SiO2-Pickering乳液佐劑增強(qiáng)沙眼衣原體Pgp3蛋白免疫效果

史可靚, 方春霞, 趙蘭華, 周輝, 李忠玉

1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南衡陽(yáng) 421001;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南長(zhǎng)沙 410007

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是一類在細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物,感染不同人體部位可誘發(fā)不同疾病,長(zhǎng)期反復(fù)使用抗生素治療易產(chǎn)生耐藥性[1-2],因此,衣原體疫苗可能是有效預(yù)防衣原體感染的關(guān)鍵,但由于衣原體血清型和抗原構(gòu)象復(fù)雜,目前還沒有臨床應(yīng)用疫苗的報(bào)道。

Pgp3是由Ct質(zhì)粒編碼的唯一能分泌到宿主細(xì)胞胞質(zhì)的蛋白[3],是Ct調(diào)控宿主細(xì)胞通路維持生存的關(guān)鍵毒力因子。Pgp3能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)抗體,具有良好免疫原性[4],但單獨(dú)的Pgp3蛋白疫苗不足以產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)以快速清除Ct感染[5],因此尋找安全、有效的佐劑來增強(qiáng)其免疫效果尤為重要。Pickering乳液是采用固體粒子穩(wěn)定油水體系的一種新型乳液,不易受pH值、溫度、鹽含量及油相組成的影響,具有良好穩(wěn)定性[6]。二氧化硅(SiO2)因顆粒直徑可控、安全、穩(wěn)定等諸多優(yōu)勢(shì)而成為最常用于制備Pickering乳液的固體粒子。Pickering乳液能通過控制對(duì)抗原蛋白的裝載與吸附來有效增強(qiáng)免疫效果[7]。本研究通過優(yōu)化構(gòu)建安全穩(wěn)定的SiO2Pickering(SPE)乳液佐劑,將SPE乳液佐劑聯(lián)合Ct Pgp3蛋白免疫BABL/c小鼠,探討SPE乳液佐劑對(duì)Pgp3蛋白的免疫增強(qiáng)作用及其機(jī)制,為Ct感染性疾病的預(yù)防與治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

BABL/c雌性小鼠(4周齡,SPF級(jí))購(gòu)于斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)于康為世紀(jì)公司;ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)均購(gòu)于Biolegend公司;CCK-8試劑盒購(gòu)于DOJINDO Molecular公司;pGEX-6p-1/Pgp3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌E.coli XL1-blue為本課題組保存。

1.2 SPE乳液制備和表征分析

為了制備出穩(wěn)定、液滴直徑小而均一的Pickering乳液,本實(shí)驗(yàn)從水油比、SiO2質(zhì)量濃度、超聲功率這幾方面進(jìn)行優(yōu)化。將SiO2納米顆粒與去離子水混合,攪拌至粉末完全溶解,配置不同質(zhì)量濃度(1、5、10 g/L)SiO2水相。吸取適量SiO2水相與液體石蠟(liquid paraffin,LP)混合,不同水油體積比分別為10∶1、10∶2、10∶4。設(shè)置不同功率(67～670 W)超聲制備SPE乳液佐劑。SPE乳液靜置8～12 h后,光學(xué)普通顯微鏡下觀察乳液微觀結(jié)構(gòu),Nanomeasure軟件分析液滴平均粒徑;SPE乳液用去離子水稀釋100倍后,取1.5 mL加入到激光粒度分析儀樣品池中,測(cè)定乳液顆粒平均粒徑以及聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersibility index,PDI)。

1.3 Pgp3蛋白表達(dá)純化及鑒定

將pGEX-6p/Pgp3轉(zhuǎn)化菌株接種于LB固體培養(yǎng)基(Amp抗性),37 ℃培養(yǎng)過夜,挑取單個(gè)菌落加入液體培養(yǎng)基37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h,取適量菌液加入600 mL液體培養(yǎng)基(Amp抗性)37 ℃、220 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)4 h,隨后加入IPTG(終濃度0.2 mmol/L)于37 ℃、180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h,離心超聲裂解菌液后收集上清,樹脂純化后加入PreScission Protease切除GST標(biāo)簽,離心收集上清Pgp3蛋白。使用BCA法測(cè)定蛋白水平,并使用SDS-PAGE凝膠電泳及Western blotting分析鑒定。

1.4 BALB/c小鼠免疫接種

選取4周齡BABL/c雌性小鼠30只,隨機(jī)均分成SPE+Pgp3組、Pgp3組和PBS組。SPE+Pgp3組采用SPE乳液佐劑與50 μg Pgp3蛋白混合后免疫;Pgp3組采用50 μg Pgp3蛋白單獨(dú)免疫;PBS組則注射50 μg PBS作為對(duì)照。3組均采取皮下注射方式,于0、2、4周分別進(jìn)行3次免疫。

1.5 抗原特異性抗體的檢測(cè)

分別于0、2、4、6周小鼠尾靜脈采血,4 ℃靜置過夜,5 000 r/min離心10 min,收集血清-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?.05 mmol/L碳酸鹽緩沖液稀釋Pgp3蛋白至100 mg/L,在96孔ELISA板中每孔加入100 μL,4 ℃包被過夜;使用PBST洗滌后每孔加入250 μL含5%脫脂奶粉的封閉液,37 ℃封閉2 h;洗滌封閉液后每孔加入100 μL倍比稀釋的小鼠血清進(jìn)行一抗孵育,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空白組,37 ℃孵育2 h;洗滌5次后每孔加入100 μL按比例稀釋HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶5 000)、IgG1(1∶5 000)、IgG2a(1∶5 000),37 ℃孵育1 h;孵育洗滌完成后加入TMB顯色液避光顯色15 min,加入2 mmol/L H2SO4(50 μL/孔)終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長(zhǎng)450 nm處光密度值(optical density,OD),比較IgG及其亞類IgG1、IgG2a抗體滴度。

1.6 淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè)

收集小鼠6周時(shí)脾淋巴細(xì)胞,加入2×106個(gè)/mL 200 μL脾淋巴細(xì)胞懸液至96孔培養(yǎng)板,每孔加入10 μg Pgp3蛋白刺激淋巴細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置刺激組和未刺激組,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h,每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值,并計(jì)算刺激指數(shù)(stimulation index,SI),SI=(OD刺激組-OD空白組)/(OD未刺激組-OD空白組)。

1.7 細(xì)胞因子的檢測(cè)

收集6周小鼠脾淋巴細(xì)胞,加入1 mL 2×106個(gè)/mL脾淋巴細(xì)胞懸液至24孔培養(yǎng)板,每孔加入10 μg Pgp3蛋白刺激淋巴細(xì)胞,充分混勻,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h,刺激完成后,收集培養(yǎng)液上清液,根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞上清IFN-γ、IL-4水平。

將6周時(shí)的脾淋巴細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板,每孔加入1 μL刺激劑,刺激5 h后收集細(xì)胞,800 g離心5 min后棄去上清,加入0.5 μL Fc阻斷劑孵育10 min后,加入表面染色抗體(CD4-FITC、CD8-Percp Cy5.5)冰上孵育40 min;每個(gè)樣本中加入100 μL IC Fixation Buffer于冰上固定40 min;再加入800 μL破膜液,800 g離心7 min,重復(fù)破膜1次,棄上清后按說明書加入胞內(nèi)抗體(IFN-γ-APC、IL-4-PE),避光孵育60 min,加入300 μL PBS重懸進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞上清IFN-γ、IL-4水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,組間比較采用Student’st檢驗(yàn)和單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SPE乳液的優(yōu)化與表征

SiO2顆粒能穩(wěn)定LP油相,外觀呈細(xì)膩流體狀;光學(xué)顯微鏡下SiO2乳液粒徑小而均一,且10∶2水油比時(shí)顆粒更為均勻。隨超聲功率增加,乳液粒徑逐漸減小且均一,當(dāng)超聲功率達(dá)675 W時(shí),粒徑反而增大且不均勻。隨SiO2質(zhì)量濃度1、5、10 g/L的增大,形成的乳液粒徑增大且均勻性降低。根據(jù)以上結(jié)果,選擇SPE最優(yōu)制備條件為超聲功率337 W、水油比10∶2、SiO2質(zhì)量濃度1 g/L,最優(yōu)條件下SPE粒徑為(300.12±44.26) nm,PDI為0.33±0.12(圖1)。

圖1 SPE乳液的優(yōu)化與表征

2.2 Pgp3蛋白鑒定結(jié)果

如圖2A所示,26 kD處出現(xiàn)與Pgp3蛋白分子量相符合的條帶;Western blotting驗(yàn)證,26 kD處出現(xiàn)明顯條帶(圖2B)。

圖2 Pgp3蛋白的純化和鑒定A為SDS-PAGE鑒定;B為Western blotting鑒定。M為Marker;1和3為GST-Pgp3融合蛋白剪切純化后產(chǎn)物;2為對(duì)照。

2.3 各組抗原特異性抗體的比較

PBS組未檢測(cè)出特異性抗體,其他各組均隨免疫次數(shù)的增多,小鼠血清抗體滴度逐漸升高;6周時(shí),SPE+Pgp3組IgG總抗體、亞類IgG1、IgG2a的滴度高于Pgp3組(P<0.05;圖3),SPE+Pgp3組、Pgp3組IgG2a/IgG1分別為1.22和1.15,其中SPE+Pgp3組的IgG2a升高更為顯著,提示SPE乳液佐劑能提高Pgp3的特異性抗體水平,且SPE+Pgp3能誘導(dǎo)特異性Th1型免疫反應(yīng)。

圖3 各組免疫后小鼠血清IgG總抗體及亞類抗體水平的比較a為P<0.05,與Pgp3組比較。

2.4 各組脾淋巴細(xì)胞增殖的比較

6周時(shí),SPE+Pgp3組SI(3.67±0.24)和Pgp3組SI(2.16±0.11)均明顯高于PBS組(1.05±0.14)(P<0.05),且SPE+Pgp3組高于Pgp3組(P<0.05),說明SPE乳液佐劑能有效促進(jìn)Pgp3蛋白特異性淋巴細(xì)胞增殖。

2.5 各組細(xì)胞因子的比較

SPE+Pgp3組和Pgp3組IFN-γ含量明顯高于PBS組,且SPE+Pgp3組高于Pgp3組(P<0.001;圖4),提示SPE乳液佐劑能有效促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-γ分泌。各組經(jīng)刺激后僅檢測(cè)到低水平IL-4(圖4)。

圖4 各組小鼠免疫后脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子水平的比較a為P<0.001,與PBS組比較;b為P<0.001,與Pgp3組比較。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,Pgp3組、SPE+Pgp3組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的IFN-γ水平明顯高于PBS組,且SPE+Pgp3組高于Pgp3組(P<0.05;圖5),提示SPE乳液佐劑能有效促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞IFN-γ的分泌。

圖5 小鼠免疫后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞細(xì)胞因子水平a為P<0.05,與PBS組比較;b為P<0.05,與Pgp3組比較。

3 討 論

Pgp3蛋白是衣原體致病的重要毒力因子,且具有較強(qiáng)的免疫原性[8],然而單獨(dú)的蛋白抗原難以實(shí)現(xiàn)完全高效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),需要合適的佐劑輔助增強(qiáng)其免疫效果。本實(shí)驗(yàn)將使用優(yōu)化制備的SPE乳液作為佐劑,聯(lián)合Pgp3蛋白制備成疫苗制劑,通過建立小鼠生殖道衣原體感染模型,探討SPE乳液的免疫增強(qiáng)效果及機(jī)制,為Ct感染性疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Pickering乳液是指以固體粒子代替了表面活性劑分子來穩(wěn)定的乳液[9],如鋁佐劑、纖維素、聚苯乙烯[10]、殼聚糖、SiO2[11]等,其固體顆粒在水油界面上自組裝,并在芯層固化后形成球形外殼。與傳統(tǒng)乳液相比,Pickering乳液具有較高的安全性以及穩(wěn)定性[12-13]。而一種理想的顆粒穩(wěn)定劑應(yīng)該具有較高的安全特性、容易獲取、來源豐富及具有疏水性等優(yōu)點(diǎn)[14],這些對(duì)于制備穩(wěn)定安全的Pikering乳液非常重要。SiO2作為一種安全低毒且來源豐富的無(wú)機(jī)金屬顆粒,具有強(qiáng)大的吸附能力且易溶于水,由于比表面積大,表面吸附能力強(qiáng),經(jīng)常用于吸附與分離[15],但由于本身特性難以收集,將其制備成Pickering乳液后可以更好地連接SiO2納米粒子并使其穩(wěn)定。因此,本實(shí)驗(yàn)選用了SiO2作為穩(wěn)定劑,并使用不同條件制備SPE乳液以獲得最優(yōu)Pickering乳劑配方。

已有研究表明,粒徑較小的納米顆粒較粒徑大的納米顆粒能更快進(jìn)入引流淋巴結(jié),有利于適應(yīng)性免疫反應(yīng)的形成[16-17]。因此,合理調(diào)節(jié)納米顆粒的粒徑直徑及其在注射部位停留的時(shí)間是優(yōu)化制備Pickering乳液的關(guān)鍵。除此之外,Pickering乳液佐劑的水油比、納米顆粒質(zhì)量濃度以及超聲功率也是制備出穩(wěn)定均一乳液佐劑的重要參數(shù)[7]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上述一系列條件優(yōu)化后的SPE乳液粒徑小且均勻,能形成穩(wěn)定的顆粒及水油相,是一種有潛力的蛋白裝載和呈遞的候選佐劑。優(yōu)化后的SPE乳液佐劑可通過有效增強(qiáng)Pgp3抗原的吸收、促進(jìn)細(xì)胞因子和趨化因子的增強(qiáng)及釋放,有效募集單核細(xì)胞和粒細(xì)胞至肌肉注射部位,促進(jìn)其被遷移至引流淋巴結(jié)[18-20],以輔助Pgp3蛋白實(shí)現(xiàn)高效細(xì)胞免疫及體液免疫。本實(shí)驗(yàn)使用優(yōu)化后的SPE乳液佐劑聯(lián)合Pgp3蛋白制備成疫苗制劑,以進(jìn)一步增強(qiáng)Pgp3蛋白的免疫反應(yīng)水平。

為觀察聯(lián)合疫苗制劑SPE+Pgp3的體液免疫水平,本實(shí)驗(yàn)采用了ELISA間接法檢測(cè)各組特異性抗體的滴度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著免疫次數(shù)的增加,Pgp3組和SPE+Pgp3組小鼠抗體滴度均逐漸升高,且SPE+Pgp3組抗體滴度顯著高于Pgp3組,說明SPE乳液佐劑能有效提高Pgp3蛋白的體液免疫水平?？贵w亞型結(jié)果顯示,SPE+Pgp3組IgG1與IgG2a均升高,且以IgG2a升高為主。IgG2a的產(chǎn)生高度依賴于Th1型[21-22]細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-2[23-24],而IgG1的產(chǎn)生則主要依賴于Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4,本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合疫苗制劑SPE+Pgp3組IgG2a的相對(duì)高水平說明其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)偏向于Th1型。

淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)是評(píng)估細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要指標(biāo),也能在一定程度上反映機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能,本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)各組脾淋巴細(xì)胞SI發(fā)現(xiàn),與Pgp3組相比,SPE+Pgp3組脾淋巴細(xì)胞SI明顯升高,說明SPE乳液佐劑能有效促進(jìn)Pgp3蛋白特異性淋巴細(xì)胞的增殖。而抗衣原體感染的細(xì)胞免疫則主要依賴于CD4+Th1細(xì)胞反應(yīng)[25-26],其中IFN-γ[27-28]為抗衣原體感染的關(guān)鍵因子。IFN-γ能控制機(jī)體內(nèi)衣原體的載量,并能促進(jìn)一氧化氮合酶的合成、超氧化物歧化酶以及色氨酸的催化,這些機(jī)制可能與機(jī)體殺滅衣原體相關(guān)[29]。研究證實(shí),在機(jī)體感染過程中,CD8+T細(xì)胞同樣會(huì)受到刺激并分泌IFN-γ,且CD8+T細(xì)胞能介導(dǎo)鼻內(nèi)免疫后對(duì)Ct生殖道的跨黏膜保護(hù)性免疫[30]。本實(shí)驗(yàn)將脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性蛋白抗原刺激后,培養(yǎng)上清結(jié)果顯示,Pgp3組與SPE+Pgp3組均產(chǎn)生較高水平IFN-γ,但SPE+Pgp3組產(chǎn)生的IFN-γ顯著高于Pgp3組,說明SPE乳液佐劑能有效促進(jìn)Pgp3蛋白進(jìn)一步產(chǎn)生IFN-γ,增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答水平;各組淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-4水平較低,高水平的IFN-γ與低水平的IL-4進(jìn)一步提示聯(lián)合疫苗制劑誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)偏向于Th1型。為了進(jìn)一步分析細(xì)胞因子IFN-γ的具體細(xì)胞來源,本實(shí)驗(yàn)將脾淋巴細(xì)胞經(jīng)由BFA和cocktail刺激后,檢測(cè)分析由CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ,結(jié)果顯示,與PBS組相比,各組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ均明顯升高,且SPE+Pgp3組顯著高于Pgp3組,提示SPE乳液佐劑能有效促進(jìn)CD4+與CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ。

總而言之,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化制備的SPE乳液佐劑顯著增強(qiáng)了Pgp3蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答及體液免疫應(yīng)答,為Ct疫苗的研制提供了一種潛在的候選佐劑;但該疫苗制劑能否通過增強(qiáng)Pgp3蛋白疫苗的免疫反應(yīng)以達(dá)到預(yù)防Ct感染防治的目的,還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。