豬圓環(huán)病毒3 型快速檢測方法研究進展

莊林林 陳欣雅 徐佳豪 宋春雷 申秋平

（江蘇農林職業(yè)技術學院，江蘇鎮(zhèn)江 212400）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV）是一種單股環(huán)狀DNA 病毒，是目前已知最小的動物病毒[1]。目前，PCV 已被發(fā)現(xiàn)包含4 種基因型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。其中，PCV1 不表現(xiàn)嚴重的臨床癥狀；PCV2可引起豬繁殖與呼吸道綜合征、斷奶仔豬綜合征、皮炎及腎炎等疾病；PCV3 則可引起豬皮炎腎病綜合征、繁殖障礙及多系統(tǒng)炎癥；PCV4 是由我國湖南大學生物學院獸禽病毒學研究組于2019 年發(fā)現(xiàn)的一種新PCV 基因型（暫定為PCV4）。

2016 年，美國Phan TG 等[2]和Palinski R 等[3]團隊近乎同時報道了PCV3，患豬圓環(huán)病毒3 型病的母豬表現(xiàn)為心臟與多系統(tǒng)并發(fā)癥、豬皮炎和腎病綜合征，但檢測PCV2 為陰性。通過全基因組分析發(fā)現(xiàn)，該病毒與圓環(huán)病毒科成員具有相似的基因結構和特征，但其Cap 蛋白序列和同源性相似度較低。根據(jù)基因組序列不同，可將PCV3 分為：PCV 3a、PCV 3b 和PCV 3c[3]。目前國內已有PCV3 感染犬的病例[4]，證實了PCV3 具有跨物種感染的潛在危害。當前仍無有效防控PCV3 的疫苗，本文通過對PCV3 快速檢測技術進行綜述，以期為快速檢測及科學防控PCV3 提供參考。

1 免疫學檢測方法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）是將已知的抗原或抗體固定在載體表面，加入酶標抗原或抗體進行免疫學反應并催化底物顯色的一種檢測技術。該技術主要可分為4 種：直接法、間接法、夾心法和競爭法。目前，應用于PCV3 檢測的方法主要有間接ELISA 和夾心ELISA。

1.1.1 間接ELISA

間接ELISA 是將待檢測的抗體加入已標記有特定抗原的酶標板孔中，經(jīng)過孵育、洗滌等步驟之后，加入酶標記的抗體，通過酶催化底物顯色，根據(jù)產(chǎn)生的色素即可進行半定量或定量分析。為了建立間接ELISA 并快速檢測PCV3 的方法，Deng 等[5]利用Ni2+-NTA 瓊脂糖將重組PCV3 Cap 蛋白進行純化，并將其作為抗原以檢測血清中的抗PCV3 抗體。試驗結果表明，該方法檢測血清中的抗體靈敏度可達1∶3 200，且與PCV1、PCV2、豬細小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus,PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）等無交叉反應。該研究通過流行病學調查表明，自2015 年以來，PCV3 已在我國廣泛傳播，2015—2017 年，我國豬場中PCV3 的陽性率從22.35%上升至51.88%。葛玉鳳等[6]通過誘導表達及純化PCV3-Cap 建立了一種間接ELISA 方法，通過對反應條件等進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該方法對PCV3 抗體的檢測靈敏度可達到1∶25 600，具有優(yōu)異的敏感性。何博等[7]以ORF2 重組蛋白為包被抗原，建立了檢測PCV3 抗體的間接ELISA 方法，其對PCV3 陽性血清的最低檢出效價可達1∶20 480。劉相聰[8]利用原核表達PCV3 Cap 蛋白，并將其作為包被抗原建立了一種間接ELISA 方法。結果表明，該方法具有較高的敏感性、特異性和可重復性，適于臨床檢測應用。

1.1.2 夾心ELISA

夾心ELISA 是一種常用的ELISA 方法，其基本原理是在特定的涂層板上，將目標抗原或抗體與高親和力的檢測抗體或檢測抗原進行結合，再通過酶標記的溶液與目標分子和檢測分子之間的特異性反應，形成特定的復合物，最后通過酶標記物的作用產(chǎn)生信號，從而檢測目標分子的存在。夾心ELISA 具有選擇性好、靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點，目前已廣泛應用于生物醫(yī)學等領域。于俊楠等[9]通過優(yōu)化單抗包被、2 種抗體的濃度等，建立了一種可檢測PCV3 的夾心ELISA 方法。結果表明，該方法重復性良好（變異系數(shù)≤5%），且與PCV2、豬口蹄疫病毒、豬乙型腦炎病毒、PRV 等病毒陽性血清無交叉反應。臨床樣本驗證結果顯示，檢測結果與PCR方法相同率達84.6%。

1.2 免疫層析技術

膠體金免疫層析技術是以膠體金顆粒為顯色媒介，基于抗原抗體特異性反應原理形成免疫金復合物的一種免疫學檢測技術。該技術簡單快速且肉眼可觀察結果，適于現(xiàn)場即時檢測。高茵等[10]通過構建重組PCV3 Cap蛋白并優(yōu)化標記pH 值、SPA 標記濃度及劃線濃度等，建立了一種可快速檢測PCV3 的膠體金免疫層析方法。結果表明，該試紙條具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性，且臨床檢測結果與ELISA 一致，表現(xiàn)出較好的臨床適用性。

2 基于聚合酶鏈式反應的檢測方法

2.1 常規(guī)聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction,PCR）是目前常用的一種DNA 擴增及檢測技術。PCR過程主要包括3 步：首先在94～95℃下將模板DNA 變性成2 條單鏈DNA（變性）。其次將正、反向引物分別結合到單鏈DNA 上（退火），最后在DNA 聚合酶的作用下，2 條引物的3’端將沿著模板鏈分別延伸出一條互補的DNA 鏈（延伸）。經(jīng)過多個循環(huán)后，將形成大量的DNA 擴增產(chǎn)物。PCR 技術具有簡單、快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點。朱小甫等[11]通過構建pGEM-T-PCV3質粒，建立了一種檢測PCV3 的PCR 方法。該方法檢測限為50 copies/μL，且與PCV2、PRV、PPV、PRRSV、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒等常見豬源病毒均無交叉反應。楊威等[12]建立的PCR 方法檢測限可達1.13×10-3ng/μL，且具有良好的可重復性。楊曉偉等[13]為了解我國西南地區(qū)PCV3 的感染現(xiàn)狀及其遺傳特征，在基于PCV3-Cap 基因上，設計特異性引物建立了檢測PCV3的PCR 方法。Shizuka 等[14]使用常規(guī)PCR 方法在日本豬群中首次發(fā)現(xiàn)PCV3，且與毒株全基因組序列同源性為99.5%，ORF2 蛋白同源性為98.9%～99.2%。

2.2 套式PCR

套式PCR 屬于2 步PCR 方法，該方法需使用2 對引物及進行2 輪擴增。第1 輪反應中使用1 對通用引物（外引物）擴增出目標DNA 的初始片段，第2 輪反應（使用內引物）以第1 輪擴增片段為模板進行再次擴增。因此，與常規(guī)PCR 相比，套式PCR 具有更高的敏感性和特異性。同時，第2 次反應能否進行也是對第1 次反應正確性的檢驗，因而套式PCR 的準確性也大幅提升。楊永寧等[15]通過設計內、外特異性引物，建立了套式PCR 方法。結果顯示，基于內、外引物的PCR 檢測限分別為0.17 ng 和17 ng，比常規(guī)PCR 高100 倍。張靜等[16]建立的套式PCR 最低檢測限可達1.74×10 copies/μL，比常規(guī)PCR 高105倍，與李卓昕等[17]建立的熒光定量PCR 靈敏度相近。經(jīng)臨床樣本驗證，該方法檢測結果與市售檢測試劑盒具有較高的一致性。

2.3 多重PCR

多重PCR（Multiple PCR,mPCR）是一種使用2 對以上引物，實現(xiàn)同時擴增多個目標核酸片段的PCR 技術，有效彌補了常規(guī)PCR 只能擴增1 個目標片段的不足。多重PCR 具有效率高且成本低等優(yōu)勢，已被廣泛應用于病原微生物檢測、鑒定及遺傳性疾病篩查等。目前，在國內外豬群中已發(fā)現(xiàn)PCV2 和PCV3 混合感染的現(xiàn)象，為了區(qū)分這2 種基因型，Wang 等[18]建立了可1 管式檢測PCV2 和PCV3 的雙重PCR。結果表明，該方法對PCV3 的檢測限為2.23×106copies/μL，臨床樣本檢測表明PCV2 和PCV3 合并感染率為14.8%。溫海京等[19]通過優(yōu)化退火溫度、引物濃度等，建立了一種檢測PCV2 和PCV3 的雙重PCR 的方法來針對PCV3 的檢測限為800 copies/μL?；谙嗨品椒ǎ旒移降萚20]建立的雙重PCR 檢測限低至10 copies/μL。此外，為快速準確區(qū)分檢測PCV1、PCV2 和PCV3，Yang 等[21]通過設計3 對特異性引物從而建立了mPCR 方法，針對3 種病原的檢測限均低至10 copies/μL。經(jīng)臨床樣本驗證，該方法檢測結果與測序法和定量PCR 一致，具有良好的臨床適用性。

2.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR（Quantitative PCR,qPCR）是通過檢測PCR 反應體系中的熒光強度來定量擴增產(chǎn)物的技術。該技術在反應體系中需加入熒光染料或探針，染料或探針可與擴增產(chǎn)物結合產(chǎn)生熒光信號。熒光信號的強度與反應體系中擴增產(chǎn)物數(shù)量成正相關，從而實現(xiàn)DNA定量分析。Xu 等[22]基于SYBR Green I 建立了可用于PCV3 檢測的qPCR 方法，并對來自不同農場的部分毒株的Cap 基因進行了測序及分析，結果表明，該方法檢測限為2.19×10 copies/μL，且臨床樣本PCV3 陽性率為31.18%。Zhao 等[23]使用TB Green Ⅱ開發(fā)了qPCR方法，檢測限為78 copies/μL，可用于快速檢測PCV3感染。Yuan 等[24]基于PCV3 Cap 蛋白保守區(qū)域設計了引物和探針，開發(fā)的qPCR 方法檢測限為10 copies/μL，同時，該方法具有較高的特異性，并在臨床樣品檢測方面表現(xiàn)出良好的應用性能。暢通等[25]利用TaqMan 探針建立的qPCR 方法敏感性同樣達到10 copies/μL。Deng等[26]首次使用SPF 仔豬模型對PCV3 感染進行體內表征研究，并利用組織病理學和qPCR 進行PCV3 檢測。結果表明，qPCR 方法檢測限達5.5 copies/μL。Feng 等[27]基于PCV3 復制酶基因開發(fā)了基于TaqMan 的qPCR 方法，該方法的檢測極限為1.5×101copies/μL。

此外，qPCR 方法同樣可應用于多重檢測，有利于大幅提高檢測效率。Zheng 等[28]基于SYBR Green Ⅰ開發(fā)了雙重qPCR 方法用于同時檢測PCV3 和PRRSV。該方法對PCV3 的檢測限為49.3 copies/μL，低于常規(guī)PCR，可用于檢測臨床樣本中上述2 種病毒混合感染。Li 等[29]根據(jù)PCV2 Cap 和PCV3 Rep 基因設計特異性引物和探針，開發(fā)了可同時檢測PCV2 和PCV3 的雙重qPCR 方法。結果顯示，該方法對PCV3 的檢測限為22.5 copies/μL。同時，臨床樣本檢測結果表明，PCV2、PCV3 在樣品中的混合感染率為27.6%，適用于快速檢測PCV 混合感染。

2.5 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR（Digital PCR,dPCR） 是20 世紀末由Vogelstein 等學者研發(fā)的核酸絕對定量技術。通過使用微流控技術將反應混合物分成數(shù)千乃至上萬個微小的球形微滴并分散在獨立的反應室內，每個反應室內僅含有1 個或0 個目標分子。PCR 反應結束后，即可根據(jù)陽性反應室比例準確計算初始樣本中的目標分子數(shù)[30]。與qPCR 相比，dPCR 無需制作標準曲線，具有更高的靈敏度和精準度。dPCR 已成為檢測PCV3 感染具有前景的分子診斷技術之一。劉雨琦[31]建立了檢測PCV3 的dPCR 方法，確定了最適退火溫度為56.3℃、引物和探針終濃度分別為400 nM 和200 nM。分析顯示，該方法靈敏度可達0.1 fg/μL，同時具有良好的可重復性。李原野等[32]基于PCV3 ORF2 基因序列設計擴增引物，建立的dPCR 方法檢測限為16.35 copies/μL，同時具有良好的可重復性和特異性。此外，dPCR 同樣可用于多靶標精準檢測。Liu 等[33]利用微滴數(shù)字PCR 建立了可同時檢測PCV2 和PCV3 的方法。該方法針對PCV3 的檢測限為3 copies/μL，低于qPCR。吳朦晨等[34]通過對反應溫度、引物及探針工作濃度等進行優(yōu)化，建立了三重dPCR 方法。結果表明，該方法對PCV3 的檢測限為11.54 copies/μL，同樣優(yōu)于qPCR 方法。

2.6 基于PCR 的其他方法

2022 年，孫延舉[35]聯(lián)合PCR 和ELISA 建立了可用于PCV3 快速檢測的PCR-ELISA 方法。在該方法中，以鏈霉親和素作為包被抗原，標記生物素和地高辛的PCR 產(chǎn)物作為一抗、HRP 標記的抗地高辛抗體作為二抗進行ELISA 反應。該PCR-ELISA 方法的檢測限為5.58×102copies/μL，比常規(guī)PCR 低2 個數(shù)量級，且無需凝膠電泳，可有效減少污染風險。為了分析我國PCV3 和PCV2 的流行趨勢，Zhang 等[36]建立了雙重納米PCR（nano-PCR） 方法，擴增產(chǎn)物分別為528 bp（PCV2）和251 bp（PCV3）2 個特異性片段。同時，該方法檢測限低至9.16×101copies/μL，比常規(guī)雙重PCR低2 個數(shù)量級，且與其他常見豬病毒無交叉反應性。

3 等溫擴增方法

3.1 環(huán)介導等溫擴增技術

2000 年，Notomi 等[37]基于具有鏈置換活性的DNA聚合酶研發(fā)了可在等溫條件下進行DNA 高效擴增的方法——環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP） 技術。LAMP 技術利用Bst DNA聚合酶及內、外2 對擴增引物可在1 h 內擴增出109～1010個目標序列，具有簡單快速、靈敏度高、儀器簡單等優(yōu)勢，目前已廣泛應用于病原微生物鑒定、疫病監(jiān)測、食品安全等領域。Wang 等[38]建立了用于快速檢測PCV3的LAMP 方法，檢測限可達1×101copies/μL，與Zheng 等[39]的研究結果一致。Zhang 等[40]開發(fā)了可目視判斷結果的LAMP 方法，以實現(xiàn)PCV3 的快速檢測。該方法靈敏度為10 copies/μL，且與其他豬病毒無交叉反應。Park 等[41]基于PCV3 Cap 基因設計引物、以羥基萘酚藍為反應指示劑開發(fā)了可目視檢測PCV3 的LAMP 方法，檢測限為50 copies/μL，且具有較好的臨床適用性。為了實現(xiàn)PCV3 實時檢測，Kim 等[42]通過加入探針建立了實時LAMP 方法以特異性檢測PCV3。該方法靈敏度為50 copies/μL，優(yōu)于常規(guī)LAMP 方法。此外，王妍等[43]聯(lián)合LAMP 與側向免疫層析（Lateral flow dipstick.LFD）建立了LAMP-LFD 方法并應用于PCV3 的快速檢測，該方法檢測限為0.2 fg/μL，比常規(guī)PCR 低3 個數(shù)量級，同時，該方法操作簡單、快速，且檢測結果優(yōu)于PCR和常規(guī)LAMP 方法，具有良好的臨床應用價值。

3.2 重組酶介導等溫核酸擴增技術

重組酶介導等溫核酸擴增技術（Recombinase aided amplification,RAA）是一種等溫核酸擴增技術。該技術利用重組酶、DNA 聚合酶和單鏈結合蛋白，可在恒溫條件下從目標核酸片段擴增到大量的DNA 產(chǎn)物。與PCR 相比，RAA 具有操作簡單、反應快速、無需熱循環(huán)儀等優(yōu)點。Li 等[44]基于PCV3 Cap 基因設計特異性引物和探針，開發(fā)了一種可用于PCV3 快速檢測的RAA 方法。利用該方法，在39℃下，30 min 內即可完成檢測。該方法靈敏度為38 copies/μL，在現(xiàn)場即時檢測方面具有應用潛力。為了縮短檢測時間并實現(xiàn)實時監(jiān)測，吳江等[45]建立了實時熒光RAA 方法。該方法可在39℃下20 min 內完成檢測，且檢測限達102copies/μL，適于分子檢測條件有限的機構使用。

3.3 重組酶聚合酶擴增

重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification,RPA）是一種新型核酸等溫擴增技術，可以在常溫（37～42℃）條件下進行快速、高效地擴增出特定核酸序列[46]。該技術可利用聚合酶、重組酶和單鏈DNA 結合蛋白等共同作用引導目標核酸不斷解鏈、擴增和釋放。Wang 等[47]針對PCV3 Cap 基因設計RPA 引物和探針，開發(fā)了用于快速檢測PCV3 的實時熒光RPA 方法。結果表明，該方法具有高特異性，靈敏度為23 copies/μL，可在20 min 內完成檢測。吳佳駿等[48]建立了靶向PCV3 Cap 蛋白的實時RPA 方法，靈敏度可達4.56×102copies/μL，與常規(guī)PCR 方法靈敏度相當。同時，該方法與PCV1、PCV2、PRRSV、PRV、豬塞內卡病毒等無交叉反應。臨床驗證表明，該方法檢測結果與使用PCR 檢測結果一致。

3.4 酶促重組等溫擴增技術

酶促重組等溫擴增技術（Enzymatic recombinase amplification,ERA）是近年來發(fā)展起來的新型核酸擴增技術，其原理是采用介導DNA 重組的酶來高效擴增目標DNA 序列。ERA 技術具有低溫適應性、簡單快速以及高靈敏度等優(yōu)點。Zhang 等[49]將ERA 與CRISPR/Cas12a 技術相結合，應用于PCV3 快速檢測。ERA-CRISPR/Cas12a 反應可以在單分子水平上檢測PCV3 DNA。同時，該方法具有高特異性，與PCV1、PCV2、PCV4 及其他豬病毒均沒有交叉反應，并可在1 h 內完成檢測。該技術具有良好的診斷應用前景，有望成為檢測病毒感染的重要工具手段。

3.5 聚合酶螺旋反應

聚合酶螺旋反應（Polymerase spiral reaction,PSR）是一種近年來發(fā)展的核酸等溫擴增技術。通過在2 條引物的5’端加上1 段互為反向的序列，可以使引物以自身為模板，按照自螺旋擴增的方式進行目標片段擴增。該技術基于PCR 引物的設計思路和Bst DNA 聚合酶的鏈置換活性，實現(xiàn)1 對引物和1 種酶在等溫條件下對核酸進行高效擴增[50]。PSR 反應體系簡單，具有良好的特異性和敏感性。Ji 等[51]建立了可高效檢測PCV3 的PSR方法。使用62℃水浴，50 min 可完成PCV3 目標基因擴增，其檢測限為1.13×102copies/μL。試驗表明，PSR方法具有較高的特異性，且檢出率高于LAMP 方法，適于資源條件有限的實驗室使用。

4 原位雜交技術

原位雜交技術（In situ hybridization,ISH）是將核酸探針與檢測樣品中靶核酸特異性雜交的方法[53]。該技術的原理是使用DNA 或RNA 分子探針與已知目標DNA或RNA 序列進行雜交，從而確定這些分子在細胞或組織樣本中的位置和數(shù)量。在ISH 技術中，探針一般被標記熒光或放射性等，可以被視覺或檢測設備測量和檢測。ISH 技術可以對特定序列進行檢測及定位，具有直接、快速、特異等優(yōu)點。Phan 等[2]使用ISH 方法，將載玻片與目標探針在40℃的雜交緩沖液中反應2 h。研究表明，PCV3 在心肌細胞和心肌中的炎癥細胞等多處存在，而在肺組織切片中未能檢測到PCV3。Mora-Díaz等[52]通過ISH 方法在豬生殖期病例組織中分離出PCV3。同時，研究表明，PCV3 感染會引起豬的心肌炎和系統(tǒng)性血管炎等多系統(tǒng)炎癥。Taehwan 等[54]通過使用PCV3特異性DNA 探針進行原位雜交來確認PCV3 感染，首次在流產(chǎn)胎兒中檢測到PCV3。

5 宏基因組測序分析

宏基因組測序分析技術是一種用于研究微生物群落的高通量測序技術，可以快速獲取微生物群落的全基因組序列信息，并進行群落結構、功能和代謝通路等多個方面的分析[55]。目前，宏基因組測序已經(jīng)從分析單個基因發(fā)展到可提供整個生態(tài)系統(tǒng)相關的復雜遺傳信息。這對發(fā)現(xiàn)新物種、分析生態(tài)系統(tǒng)構成、研究宏基因組的功能和代謝途徑等具有重要意義。PCV3 的發(fā)現(xiàn)也得益于該技術，Palinski 等[3]通過PCR 和宏基因組測序檢測到母豬流產(chǎn)的胎兒含有高水平的PCV3，并通過滾環(huán)擴增證實引起豬皮炎腎病綜合征臨床癥狀的病原為PCV3。Franzo等[56]通過宏基因組測序分析，檢測出患有仔豬斷奶發(fā)育不全綜合征的病例中存在PCV3。宏基因組測序分析為病原體的發(fā)現(xiàn)、溯源及組成等提供了高效快捷的方法。

6 小結與展望

豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）在全球范圍內傳播廣泛，已引起養(yǎng)豬業(yè)的廣泛重視。為了有效監(jiān)測和控制其傳播，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種快速檢測方法，包括免疫學方法、多種基于PCR 的方法、等溫擴增、原位雜交、宏基因組測序技術等，為快速精準檢測PCV3 提供了有力技術支持。免疫學方法盡管簡單、快速且可監(jiān)測抗體，但目前在靈敏度和特異性方面仍有待加強?；赑CR 的方法雖然在PCV3 檢測中具有高靈敏度和特異性，但其操作過程需要具有專業(yè)能力的技術人員，且檢測結果觀察需依賴操作繁瑣的凝膠電泳，或使用成本較高的熒光探測設備。等溫擴增技術作為PCR 的可選替代方案，具有設備簡單、反應快速、支持目視判斷結果等優(yōu)勢，但目前相關技術在引物設計、反應體系成熟度及可重復性等方面仍有待提升。原位雜交、宏基因組測序為PCV3檢測提供了重要技術支持，但現(xiàn)有方法仍難以滿足PCV3 現(xiàn)場快速檢測需求。

未來，隨著PCV3 研究的不斷深入，研究人員將繼續(xù)優(yōu)化現(xiàn)有快速檢測方法，提高檢測敏感性、特異性和可重復性。同時，隨著檢測技術水平的不斷提高，更精準、快速和便捷的PCV3 檢測技術將被研發(fā)。此外，在多學科交叉融合的發(fā)展趨勢下，高通量、便攜式、智能化的一體化檢測設備將不斷被研發(fā)，為實現(xiàn)PCV3 快速精準檢測提供新的方法與技術支撐。