人可溶性DSG2 胞外域蛋白的真核表達、純化及活性鑒定

陳 楠，李曉月，顧欣雨，吳同鑫，章 汝，李 云，唐香平，戴 勁，易永祥

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院，江蘇 南京 210003；2.南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，江蘇 南京 211166）

橋粒芯蛋白（DSG2）蛋白是一種跨膜蛋白，其在組織中廣泛表達，它的基因在染色體的18q12.1上［1］。DSG2 是經(jīng)典鈣黏著蛋白家族中的一員，它幫助調(diào)控細胞之間進行連接并促進橋粒裝配［2］。橋粒涉及到細胞黏附連接，而黏附連接對腫瘤發(fā)生、發(fā)展又有重要影響，尤其對癌細胞遷移及侵襲有明顯影響［3］。愈來愈多證據(jù)顯示DSG2 參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展，如DSG2 就是評判卵巢癌預后最重要的生物 標 志 物 之 一［4］。DSG2 在EGFR/Src/PAK1 通 路中調(diào)節(jié)肺腺癌發(fā)生、發(fā)展，高表達也會使腫瘤對奧西美替尼耐藥性增強［5，6］。研究發(fā)現(xiàn)，DSG2 過表達于人宮頸癌細胞中，并通過介導MAPK 通路活化對宮頸癌細胞惡性行為產(chǎn)生影響，敲除該基因后能抑制宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲［7］。此外，近年來DSG2 被認為是與人55 型腺病毒（HAdV‐55）結(jié)合的主要高親和力受體［8］。HAdV‐55 感染可導致輕、重兩種疾病，臨床表現(xiàn)為高燒、咳嗽、喉嚨痛、支氣管炎和肺炎等癥狀，有時危及生命［9］。在2005 年新加坡軍事訓練營發(fā)生了HAdV‐55 感染爆發(fā)，226 人出現(xiàn)了急性呼吸道疾病［10］；2015 年北京某培訓基地12 名青少年因為HAdV‐55 感染出現(xiàn)了急性呼吸道癥狀［9］；2016 年中國四川、云南和西藏軍營三百多人由于HAdV‐55 感染出現(xiàn)急性呼吸道癥狀［11］；2019年中國安徽一名患者因為HAdV‐55 感染而死亡［12］。HAdV‐55 已對公眾造成了潛在威脅。

目前，尚無用于HAdV‐55 的預防疫苗或抗病毒藥物。腺病毒纖毛蛋白在與其對應(yīng)受體結(jié)合時介導腺病毒黏附靶細胞并引發(fā)胞吞作用以促進腺病毒進入細胞［13］，這是腺病毒感染致病的第一步。針對病毒進入的抗病毒藥物可以從源頭上防止病毒感染細胞，而且還避免了細胞內(nèi)藥物輸送，防止腺病毒與受體結(jié)合可以有效阻止病毒感染、細胞損傷和后續(xù)的細胞因子釋放［14］。因此設(shè)計阻斷腺病毒與宿主細胞的結(jié)合的抗腺病毒藥物至關(guān)重要。鑒于DSG2 蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和腺病毒感染研究中的重要性，如何高效獲得DSG2 蛋白是研究其蛋白功能及開發(fā)抗腺病毒藥物的關(guān)鍵。本研究通過PCR 擴增DSG2 胞外域片段基因（DSG2ex），在雙酶切和T4 DNA 連接酶的作用下連接到真核表達質(zhì)粒pCMV3‐IgG1 中，構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1。將構(gòu)建好的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T 細胞中外分泌表達DSG2胞外域蛋白，通過Protein A 純化出高純度且具有良好生物活性的可溶性DSG2 胞外域蛋白，建立一種簡單高效的人可溶性DSG2 胞外域蛋白真核表達及純化方法。一方面表達純化的DSG2 胞外域融合蛋白可以用于后期蛋白功能的研究；另一方面表達純化的DSG2 胞外域融合蛋白也可阻斷HAdV55 腺病毒與其天然受體結(jié)合，為抗腺病毒藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細胞和蛋白 pCMV3‐IgG1 質(zhì)粒（含有外分泌信號肽）、pCDNA4To‐DSG2 質(zhì)粒、293T 細胞、CAR 胞 外 域 蛋 白 和HAdV‐55 腺 病 毒Fiber Knob 蛋白由本實驗室保存，Top10 感受態(tài)細胞購自昂羽生物。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基購自江蘇凱基生物公司，胰蛋白酶‐EDTA （0.05%）含酚紅，Opti‐MEM 培養(yǎng)基和Freestyle 293 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，EZ Trans 細胞轉(zhuǎn)染試劑（高效）購自上海李記生物有限公司，Super Red 核酸染料、Fast Blue 蛋白快速染色液購自南京普諾恩生物技術(shù)有限公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量快速提取試劑盒購自北京君諾德生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自美基生物，PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)mega 公司，Pyrobest DNA 聚合酶，DL2000 Mark‐er、DL15000 Marker 和6×loading buffer 購 自Taka‐ra 公司，蛋白純化儀、Protein A 柱子購自思拓凡公司，Anti‐Human IgG antibody 購 自Abcam 公 司，HRP Goat Anti‐Rabbit IgG（H+L）Antibody 購 自APExBIO 公司，50×TAE、氨芐青霉素溶液（100 mg/mL）購自索萊寶公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗人IgG（H+L）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 在Uniprot 上查找人DSG2 胞外區(qū)的氨基酸序列（50‐609）（Uniprot ID：Q14126），然 后 再NCBI 上 找 到 對 應(yīng) 的DNA 序 列（Gene ID：1829），根據(jù)DSG2 胞外區(qū)DNA 序列和pCMV3‐IgG1 質(zhì)粒圖譜上的多克隆位點AfeⅠ酶和BmtⅠ酶，使用Snapgene 軟件設(shè)計出DSG2 胞外區(qū)上游引物和下游引物，上下游引物交由南京金斯瑞公司合成。

DSG2ex上 游 引 物：5′‐GCCGAGCGCT‐GCCTGGATCACCGCCCC‐3′

（下劃線部分為AfeⅠ酶切位點）

DSG2ex下 游 引 物：5′‐ATCGGCTAGC‐GCCCACATAGGAGTCATGC‐3′

（下劃線部分為BmtⅠ酶切位點）

1.2.2 真 核 表 達 載 體 的 構(gòu) 建 以 pCD‐NA4To‐DSG2 質(zhì)粒為模板、使用上下游引物，Py‐robest DNA 聚合酶通過PCR 擴增得到DSG2 胞外區(qū)片段，擴增條件：95 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30 個循環(huán)，72 ℃終延伸2 min，冷卻至12 ℃。使用AfeⅠ酶和BmtⅠ酶將pC‐MV3‐IgG1 載體和DSG2 胞外區(qū)片段雙酶切之后，在T4 DNA 連接酶的作用下構(gòu)建真核表達載體pC‐MV3‐DSG2ex‐IgG1（圖1）。將 該 載 體 轉(zhuǎn) 化 至Top10 感受態(tài)細胞中，37 ℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)氨芐抗性標記篩選得到的陽性克隆菌落PCR 鑒定之后，交由南京斯普金公司進行測序。利用SnapGene 和DNAMAN 軟件對測序結(jié)果進行分析。

1.2.3 質(zhì)粒的大量提取 取10 ng 重組質(zhì)粒加入冰上融化的Top10 感受態(tài)細胞，冰上放置25 min、42 ℃熱激45 s、冰上靜置2 min 后，加入1 mL LB 液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫搖床上以200 r/min 搖晃1 h使其復蘇；然后將菌液以5 000 r/min 在小型離心機上離心1 min，留100 μL 上清吹打混勻之后將其涂布在LB 固體培養(yǎng)板（含氨芐青霉素）上，37 ℃細菌恒溫培養(yǎng)箱中靜置過夜培養(yǎng)。挑取PCR 出目的片段的單克隆菌加入到含有5 mL LB 液體培養(yǎng)基的搖菌管中，再加入至5 μL 氨芐青霉素溶液，將搖菌管放在37 ℃的恒溫搖床上以200 r/min 搖晃6～8 h，再以1∶1 000 的比例轉(zhuǎn)接至150 mL 氨芐抗性（終濃度1%）的LB 液體培養(yǎng)基中在37 ℃的恒溫搖床上以200 r/min 培養(yǎng)過夜，第二天收集菌液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，根據(jù)無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說明書的要求提取質(zhì)粒。

1.2.4 293T 細胞的轉(zhuǎn)染 將293T 細胞接種于6 孔板中（5×105個/孔），置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12～16 h，使細胞密度在80%左右，按EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染試劑（高效）操作說明，將大量提取的質(zhì)粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 和EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑以1∶3比例（推薦比例），3 μg 質(zhì)粒和9 μL 轉(zhuǎn)染試劑混合轉(zhuǎn)染293T 細胞，6 h 后換成Freestyle 293 培養(yǎng)基，分別于轉(zhuǎn)染后48 h、72 h 和96 h 收集培養(yǎng)上清。

1.2.5 表達產(chǎn)物檢測 分別收集轉(zhuǎn)染后48 h、72 h、96 h 和120 h 的上清，12 000 r/min，離心5 min 去除細胞碎片等雜質(zhì)，取等量的48 h、72 h、96 h 和120 h上清放置在ELISA 板子中，用PBS（pH 7.4）稀釋，每孔的量保持100 μL，4 ℃包被過夜。次日倒掉抗原，甩干，每孔加入200 μL PBS 在搖床上洗滌3 次，每孔加入250 μL 的5%脫脂奶粉‐PBST，37 ℃封閉1 h。每孔加入200 μL PBST，3 min/次，洗3 次。每孔 中 加 入100 μL 用5% 脫 脂 奶 粉‐PBST 稀 釋 的HRP‐山羊抗人IgG 抗體（1∶250 稀釋）37 ℃孵育1 h。每孔加入200 μL PBST，3 min/次，洗5 次。每孔加入100 μL 酶反應(yīng)底物TMB，室溫放置5～10 min（避光），每孔加入50 μL ELISA 終止液終止反應(yīng)。將ELISA 板子放在酶標儀上在450 nm 波長處測定其OD450值。

1.2.6 DSG2 胞外域蛋白純化 將293T 細胞接種于10 個10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12～16 h，使細胞密度在80%左右，按EZ Trans 細胞轉(zhuǎn)染試劑（高效）操作說明，將大量提取的 質(zhì) 粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 和EZ Trans 轉(zhuǎn) 染 試劑以1∶3 比例（推薦比例），12 μg 質(zhì)粒和36 μL 轉(zhuǎn)染試劑混合轉(zhuǎn)染293T 細胞，6 h 后換成Freestyle 293培養(yǎng)基，于轉(zhuǎn)染后96 h 收集細胞培養(yǎng)上清。將收集的細胞培養(yǎng)上清，于10 000 r/min，4 ℃離心15 min去除細胞碎片等雜質(zhì)。將離心之后的上清再用0.45 μm 的濾膜過濾，將過濾之后的上清以2 mL/min 與HiTrap Protein A HP 5 mL 預裝柱結(jié)合，用6倍柱體積的PBS 緩沖液（pH 7.4）洗滌預裝柱，然后用3 倍柱體積的0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液（pH 3.5）洗脫目的蛋白至含450 μL 1 mol/L Tris‐HCl 緩沖液（pH 9.0）的收集管中，根據(jù)洗脫出峰位置得到3管純化產(chǎn)物，取20 μL 產(chǎn)物加5 μL 蛋白Loading buf‐fer，在100 ℃水浴鍋中5 min 使其完全變性，用10%SDS‐PAGE 分析其純度。

1.2.7 DSG2 胞外域蛋白的鑒定 將收集的3 管純化產(chǎn)物經(jīng)超濾管濃縮之后，用BCA 試劑盒測定其濃度，對濃縮產(chǎn)物進Western Blotting 分析，一抗為1∶10 000 稀釋的兔Anti‐Human IgG antibody，二抗為1∶5 000 稀釋的山羊抗兔IgG（H+L）HRP，特超敏ECL 化學發(fā)光顯影。

1.2.8 DSG2 胞外域蛋白生物活性檢測 蛋白包被：將純化后的DSG2 胞外域蛋白以及CAR 胞外域蛋白按照400 ng/孔劑量加入 96 孔 ELISA 板中，4 ℃包被過夜。

洗板：第二天倒掉抗原，用PBS 洗3 次。

封閉：加入5 %脫脂奶粉‐PBST，每孔250 μL，37 ℃封閉1 h。

洗 板：每 孔 加 入200 μL PBST，3 min/次，洗3 次。

蛋白孵育：將 Fiber Knob 蛋白按1 ng/孔，0.5 ng/孔，0.25 ng/孔，0.125 ng /孔加至包被有DSG2胞外域蛋白和 Fiber Knob 蛋白的孔中，置于37 ℃溫箱孵育2 h，使蛋白充分結(jié)合。

洗 板：每 孔 加 入200 μL PBST，3 min/次，洗5 次。

結(jié)合第二抗體：每孔加入100 μL 適當稀釋度His Tag Antibody（HRP），37 ℃孵育1 h。（用封閉液稀釋）

洗 板：每 孔 加 入200 μL PBST，3 min/次，洗5 次。

顯色：每孔加入100 μL 酶反應(yīng)底物TMB，室溫放置5～10 min。

終止反應(yīng)：加入50 μL ELISA 終止液終止反應(yīng)。

結(jié)果測定：用酶標儀檢測OD450值。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)結(jié)果均采用GraphPad Prism 9.4.0 軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用（±s）表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重 組 表 達 質(zhì) 粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 的 構(gòu) 建及鑒定

以pCDNA4To‐DSG2 質(zhì) 粒 為 模 板，PCR 擴 增出DSG2 胞外域片段，通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，擴增片段約為1 680 bp 左右，與理論序列大小位置一致（圖2）。使用AfeⅠ酶和BmtⅠ酶將pCMV3‐IgG1 載體雙酶切經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測到一條7 500 bp 左右的條帶，與空質(zhì)粒pC‐MV3‐IgG1 大小相符合（圖2）。重組表達質(zhì)粒pC‐MV3‐DSG2ex‐IgG1 經(jīng)AfeⅠ酶 和BmtⅠ酶 雙 酶切，可見約1 680 bp 的目的基因條帶，大小位置和理論一致（圖2），表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確。測序結(jié)果顯示，獲得的基因序列與目的基因序列完全一致。

圖2 重組表達質(zhì)粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 的構(gòu)建及鑒定圖Fig 2 Construction and identification of recombinant ex-pression plasmid pCMV3-DSG2ex-IgG1

2.2 表達產(chǎn)物的檢測

ELISA 結(jié)果顯示，48 h 能檢測上清中有分泌的DSG2 胞外域蛋白（DSG2ex‐IgG1）表達，與pCMV3‐IgG1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比較，pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 轉(zhuǎn)染后隨著時間的增加上清中DSG2 胞外域蛋白（DSG2ex‐IgG1）表達量逐漸增加（P<0.000 1），96 h上清中表達量最高，120 h 上清中蛋白表達量比96 h略 低。表 明pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 成 功并表達出來了DSG2 胞外域蛋白（DSG2ex‐IgG1），選擇轉(zhuǎn)染96 h 后細胞上清收集進行后續(xù)大量純化蛋白。見圖3 和表1。

表1 DSG2胞外域蛋白不同時間段含量檢測（n=3，±s）Tab 1 Detection of DSG2 extracellular domain protein con-tent at different time periods（n=3，±s）

表1 DSG2胞外域蛋白不同時間段含量檢測（n=3，±s）Tab 1 Detection of DSG2 extracellular domain protein con-tent at different time periods（n=3，±s）

時間（h）t P 48 72 96 120 pC‐MV3‐DSG2ex‐IgG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0.585±0.001 2.070±0.000 2.560±0.002 2.520±0.006 pC‐MV3‐IgG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0.080±0 0.322±0 0.380±0 0.440±0 27.23 261.90 77.05 43.82<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1

圖3 DSG2 胞外域蛋白不同時間段含量檢測Fig 3 Detection of DSG2 extracellular domain protein content at different time periods

2.3 DSG2 胞外域蛋白（DSG2ex‐IgG1）Protein A親和層析結(jié)果

轉(zhuǎn)染96 h 后收集細胞培養(yǎng)上清，將收集的細胞培養(yǎng)上清經(jīng)過Protein A 親和層析結(jié)果如圖4，相對分子質(zhì)量在100～130 kDa 之間出現(xiàn)條帶，與預期大小一致，純化的融合蛋白經(jīng)SDS‐PAGE 分析，可見其純度達90%以上。

圖4 DSG2 胞外域蛋白Protein A 親和層析結(jié)果Fig 4 DSG2 extracellular domain protein Protein A affin-ity chromatography results

2.4 DSG2 胞外域蛋白Western blotting 鑒定

Western Blotting 分 析 顯 示，純 化 的DSG2 胞 外域 蛋 白 可 與 兔Anti‐Human IgG antibody 特 異 性 結(jié)合，相對分子質(zhì)量在100～130 kDa 檢測到特異性條帶，與預期大小一致，見圖5。超濾管濃縮之后BCA測蛋白濃度為0.8 mg/mL。

圖5 純化的DSG2 胞外域蛋白Western Blotting 鑒定Fig 5 Western Blotting identification of purified DSG2 extracellular domain protein

2.5 純化的DSG2 胞外域蛋白生物學活性檢測

ELISA 結(jié) 果 顯 示：將400 ng 的DSG2 胞 外 域 蛋白包被在ELISA 板中，用不同濃度的Fiber Knob 蛋白與之孵育。與陰性蛋白比較，結(jié)果表明Fiber Knob 蛋白與DSG2 胞外域蛋白之間存在直接的相互作用，并且這種相互作用是劑量依賴性的（P<0.000 1）。表明制備純化的DSG2 胞外域蛋白具有明顯結(jié)合Fiber Knob 蛋白的活性。見圖6 和表2。

表2 真核表達純化的DSG2 胞外域蛋白生物學活性檢測（n=3，±s）Tab 2 Detection of biological activity of eukaryotic expressed and purified DSG2 Ectodomain protein （n=3，±s）

表2 真核表達純化的DSG2 胞外域蛋白生物學活性檢測（n=3，±s）Tab 2 Detection of biological activity of eukaryotic expressed and purified DSG2 Ectodomain protein （n=3，±s）

濃度（ng/孔）DSG2 胞外 域蛋白‐Fiber Knob 蛋 白CAR 胞外域蛋白‐Fiber Knob 蛋白（陰性對照組）t P 1 0.5 0.25 0.125 1.820±0.005 1.200±0.001 0.720±0.002 0.430±0.001 0.057±0.000 0.056±0.000 0.056±0.000 0.056±0.000 43.21 76.64 27.80 25.87<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1

圖6 真核表達純化的DSG2 胞外域蛋白生物學活性檢測Fig 6 Detection of biological activity of eukaryotic ex-pressed and purified DSG2 Ectodomain protein

3 討論

近些年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)DSG2 與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此關(guān)于DSG2 蛋白功能的研究非常重要。近幾年關(guān)于HAdV‐55 引起的急性呼吸道疾病報道逐漸增多。HAdV‐55 正成為社區(qū)特別是軍營暴發(fā)急性呼吸道疾病的主要原因。但是尚無HAdV‐55 感染治療的特效藥物及預防疫苗。DSG2 蛋白是HAdV‐55 結(jié)合的主要高親和力受體，所以DSG2 蛋白成為抗腺病毒藥物研究的一個重要方向。如何高效獲得DSG2 蛋白是研究其蛋白功能及開發(fā)抗腺病毒藥物的關(guān)鍵。

本 研 究 成 功 構(gòu) 建 了pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 真核表達載體，通過其轉(zhuǎn)染293T 細胞成功表達了DSG2 胞外域蛋白，并通過信號肽的作用成功將胞外域蛋白分泌到細胞培養(yǎng)基中，不需要對細胞進行裂解來提取蛋白，節(jié)省了時間和成本，而且真核表達可使蛋白產(chǎn)物適當折疊以增加可溶性并避免原核表達中蛋白不能正確折疊而導致包涵體生成的麻煩。另外，整合人IgG Fc 標簽對構(gòu)建重組載體和蛋白構(gòu)象穩(wěn)定等方面都具有重要影響，可提高抗原的清除率和加強純化蛋白的半衰期［15］，同時也能促使融合蛋白以異二聚體的形式存在［16］。融合人Fc片段所制備的抗體是一種全人源化單克隆，能顯著降低融合蛋白對人體的免疫原性［17］。

本研究中當質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑以1∶3 比例轉(zhuǎn)染時，DSG2 胞外域蛋白表達含量在96 h 達到最高，120 h 蛋白表達含量比96 h 略低，且隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，細胞狀態(tài)也越來越差并且時間久蛋白也會降解影響其后續(xù)的活性。所以本研究中選擇96 h 收集細胞培養(yǎng)基進行后續(xù)蛋白純化。但是質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的比例也可能導致蛋白量表達發(fā)生變化，所以這也是一個值得需要優(yōu)化的條件。

綜上所述，本研究成功建立了一種簡單高效的人可溶性DSG2 胞外域蛋白真核表達及純化的方法，且純化出具有生物活性的DSG2 胞外域蛋白，為后期其蛋白功能研究及抗腺病毒藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

作者貢獻度說明：

陳楠：進行研究構(gòu)思、實驗操作、數(shù)據(jù)分析、文稿起草；李曉月、顧欣雨：參與質(zhì)粒構(gòu)建和ELISA 實驗；吳同鑫、章汝：參與細胞培養(yǎng)與蛋白純化；唐香平、李云、戴勁：參與West‐ern blotting 實驗和數(shù)據(jù)分析；易永祥：研究經(jīng)費支出和文章修正。

所有作者聲明不存在利益沖突。