆粒多價(jià)疫苗研制找到理論根據(jù)。

2.2 對(duì)豬細(xì)小病毒病的防控研究

Cartwright 首次在流產(chǎn)母豬體內(nèi)分離到豬細(xì)小病毒，其基因組內(nèi)包含ORF，且從進(jìn)化角度看，豬細(xì)小病毒NS 序列相對(duì)保守，編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白在豬細(xì)小病毒DNA 復(fù)制上發(fā)揮一定作用[10]。普遍認(rèn)為，引發(fā)母豬繁殖障礙的主要病原就是豬細(xì)小病毒，感染此病毒后，可引起胚胎及胎兒死亡，增加母豬流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[11]。對(duì)于豬細(xì)小病毒，傳統(tǒng)疫苗以滅活疫苗為主，也包括弱毒苗，如NADL-2 弱毒株疫苗。國外學(xué)者Paul 等人收集豬細(xì)小病毒強(qiáng)毒株，并對(duì)其進(jìn)行了50 余次的細(xì)胞連續(xù)傳代，獲得用于制備弱毒苗的豬細(xì)小病毒弱毒株，最終發(fā)現(xiàn)經(jīng)口鼻為母豬接種弱毒苗后，致弱的豬細(xì)小病毒無法直接經(jīng)過胎盤感染胎兒；而經(jīng)子宮內(nèi)接種致弱的豬細(xì)小病毒，則可對(duì)胎兒造成感染，甚至引發(fā)胎兒死亡，這也導(dǎo)致弱毒苗的應(yīng)用被限制在非妊娠母豬中[12]。豬細(xì)小病毒基因組編碼中共包含VP1、VP2、VP3 等3 種結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP2 具有中和抗體的功能，是構(gòu)成病毒粒子的主要靶蛋白（衣殼蛋白），豬細(xì)小病毒VP2 結(jié)構(gòu)蛋白基因免疫原性良好，可在哺乳動(dòng)物桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行體外表達(dá)，從而形成病毒樣顆粒，對(duì)中和抗體的生成起到誘導(dǎo)作用，具有高穩(wěn)定性，可替代傳統(tǒng)的豬細(xì)小病毒病疫苗[13]。根據(jù)上述研究結(jié)果，陸續(xù)又有多位學(xué)者將豬細(xì)小病毒VP2 基因克隆到桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，經(jīng)蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果顯示，成功獲取了豬細(xì)小病毒類病毒粒子，并誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體[14]。還有學(xué)者將豬細(xì)小病毒VP2 基因成功在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，同時(shí)通過體外裝配方式形成病毒樣顆粒，經(jīng)驗(yàn)證，其免疫效果良好。

2.3 對(duì)豬傳染性胃腸炎的防控研究

TGEV 是引發(fā)豬傳染性胃腸炎的主要病原，感染后可導(dǎo)致病豬出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，同時(shí)伴有嘔吐、脫水癥狀，具有高度的傳染性，低于2 周齡的仔豬患豬傳染性胃腸后，病死率高達(dá)100%，對(duì)生豬養(yǎng)殖造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[15]。研究發(fā)現(xiàn)，體外共表達(dá)的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）中含有sM 蛋白和M 蛋白，可形成病毒樣顆粒，可對(duì)干擾素-α 產(chǎn)生誘導(dǎo)效果，對(duì)豬傳染性胃腸炎具有防御作用[16]。有學(xué)者通過家蠶BAC-to-BAC 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)了具有sM 蛋白、N 蛋白和M 蛋白的重組病毒，且病毒樣顆粒體外組裝試驗(yàn)結(jié)果顯示，M 蛋白在sf9 細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)，且M 蛋白分別于sM 蛋白、N 蛋白共表達(dá)，均可組裝成病毒樣顆粒，但是大小不盡相同，為研究和制備預(yù)防豬傳染性胃腸炎的病毒樣顆粒疫苗提供理論依據(jù)[17]。

2.4 對(duì)豬乙型腦炎的防控研究

在眾多豬病中，豬乙型腦炎是一種人畜共患傳染病，日本腦炎病毒（JEV）是引發(fā)豬乙型腦炎的重要病原，日本腦炎病毒E 蛋白中包含ED-Ⅲ結(jié)構(gòu)，即結(jié)構(gòu)域-Ⅲ，該區(qū)域負(fù)責(zé)對(duì)中和抗體進(jìn)行誘導(dǎo)。體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)域-Ⅲ中l(wèi)oop3 環(huán)肽可對(duì)病毒感染進(jìn)行有效抑制，小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，loop3 環(huán)肽能夠發(fā)揮最強(qiáng)保護(hù)作用[18]。秦佳儀[19]深入研究證實(shí)，在乙肝病毒（HBV）中，乙肝核心蛋白（HBC）是該蛋白的核心結(jié)構(gòu)，其不僅能夠在真核細(xì)胞中被高效表達(dá)，同時(shí)可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)，并且自動(dòng)裝配成病毒樣顆粒。試驗(yàn)結(jié)果表明，在乙肝核心蛋白特定部位插入短肽序列（外源性loop3 環(huán)肽），不僅不會(huì)對(duì)乙肝核心蛋白的構(gòu)象產(chǎn)生影響，同時(shí)也不會(huì)限制其自我組裝，并且短肽能夠以多次重復(fù)形式出現(xiàn)在病毒樣顆粒的表面，使表位肽自身免疫原性得到大幅強(qiáng)化。因此，將loop3 環(huán)肽基因與乙肝核心蛋白基因進(jìn)行重組，病毒樣顆?？梢暈槊庖咻d體，進(jìn)一步強(qiáng)化loop3 環(huán)肽表位的免疫抗原性。通過上述研究結(jié)果，國內(nèi)學(xué)者將乙肝核心蛋白作為載體，重組HBC-loop3，經(jīng)過純化處理后，采用透射電鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)大量病毒樣顆粒，為豬乙型腦炎病毒樣顆粒疫苗的研制提供了思路。

2.5 對(duì)豬瘟防控的研究

豬瘟是常見的豬急性傳染性疾病，傳播速度快，死亡率高，尤其非洲豬瘟。我國2018 年8 月在沈陽市首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫病，隨后短時(shí)間內(nèi)在我國多個(gè)省份點(diǎn)狀發(fā)病，導(dǎo)致我國生豬存欄急劇下降，對(duì)我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重影響。

引發(fā)豬瘟的主要病原為豬瘟病毒（CSFV），該病毒主要包括多肽E290 及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。有研究發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒中含有的CTL 細(xì)胞表位，不僅在細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用，同時(shí)對(duì)體液免疫也產(chǎn)生影響。范京惠等[20]利用共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9 對(duì)桿狀病毒進(jìn)行重組，并在體外進(jìn)行表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白不僅具備天然蛋白的生物學(xué)特征，同時(shí)能夠自我組裝并形成病毒樣顆粒，在無免疫佐劑的基礎(chǔ)上對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，成功在小鼠機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)出高效價(jià)抗豬瘟病毒的特異CTL 反應(yīng)，經(jīng)對(duì)比試驗(yàn)證實(shí)，其抗體效應(yīng)明顯比滅活疫苗要高。Kurtovic 等[21]用乳酸菌表達(dá)了豬瘟病毒CTL 細(xì)胞表位，成功誘導(dǎo)出豬黏膜免疫反應(yīng)，可幫助生豬抵抗致死劑量豬瘟病毒的攻擊。

2.6 對(duì)其他豬病防控的研究

病毒樣顆粒疫苗在其他豬病防控中的應(yīng)用研究也有一定進(jìn)展，如豬偽狂犬病、口蹄疫、豬藍(lán)耳病等[22]。如國內(nèi)研究者利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒的N 蛋白、M 蛋白以及GP5、GP2b，并證實(shí)M 蛋白與GP5 共表達(dá)可組裝成病毒樣顆粒，且GP2b 在其中發(fā)揮幫助病毒樣顆粒釋放的作用[23]。

3 小結(jié)

綜上所述，病毒樣顆粒疫苗免疫優(yōu)勢(shì)明顯，不僅容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，并且因其無法自主復(fù)制、不含核酸，在血清中的半衰期較長，可發(fā)揮良好的免疫效果，將有助于病毒慢性感染及腫瘤所帶來的免疫耐受，使病毒樣顆粒疫苗能夠直接用于預(yù)防和治療某些動(dòng)物疫病。與傳統(tǒng)疫苗相比，病毒樣顆粒疫苗有效彌補(bǔ)了基因工程疫苗安全性方面的缺陷，是動(dòng)物最具發(fā)展前景的候選疫苗之一，在豬病防控方面有良好且廣闊的應(yīng)用前景，未來需要加強(qiáng)病毒樣顆粒的劑量與佐劑比例的研究，并且根據(jù)不同豬病確定最佳疫苗使用劑量及免疫途徑。隨著對(duì)病毒樣顆粒研究的不斷深入，病毒樣顆粒疫苗的制備問題也將得到解決，屆時(shí)將有更多的病毒樣顆粒疫苗問世，為生豬疫病防控提供更多支持。