基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討封髓丹治療蛋白尿的分子機(jī)制

張艷燕，于子洋，崔偉鋒，馬笑凡，潘玉穎，王曉麗，李星銳*

1 河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州 451191；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；3 河南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，鄭州 450004

近年來，慢性腎臟病（chronic kidney diseases，CKD）由于發(fā)病率高、知曉率低，已成為人類健康的主要威脅之一。蛋白尿作為CKD 進(jìn)展的獨立危險因素，對其進(jìn)行有效控制有助于延緩CKD進(jìn)展。封髓丹始載于《御藥院方》，該書由元代醫(yī)家許國禎編撰?！队幵悍健分惺龇馑璧び牲S柏、縮砂仁、甘草組成，言其功用為“降心火、益腎水”［1］。清代醫(yī)家鄭欽安所撰的《醫(yī)理真?zhèn)鳌分惺龇馑璧び牲S柏、砂仁、甘草組成，“黃柏味苦入心，稟天冬寒水之氣而入腎……甘草調(diào)和上下，又能伏火，真火伏藏……黃柏之苦，合甘草之甘，苦甘能化陰。西砂之辛，合甘草之甘，辛甘能化陽。陰陽合化，交會中宮，則水火既濟(jì)?！保?］封髓丹加減在治療慢性咽炎［3］、口腔潰瘍［4-6］、遺精［7］、痤瘡［8］、心悸［9］、便秘［10］、早泄［11］、糖尿病和對抗激素不良反應(yīng)［12-13］等方面療效確切。清代醫(yī)家吳謙編修的《醫(yī)宗金鑒》曾詳細(xì)描述封髓丹的組成和配伍意義，并贊其為“固精之要藥”［14］。李培旭主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，提出蛋白尿的病機(jī)是各種原因引起的腎失封藏、精微不固而外泄，辨證應(yīng)用封髓丹加減在治療蛋白尿方面取得了較好的療效［15］。目前，關(guān)于應(yīng)用封髓丹治療蛋白尿的報道較少，作用機(jī)制仍待進(jìn)一步探索，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探索封髓丹治療蛋白尿的分子作用機(jī)制，為封髓丹治療蛋白尿提供科學(xué)依據(jù)，也為治療蛋白尿相關(guān)藥物的開發(fā)提供新思路和參考。

1 資料與方法

1.1 封髓丹活性成份的挖掘與篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）查找封髓丹的活性成份，在數(shù)據(jù)庫中分別輸入黃柏、甘草、砂仁，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似度（druglike properties，DL）≥0.18 為條件篩選所得到的活性成份，得到3 味中藥的潛在活性成份。

1.2 封髓丹活性成份作用靶點信息的收集

將黃柏、甘草、砂仁中的所有潛在活性成份錄入TCMSP 數(shù)據(jù)庫，從而得到其相應(yīng)的作用靶點，然后利用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），選擇“已被驗證的”“人類的”靶點，逐個匹配得出規(guī)范化的靶點名稱（即gene symbol）以便進(jìn)行后續(xù)的研究。

1.3 蛋白尿相關(guān)靶點的篩選

以“proteinuria”“albuminuria”為關(guān)鍵詞，在GeneCard 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org）中檢索與蛋白尿相關(guān)的靶點，并在DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫（https：//www.Drugbank.ca）中尋找已獲批使用臨床西藥的作用靶點予以補(bǔ)充，合并篩選得到的所有靶點并去重，得到蛋白尿相關(guān)靶點。使用Rstudio1.3.959 軟件將封髓丹活性成份作用靶點和蛋白尿相關(guān)靶點進(jìn)行可視化處理，靶點交集即為封髓丹治療蛋白尿的潛在作用靶點。

1.4 “封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

將靶點與活性成份相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)表格導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件中，得出“封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，使用軟件中的“Network Analyzer”功能對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以介?shù)中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和度中心性（degree centrality，DC）為依據(jù)分析得到核心成份。

1.5 封髓丹活性成份-蛋白尿靶點蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）構(gòu)建及分析

以gene symbol 的形式表示篩選出的封髓丹活性成份潛在作用靶點，將這些gene symbol粘貼到STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）的gene symbol 欄，設(shè)置物種為“homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用值是“highest confidence ≥0.9”，得出各靶點蛋白的相互作用參數(shù)，并導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。使用“Network Analyzer”功能對其進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)BC 值、CC 值以及DC 值篩選得到核心靶點。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

使用R 語言對封髓丹治療蛋白尿的潛在作用靶點分別進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 富集分析，篩選條件是P≤0.01。然后按照P值從小到大進(jìn)行排列，將排名靠前的條目可視化，從而找到封髓丹治療蛋白尿涉及的生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）及相關(guān)信號通路。

1.7 分子對接驗證

分子間的相互識別作用可以通過幾何匹配和能量匹配實現(xiàn)，在藥物分子發(fā)生反應(yīng)時，分子與靶標(biāo)能夠在特定的部位產(chǎn)生契合，并通過調(diào)整構(gòu)象而獲得穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)，這個過程就是分子對接。如果封髓丹中的核心成份能與核心靶點結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)，就能從一定程度上驗證封髓丹是可以通過這些核心成份發(fā)揮治療蛋白尿的作用的，提高本研究結(jié)果的可靠性。一般情況下，當(dāng)Docking Score的絕對值高于4.25 時，通常認(rèn)為分子與靶點具有一定的結(jié)合能力；當(dāng)Docking Score 的絕對值高于5.0時則認(rèn)為二者結(jié)合能力較強(qiáng)；當(dāng)Docking Score 的絕對值高于7.0 時則表示二者結(jié)合能力很強(qiáng)［16］。

將核心靶點輸入PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）獲得核心靶點的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用PyMol1.8 軟件去除水分子及分離配體，然后加氫、計算出總電荷并設(shè)置原子類型，操作結(jié)束后將文件保存為“pdbqt”格式，即為受體文件。已篩選的核心成份需在Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載結(jié)構(gòu)文件，通過Chem3D19.0 軟件將其進(jìn)行能量最小化后保存為mol2 格式，使用Autodock Tools1.5.6 軟件設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵，然后把文件保存為“pdbqt”的格式，即為配體文件。利用Autodock-vina1.1.2 軟件將保存好的“pdbqt”格式的配體文件以及受體文件進(jìn)行分子對接。使用PyMol1.8 軟件對對接結(jié)果實現(xiàn)可視化，構(gòu)建出所需要對接的互相作用樣式圖。

2 結(jié)果

2.1 封髓丹活性成份篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中共篩選到139 個符合條件的封髓丹活性成份，其中黃柏37 個、甘草92 個、砂仁10 個。

2.2 封髓丹治療蛋白尿潛在作用靶點

經(jīng)過收集和篩選，最終獲得封髓丹活性成份的作用靶點共219 個；以“proteinuria”“albuminuria”為關(guān)鍵詞，在GeneCard、PharmGkb、OMIM、DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫中查找并去重，最終得到蛋白尿相關(guān)靶點共236 個；通過取交集去重，獲得32 個封髓丹治療蛋白尿的潛在作用靶點（圖1）。

圖1 封髓丹活性成份作用靶點-蛋白尿相關(guān)靶點交集韋恩圖

2.3 “封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心成份拓?fù)浞治?/h3>

將封髓丹和蛋白尿的共同靶點分子與對應(yīng)的活性成份錄入Excel2022 軟件中，對不同藥物的活性成份進(jìn)行標(biāo)記，建立數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，生成含有131 個節(jié)點、275 條互相作用的邊的“封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖（圖2）。選取BC>0.00111（中位數(shù)）、CC>0.39634（中位數(shù)）、DC>3（中位數(shù)）的活性成份為核心活性成份，這些成份可能是封髓丹治療蛋白尿的關(guān)鍵活性成份。以DC 值和BC 值降序進(jìn)行排列，取前12 個活性成份進(jìn)行分子對接，具體數(shù)值見表1。

表1 12 個活性成份拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

圖2 “封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

使用STRING 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape3.8.2 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，二者均能直觀反映共同靶點的相互關(guān)系，且結(jié)果可相互印證。對32 個共同靶點進(jìn)行拓?fù)浞治?，得?3 個核心靶點。使用STRING數(shù)據(jù)庫獲得封髓丹治療蛋白尿的32 個潛在作用靶點蛋白間的相互作用關(guān)系圖（圖3）；從STRING數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出各靶點蛋白互相作用參數(shù)，再導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件中構(gòu)建含有32 個節(jié)點、228條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，采用Cytoscape3.8.2 軟件中的“Network Analyzer”功能對該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以BC>0.01366（中位數(shù)）、CC>0.65270（中位數(shù)）、DC>14.5（中位數(shù)）進(jìn)行篩選，得到NOS3、SERPINE1、CCL2、TP53、ICAM1、IL1B、MMP9 等13 個核心靶點蛋白（表2），這些靶點可能在封髓丹治療蛋白尿中發(fā)揮重要作用。

表2 13 個核心靶點蛋白的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

圖3 封髓丹治療蛋白尿的靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)（STRING 數(shù)據(jù)庫）

2.5 GO 和KEGG 富集分析

使用R 語言對封髓丹治療蛋白尿的潛在作用靶點進(jìn)行GO 富集分析，共獲取1321 個GO 條目。涉及BP 共1229 個，主要涉及細(xì)菌源分子（molecule of bacterial origin）、脂多糖（lipopolysaccharide）和營養(yǎng)水平的反應(yīng)（response to nutrient levels）等方面；涉及CC 共15 個，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體（transcription regulator complex）、膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）等方面；涉及MF 共77 個，主要涉及四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）等。

通過KEGG 信號通路富集，以P<0.01 為條件進(jìn)行篩選后共獲得48 條通路，按照P值從小到大排列，對排名前20 的條目做可視化操作（圖4）。通路主要涉及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathyway in diabetic complication）、流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）等。

圖4 封髓丹治療蛋白尿核心靶點的KEGG 富集分析

2.6 分子對接驗證

將PPI 網(wǎng)絡(luò)中DC 值排名前5 的靶點蛋白輸入PDB 數(shù)據(jù)庫查找蛋白結(jié)構(gòu)，由于SERPINE1 蛋白的PDB 結(jié)構(gòu)未查及合適配體，故不作分子對接驗證。將關(guān)鍵靶點蛋白NOS3、CCL2、TP53、ICAM1 分別與排名前3 的關(guān)鍵化合物槲皮素、山柰酚、甘草寧B 進(jìn)行分子對接驗證。結(jié)果顯示，化合物與靶點結(jié)合分值均大于7.0，提示關(guān)鍵活性成份與關(guān)鍵靶點結(jié)合性很強(qiáng)，封髓丹對蛋白尿有直接治療作用（表3）。選擇與4 個核心靶點蛋白具有最低結(jié)合能的藥物活性成份進(jìn)行分子對接可視化處理（圖5）。

表3 封髓丹中活性成份與核心靶點分子對接結(jié)合分值 分

圖5 封髓丹活性成份-靶點作用模式圖

3 討論

CKD 可引發(fā)心血管疾病并增加其死亡風(fēng)險，還可提高糖尿病和高血壓的發(fā)病率，嚴(yán)重影響患者健康［17］。蛋白尿與腎小球硬化、腎小管損傷密切相關(guān)，可最終引發(fā)慢性腎功能不全，減少蛋白尿可有效延緩慢性腎功能不全的發(fā)生發(fā)展［18］。中醫(yī)典籍中并無“蛋白尿”這一說法的記載，根據(jù)其臨床癥狀，多屬于“尿濁”“精濁”“膏淋”等［19］?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)可歸類于中醫(yī)“精微”的范疇?！端貑枴ち?jié)藏象論》云［20］：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也?！钡鞍啄虻漠a(chǎn)生與腎的封藏功能息息相關(guān)［21］，腎失封藏、精微不固、脂濁下泄是蛋白尿的形成原因。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有多靶點、系統(tǒng)性、動態(tài)性、整體性的特點［22］，與封髓丹成份復(fù)雜、多途徑、多靶點治療疾病的特點相符合，是探討封髓丹治療蛋白尿分子機(jī)制的重要工具之一。

封髓丹的主要活性成份槲皮素、山柰酚等黃酮類化合物具有抗炎、清除自由基、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化、抗癌等多種藥理作用［23-24］。槲皮素還可改善轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞纖維化、抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化等作用，治療腎病蛋白尿療效較佳［25-26］。山柰酚在癌癥、肥胖、糖尿病等多種疾病模型中都顯示出抗氧化、抗炎的作用，并能夠有效改善糖尿病模型小鼠的腎臟炎癥、腎小管上皮細(xì)胞纖維化和腎功能障礙［27-28］。另有研究表明，山柰酚可有效降低糖尿病腎病模型大鼠的蛋白尿含量，且酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）結(jié)果顯示白介素-1β（interleukin—1β，IL-1β）、IL-18、IL-6 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量也顯著降低，提示山柰酚可抑制糖尿病腎病模型大鼠的炎癥反應(yīng)［29］。

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖提示NOS3、SERPINE1、CCL2、TP53、ICAM1、IL1B、MMP9 等可能是封髓丹治療蛋白尿的潛在關(guān)鍵靶點，多集中于調(diào)節(jié)血管功能、炎癥因子、癌癥等方面。NOS3基因又稱eNOS基因，其蛋白表達(dá)水平的改變是CKD 中糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一［30-32］。C-C 基序趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）是微生物感染和組織損傷過程中免疫細(xì)胞聚集的重要中介［33］，是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要因素［34-35］。在診治糖尿病腎病時針對CCL2 進(jìn)行治療可以取得更好的療效［36］，因此，封髓丹對糖尿病腎病可能有較好的治療作用，其作用機(jī)制可能是通過其有效活性成份槲皮素和山柰酚調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點CCL2、NOS3、SERPINE1 的生物活性，發(fā)揮治療蛋白尿的作用。

封髓丹參與通路主要富集在TNF、流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、AGERAGE 等相關(guān)的信號通路。晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）在體內(nèi)主要通過與其受體（receptor of AGEs，RAGE）結(jié)合而引起病變，在正常健康的人體中，RAGE 主要在腎臟中表達(dá)，但表達(dá)量較低［37］。有研究表明，RAGE敲除小鼠的糖尿病腎病癥狀顯著改善。在鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）注射致糖尿病的RAGE敲除小鼠中，RAGE 缺失與蛋白尿減少、腎小球硬化減少和血清肌酐濃度降低密切相關(guān)［38］。本研究在TNF 信號通路上主要富集到CCL2等基因，這些信號通路靶點主要是炎癥趨化因子，提示封髓丹主要通過調(diào)節(jié)免疫信號通路、調(diào)整機(jī)體炎癥因子的表達(dá)、控制炎癥反應(yīng)從而治療蛋白尿。

分子對接結(jié)果表明，封髓丹中排名前3 的活性成份（槲皮素、山柰酚、甘草寧B）與排名前5 位的靶蛋白中的4 種結(jié)合強(qiáng)度依次為：NOS3>TP53>ICAM1>CCL2，且提示槲皮素與NOS3、TP53、ICAM1 有良好的相互作用，山柰酚與ICAM1、NOS3 有良好的相互作用。分子對接進(jìn)一步證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的結(jié)果。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和分子對接結(jié)果，封髓丹可能通過其有效成份槲皮素和山柰酚調(diào)節(jié)NOS3、TP53、ICAM1、CCL2 等靶點蛋白的生物活性和AGE-RAGE、TNF 等免疫信號通路以保護(hù)腎臟、治療蛋白尿。但本研究尚存在不足，例如網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)因未考慮藥物劑型、封髓丹中的君臣佐使配伍關(guān)系、藥物煎煮方法及時間等因素，其結(jié)果的可靠性還有待進(jìn)一步證實，未來還需從動物及細(xì)胞層面驗證本研究結(jié)果的科學(xué)性。