基于微衛(wèi)星標(biāo)記的中華絨螯蟹遺傳多樣性分析

田間，馬行空，曾健成，王志紅，葛家春*

（1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2.江蘇省科技資源統(tǒng)籌服務(wù)平臺長江系中華絨螯蟹種質(zhì)資源庫，江蘇 南京 210017；3.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又名河蟹、大閘蟹，隸屬于甲殼綱（Malacostraca），十足目（Decapoda），方蟹科（Grapsidae），絨螯蟹屬（Eriocheir）[1]，廣泛分布于我國長江中下游地區(qū)，是我國重要的經(jīng)濟型蟹類之一，其營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美，市場認(rèn)可度極高[2]。河蟹地理分布也十分廣泛，在我國形成了“長江蟹”“遼河蟹”“甌江蟹”三大蟹系，其中長江蟹以產(chǎn)量高、味道鮮美而聞名[3]。

20 世紀(jì)80 年代后期，由于過度捕撈、水利設(shè)施建設(shè)、水體污染和棲息地被破壞等因素，天然蟹苗資源急劇衰退[4]。目前，隨著河蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)模的壯大，天然苗種已無法滿足河蟹生產(chǎn)需求。人工育苗的開展，解決了大部分養(yǎng)殖企業(yè)、養(yǎng)殖戶的苗種需求，但引進多水系親本、小規(guī)格親本濫用等，出現(xiàn)了幼蟹培育成活率低、規(guī)格參差不齊、性早熟等現(xiàn)象[5-6]。河蟹種質(zhì)問題已然成為制約河蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。在當(dāng)前河蟹的群體選育過程中，由于多年連續(xù)選育且不引進外來親本，可能導(dǎo)致有害等位基因和無用性狀積累到河蟹種群中，有導(dǎo)致河蟹適應(yīng)性和遺傳多樣性降低的風(fēng)險[7]。因此，開展河蟹群體的遺傳多樣性研究，對遺傳育種極為重要。

微衛(wèi)星，又名簡單串聯(lián)重復(fù)序列（SSR），或短串聯(lián)重復(fù)（STR），是以1~6 bp 的重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，具有數(shù)量多、多態(tài)性豐富和易于檢測等特點[8]。微衛(wèi)星多年來被廣泛用作遺傳差異的標(biāo)記，其中包括基因圖譜、種群遺傳學(xué)和法醫(yī)學(xué)[9]。目前，關(guān)于微衛(wèi)星在河蟹遺傳多樣性方面的研究已有報道。熊良偉等[10]利用37 對微衛(wèi)星標(biāo)記，構(gòu)建了河蟹家系遺傳圖譜。李曉暉等[11]利用10 對微衛(wèi)星標(biāo)記，對長江水系3 個選育群體和野生群體進行了遺傳分析。許志強等[12]用6 對微衛(wèi)星標(biāo)記對4個水系河蟹天然群體進行了遺傳多樣性分析。

現(xiàn)于2021 年利用6 個多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，比較分析了單年系F5 代選育群體、“長江2 號”和長江野生群體的遺傳多樣性以及群體間的遺傳分化，以期為河蟹的良種選育和種質(zhì)資源保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚中基地和長江通江河道（非禁捕區(qū)域），采集3 個河蟹群體同屬奇數(shù)年群體，共90 個河蟹個體（表1），運輸至實驗室后，于-20 ℃保存。

表1 3 個群體河蟹樣本采集信息

1.2 DNA 提取與檢測

剪取河蟹附肢肌肉50~80 mg，于1.5 mL 離心管中，加入裂解液和蛋白酶K 混勻，于55 ℃水浴鍋消化1.5 h，直至溶液澄清透明。再向裂解液中加入RNase A，于37 ℃水浴鍋消化1 h。按照傳統(tǒng)酚、三氯甲烷和異戊醇法提取組織DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度和完整性，超微量紫外分光光度計（Thermo Scientific，美國）檢測其質(zhì)量濃度，稀釋至50 μg/L，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及擴增產(chǎn)物的檢測

用6 對已報道的具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物，分析3 個河蟹群體的遺傳多樣性（表2）。PCR 反應(yīng)體系總體積：2×Taq Plus Master Mix II（Vazyme，南京）12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火45 s；72 ℃延伸45 s，34 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物于4 ℃保存。

表2 河蟹6 個微衛(wèi)星位點的引物信息

用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色，檢驗PCR 擴增產(chǎn)物多態(tài)性。銀染后，凝膠由Tanon 凝膠成像儀掃描成像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon指數(shù)（I）、Nei氏遺傳距離和遺傳相似度，采用Popgen 1.32 軟件計算；多態(tài)信息含量（PIC）采用Cervus 3.0 軟件計算。群體間遺傳分化指數(shù)（Fst）、群體分子方差分析（AMOVA），采用Arlequin 3.5 軟件計算。系統(tǒng)樹根據(jù)Nei氏遺傳距離通過MEGA 5 軟件，采用非加權(quán)配對算數(shù)平均法（UPGMA）構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點多態(tài)性

6 個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)見表3。6 個微衛(wèi)星位點共檢測出53 個Na，值為7~11，每個位點平均有17 個。Ne為4.539 4~9.529 4，平均值為7.100 3。I為1.668 3~2.312 3，平均值為2.023 3。Ho為0.638 9~0.861 1，平均值為0.745 4。He為0.790 7~0.907 7，平均值為0.862 2。PIC為0.779 7~0.895 1，平均值為0.850 2。根據(jù)Botstein等[14]的標(biāo)準(zhǔn)，PIC≥0.5 為高度多態(tài)性。本研究中的6 個位點均為高度多態(tài)性位點，說明這些位點均可提供豐富的遺傳信息，能夠有效地進行河蟹群體遺傳多樣性評估。F檢驗數(shù)據(jù)顯示，在6 個位點中，有1 個位點的近交系數(shù)（Fis）值為負(fù)值，其余5 個位點為正值，表明近交程度較高。6 個位點遺傳分化指數(shù)（Fst）的平均值為0.066 1。根據(jù)Wright 建議，4 個位點遺傳分化程度中等（0.05

表3 6 個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)①

2.2 3 個河蟹群體的遺傳多樣性

3 個河蟹群體的遺傳多樣性見表4。由表4可見，長江野生群體的Na（7.666 7）、Ne（5.718 3）、I（1.909 9）、Ho（0.780 0）均為最高。所有群體的PIC均＞0.5，表明群體的遺傳多態(tài)性較高，具有較大的選擇潛力。

表4 3 個河蟹群體的遺傳多樣性

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

群體間的遺傳分化指數(shù)見表5。由表5 可見，3個河蟹群體間Fst為0.052 69~0.084 82，其中單年系F5 代選育群體與長江野生群體體間遺傳分化系數(shù)最大（Fst=0.084 82），各群體間均屬于中等程度的遺傳分化（0.05

表5 群體間的遺傳分化指數(shù)（Fst）

群體的分子方差分析見表6。由表6 可見，群體間變異占總變異的5.34%，且達(dá)到顯著水平（P<0.05），94.66%的遺傳變異來自種群內(nèi)個體間，這表明個體間的遺傳變異遠(yuǎn)大于群體間的遺傳變異，遺傳變異主要存在于個體間。

表6 3 個河蟹群體的分子方差分析①

3 個河蟹群體的遺傳相似度和遺傳距離見表7（以“****”為界，右上角為遺傳相似度，左下角為遺傳距離）。由表7 可見，3 個群體的Nei氏遺傳距離為0.402 8~0.469 3。單年系F5 代選育群體與長江野生群體間的Nei氏遺傳距離最遠(yuǎn)（0.469 3），遺傳相似度最低（0.568 5）。單年系F5 代選育群體與“長江2 號”群體Nei氏遺傳距離最近（0.402 8），遺傳相似度最高（0.688 5）。

表7 3 個河蟹群體的遺傳相似度和遺傳距離

基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建的3 個河蟹群體的UPGMA 系統(tǒng)進化樹見圖1。由圖1 可見，單年系F5代選育群體首先與“長江2 號”群體聚為一類，再與長江野生群體聚為一類。

圖1 基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的3 個河蟹群體的UPGMA 系統(tǒng)進化樹

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

基因雜合度是反映群體遺傳變異的一個最適參數(shù)，微衛(wèi)星位點平均雜合度反映了遺傳結(jié)構(gòu)變異程度高低，雜合度越大則變異越大，群體的穩(wěn)定性越高，選擇潛力越大[15]。本研究中，3 個河蟹群體的He介于0.817 6~0.847 8。許志強等[12]于2009 年收集了4 個河蟹群體，平均He為0.714 9 ~0.758 5；李晶晶等[16]于2012—2013 年收集了4 個河蟹群體，平均He為0.720~0.745，其值均低于本研究。Botstein等[14]研究表明，當(dāng)PIC≥0.5 時為高度多態(tài)性，當(dāng)0.25≤PIC＜0.5 時為中度多態(tài)性。本研究中，3 個河蟹群體PIC值為0.784 1~0.812 5，均為高度多態(tài)性群體，表明其遺傳多樣性均處于較高水平，種質(zhì)資源良好，有一定的種群穩(wěn)定性，其中單年系F5 代選育群體和“長江2 號”2 個選育群體仍具有較大的選擇潛力。

Na和Ne的值越接近，等位基因在群體中分布的越均勻[17]。本研究中，3 個群體的平均Ne小于Na，不均勻程度大小依次為單年系F5 代選育群體、野生群體、“長江2 號”群體。主要原因是等位基因在群體中分布不均勻，導(dǎo)致等位基因的頻率不夠平均[18]。本研究中，長江野生群體等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)，均高于單年系F5 代選育群體和“長江2 號”群體，其原因可能是近年來的增殖放流，導(dǎo)致長江野生河蟹與其他水系河蟹基因交流增加，在一定程度上提高了長江野生河蟹的遺傳多樣性。

3.2 群體遺傳分化與遺傳距離

Fst是用來衡量群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)。Balloux 等[19]認(rèn)為，F(xiàn)st值為0~0.05，表明群體間的遺傳差異很??；Fst值為0.05~0.15，表明群體間發(fā)生了中等水平的遺傳分化；為0.15~0.25 時，表明群體間存在較大的遺傳差異；當(dāng)Fst>0.25 時，表明群體間高度遺傳分化。本研究中，3 個群體兩兩比較，遺傳分化Fst值為0.052 69~0.084 80，表明群體間均有不同程度的遺傳分化。單年系F5 代選育群體與“長江2 號”群體Fst值較?。?.052 69），此結(jié)果與實際生產(chǎn)情況相符，單年系F5 代選育群體部分親本來源于“長江2 號”群體。Karnosky 等[20]認(rèn)為，異交物種來源于種群之間的遺傳變異應(yīng)>90%，而本研究的分子方差分析（AMOVA）顯示，94.66%的遺傳變異來自種群內(nèi)個體間，而來源于種群間的變異只有5.34%。這與劉青等[21]研究結(jié)果相似（群體間0.10%，部分變異來源于群體內(nèi)個體間14.02%，絕大部分變異，來自個體內(nèi)部85.88%）。表明3 個河蟹群體遺傳變異多發(fā)生在群體內(nèi)個體之間，群體內(nèi)個體差較大，存在雜合子缺失的現(xiàn)象[22]。基于遺傳距離的聚類分析，本研究中UPMGA 聚類樹結(jié)果與各群體間的遺傳距離結(jié)果一致，單年系F5 代選育群體與“長江2 號”群體遺傳距離較小，與長江野生群體的遺傳距離較大；聚類分析結(jié)果也表明，單年系F5 代選育群體先與“長江2 號”群體聚為一支，再與長江野生群體聚為一支。

4 結(jié)論

本研究以2 個人工選育群體和1 個野生群體為對象，應(yīng)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)分析各群體的遺傳多樣性和群體間的遺傳分化，結(jié)果表明，3 個群體的遺傳分化程度均處于較高水平，2 個河蟹人工選育群體具有較大的選育潛力。