金雀異黃素對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠血脂及胰島素抵抗的改善作用

楊琪，董佳萍，謝琳琳，王鶴霖，劉殊凡，遲曉星，2，3

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心）

多囊卵巢綜合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是育齡期女性最常見(jiàn)的內(nèi)分泌和代謝紊亂疾病[1]，會(huì)導(dǎo)致育齡女性不孕不育，全球發(fā)病率為4%～21%[2]?；加蠵COS 病的婦女表現(xiàn)出高雄激素血癥、高胰島素血癥、無(wú)排卵和多囊卵巢形態(tài)[3]。先前的研究表明，PCOS 與多種代謝異常有關(guān)，包括體脂增加、血脂異常、胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良和高血壓[4]。PCOS 及其引起的多種異常也會(huì)增加相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如卵巢癌癥、糖尿病和心血管疾病等[5]。另一方面，胰島素抵抗（Insulinresistance，IR）是PCOS 病理生理學(xué)的基礎(chǔ)[6]，大多數(shù)PCOS 患者的肥胖和胰島素抵抗指數(shù)風(fēng)險(xiǎn)較高[7]。有學(xué)者認(rèn)為，胰島素抵抗很可能是PCOS 患者發(fā)生糖脂代謝異常的主要原因[8]。PCOS 的胰島素抵抗和血脂異常與脂肪因子密切相關(guān)[9]，如脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）、內(nèi)脂素等，還有其它一些蛋白質(zhì)已經(jīng)作為評(píng)價(jià)PCOS 胰島素抵抗的新標(biāo)記物，如抵抗素、瘦素、血清視黃醇結(jié)合蛋白-4（retinol-binding protein 4，RBP4），但是它們的作用仍然存在爭(zhēng)議，其中脂聯(lián)素和RBP4 的功能紊亂被認(rèn)為是影響PCOS 女性代謝紊亂的最主要因素[10]。目前PCOS 的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚；IR 是PCOS 病理生理過(guò)程中的中心環(huán)節(jié)，改善PCOS 患者的IR，對(duì)降低PCOS 患者的高血脂，進(jìn)而改善患者的臨床癥狀，恢復(fù)患者的排卵功能具有重要意義。

越來(lái)越多的研究致力于使用天然活性成分減輕PCOS 的癥狀。金雀異黃素（Genistein，Gen）、大豆苷元和黃豆黃素是最近研究的最突出的異黃酮[11]。Gen是一種植物雌激素，與雌激素具有結(jié)構(gòu)相似性。進(jìn)入人體后，Gen 可完全與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素的作用，被認(rèn)為是雌激素的天然替代品[12]。據(jù)報(bào)道，異黃酮可以增加糖尿病大鼠的血清胰島素，防止氧化應(yīng)激[13]。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充植物雌激素可顯著降低大鼠的總膽固醇水平和低密度脂蛋白[14]。Gen 的有益效果可能與改善胰島素敏感性和改善血脂譜有關(guān)[15]。但是并未見(jiàn)Gen 對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠胰島素抵抗和血脂的相關(guān)研究。因此，通過(guò)皮下注射脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）和人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）結(jié)合高脂飼料建立多囊卵巢綜合征并發(fā)胰島素抵抗（PCOSIR）大鼠模型，使用該模型研究Gen 對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠體重、臟器重、血糖、胰島素抵抗指數(shù)及血脂等指標(biāo)的影響，考察Gen 對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠血脂及胰島素抵抗的改善作用，旨在為PCOS 患者的臨床治療提供新的靶點(diǎn)，也為未來(lái)開(kāi)發(fā)Gen 保健食品提供一些基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康22 日齡雌性SD（Sprague Dawley）大鼠，SPF 級(jí)，60 只，體重180～220 g，購(gòu)買(mǎi)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。購(gòu)買(mǎi)后置于鼠房自由飲水、飲食，適應(yīng)1 周后開(kāi)始試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)遵循黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

金雀異黃素（純度99.99%）購(gòu)于上海融合有限公司；去氫表雄酮、二甲雙胍購(gòu)自中國(guó)麥克林公司；人絨毛膜促性腺激素購(gòu)于深圳海思安生物技術(shù)有限公司；注射用大豆油購(gòu)于浙江山雨田有限公司；血清胰島素（Fins）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）試劑盒購(gòu)于南京建成生物技術(shù)有限公司；脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）、血清視黃醇結(jié)合蛋白-4（retinolbinding protein 4，RBP4）、瘦素（Leptin）、脂聯(lián)素受體1（Adiponectin Receptor 1，AR1）、胰島素受體底物1（insulin receptor substrate1，IRS1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporters4，GLUT4）試劑盒購(gòu)于上海嚴(yán)謹(jǐn)生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

GA3 型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；酶標(biāo)儀（中國(guó)Mindrary 邁瑞醫(yī)療公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模方法

參考胡偉[17]確立的PCOS-IR 模型大鼠構(gòu)建方法：60 只22 日齡雌性Sprague Dawley（SD）大鼠按體重隨機(jī)分為對(duì)照組（10 只）和PCOS-IR 造模組（50只），模型組大鼠每日皮下注射脫氫表雄酮6 mg/100 g bw+0.2 mL 注射用大豆油，腹部皮下注射1.5 U 人絨毛膜促性腺激素（HCG），每日一次，共42 d。同時(shí)，模型組的大鼠喂飼高脂飼料，誘導(dǎo)PCOS-IR 模型。對(duì)照組大鼠皮下注射相同體積的注射用油、生理鹽水和正常飲食。

1.4.2 分組及給藥方式

60 只SD 大鼠按體重隨機(jī)分為對(duì)照組（10 只）和PCOS-IR 造模組（50 只），造模成功的大鼠分成模型組、Gen 低、中、高劑量組、二甲雙胍組，每組10 只。造模成功后，對(duì)照組和模型組不加Gen 治療，給予等體積花生油；各Gen 劑量組分別給予Gen（溶于花生油）10、20、30 mg·（kg·d）-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予二甲雙胍200 mg·（kg·d）-1，每日一次，連續(xù)21 d，期間記錄大鼠體重。

1.4.3 取樣

末次給藥，禁食12 h，乙醚麻醉，血糖儀測(cè)定空腹血糖值，于腹主動(dòng)脈取血，置于離心管中，室溫靜置，3 000 r·min-1離心15 min，吸取上層血清，凍存于-80 ℃冰箱；摘除子宮、卵巢組織，稱(chēng)取子宮、卵巢組織的重量；取腹膜后白色脂肪組織，凍存于-80 ℃冰箱。

1.4.4 血清樣本的檢測(cè)

取出-80 ℃保存的血清，4 ℃冰箱緩存，放置于冰上溶解。ELISA 法檢測(cè)血清中胰島素、三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的表達(dá)水平。

1.4.5 脂肪組織樣本的檢測(cè)

取出-80 ℃保存的脂肪組織，置于冰上，把組織剪切成細(xì)小的碎片。按照每20 mg 組織加入150～250 μL 中性蛋白裂解液的比例加入裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。將裂解后樣品10 000～14 000 g 離心3～5 min，取上清液，ELISA 檢測(cè)脂肪中瘦素、脂聯(lián)素、RBP4、GLUT4、IRS-1 表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ANOVA 法進(jìn)行組間比較，各組數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，模型組與對(duì)照組間具有顯著性差異的用“#（P＜0.05）”或“##（P＜0.01）”進(jìn)行標(biāo)注，模型組與Gen 劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組樣本均數(shù)間具有顯著性差異的用“*（P＜0.05）”或“**（P＜0.01）”進(jìn)行標(biāo)注，P＜0.05 認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gen 對(duì)各組大鼠體重、子宮和卵巢重量的影響

2.1.1 Gen 對(duì)各組大鼠體重的影響

圖1 灌胃期間各組大鼠體重Fig.1 Body weight of rats in each group during gavage

灌胃期間各組大鼠體重變化如圖所示，第7 天各組大鼠體重與第0 天相比變化都為上升趨勢(shì)，其中對(duì)照組和模型組體重增長(zhǎng)20～25 g，其他劑量組和二甲雙胍組增加量較??；到第14 天，對(duì)照組和模型組仍然處于上升趨勢(shì)，但各劑量組和二甲雙胍組有下降趨勢(shì)，其中Gen-低劑量組下降25 g；經(jīng)過(guò)21 d灌胃后，模型組體重顯著高于對(duì)照組62.17 g，與模型組相比，各劑量組體重顯著降低，其中Gen-低、中劑量組分別降低14.72%和12.51%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gen可有效減輕PCOS 大鼠體重。

2.1.2 Gen 對(duì)各組大鼠子宮和卵巢質(zhì)量的影響

各組大鼠卵巢和子宮質(zhì)量如表1 所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠卵巢、子宮質(zhì)量顯著增大（P＜0.01），其中卵巢質(zhì)量顯著增加27.27%，子宮質(zhì)量增加21.43%；經(jīng)過(guò)Gen 灌胃21 d 后，與模型組相比，Gen-各劑量組和二甲雙胍組顯著降低（P＜0.01），Gen-高劑量組在兩者中都顯著降低，卵巢質(zhì)量顯著降低21.43%，子宮質(zhì)量顯著降低17.65%。結(jié)果顯示，Gen 可以改善PCOS 大鼠卵巢和子宮質(zhì)量。

表1 各組大鼠卵巢、子宮質(zhì)量Table 1 Quality of ovary and uterus of rats in each group

2.2 Gen 對(duì)各組大鼠空腹血糖、胰島素和胰島素抵抗的影響

2.2.1 Gen 對(duì)各組大鼠第0 天和第21 天空腹血糖的影響

各組大鼠第0 天和第21 天空腹血糖值如圖2所示，第0 天時(shí)，模型組空腹血糖值顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；經(jīng)Gen 灌胃21 后，與對(duì)照組相比，模型組空腹血糖值顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，Gen各劑量組血糖顯著下降，其中Gen-中劑量組與模型組相比顯著降低13.95%（P＜0.01），與第0 天Gen-中劑量組相比降低10.15%。結(jié)果表明，Gen 可以有效降低PCOS 大鼠空腹血糖值，中劑量組效果與陽(yáng)性對(duì)照藥物二甲雙胍效果幾乎一致。

圖2 各組大鼠空腹血糖值Fig.2 Fasting blood glucose of rats in each group

2.2.2 Gen 對(duì)各組大鼠第0 天和第21 天胰島素含量的影響

各組大鼠第0 天和第21 天空腹胰島素值如圖3所示，第0 天時(shí)，模型組空腹胰島素值顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；經(jīng)Gen 灌胃21 d 后，與對(duì)照組相比，模型組空腹胰島素值顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，Gen 各劑量組空腹胰島素值顯著下降（P＜0.01），其中Gen-高劑量組與模型組相比顯著降低65.25%，與第0 天Gen-高劑量組相比降低64.08%。結(jié)果表明，Gen可以有效降低PCOS 大鼠空腹胰島素值，高劑量組效果與陽(yáng)性對(duì)照藥物二甲雙胍效果幾乎一致。

圖3 各組大鼠空腹胰島素值Fig.3 Fasting insulin value of rats in each group

2.2.3 Gen 對(duì)各組大鼠第0 天和第21 天胰島素抵抗指數(shù)的影響

各組大鼠第0 天和第21 天空腹胰島素值如圖4所示。第0 天時(shí)，模型組空腹胰島素抵抗指數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；經(jīng)Gen 灌胃21 d 后，與對(duì)照組相比，模型組胰島素抵抗指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，Gen 各劑量組胰島素抵抗指數(shù)都有所下降，其中Gen-高劑量組與模型組相比顯著降低63.10%，與第0 天Gen-高劑量組相比降低59.96%。結(jié)果表明，Gen 可以有效降低PCOS 大鼠胰島素抵抗指數(shù)，高劑量組效果與陽(yáng)性對(duì)照藥物二甲雙胍效果持平。

圖4 各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)值Fig.4 Insulin resistance index of rats in each group

2.3 Gen 對(duì)各組大鼠血脂指標(biāo)的影響

各組大鼠血脂指標(biāo)如表2 所示，與對(duì)照組相比，模型組TG、TC、LDL-C 水平顯著增加（P＜0.01），HDL-C 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，Gen-各劑量組TG、TC、LDL-C 水平顯著降低（P＜0.01），其中Gen-高劑量組與模型組比較TG 水平顯著降低58.76%，TC 水平顯著降低38.94%，LDL-C 水平顯著降低35%；；與模型組相比，Gen-各劑量組HDL-C 水平顯著提升（P＜0.01），其中Gen-高劑量組與模型組比較HDL-C 水平顯著增高97.22%。結(jié)果表明，Gen可以有限降低PCOS 大鼠血清TG、TC、LDL-C 水平，提高PCOS 大鼠血清HDL-C 水平。

表2 各組大鼠血脂指標(biāo)Table 2 Blood lipid indexes of rats in each group

表3 各組大鼠脂肪細(xì)胞中瘦素、脂聯(lián)素、RBP4、GLUT4、IRS-1 水平Table 3 Levels of leptin，adiponectin，RBP4，GLUT4 and IRS-1 in adipocytes of rats in each group

2.4 Gen 對(duì)各組大鼠脂肪細(xì)胞中瘦素、脂聯(lián)素、RBP4、GLUT4、IRS-1 表達(dá)的影響

各組大鼠脂肪細(xì)胞中的影響瘦素、脂聯(lián)素、RBP4、GLUT4、IRS-1 表達(dá)水平如表2 所示，與對(duì)照組相比，模型組瘦素、RBP4 水平顯著增加（P＜0.01），經(jīng)Gen 灌胃21 d 后，與模型組比較，Gen-各劑量組瘦素、RBP4 水平顯著降低，其中Gen-中劑量組瘦素水平比模型組下降30.77%（P＜0.01），Gen-高劑量組RBP4 水平比模型組下降36.18%（P＜0.01）；模型組脂聯(lián)素、GLUT4 和IRS-1 水平顯著低于對(duì)照組大鼠脂肪組織中此指標(biāo)的表達(dá)水平（P＜0.01），與模型組比較，經(jīng)過(guò)Gen 灌胃21 d 后，Gen-高劑量組脂聯(lián)素水平上升47.28%（P＜0.05），GLUT 水平增加73.71%（P＜0.01），IRS-1 水平提升43.74%（P＜0.01）。

3 討論

胰島素抵抗是指細(xì)胞、組織和器官等對(duì)胰島素的敏感性下降，對(duì)葡萄糖的吸收代謝能力降低，代償性的刺激胰島β 細(xì)胞分泌更多的胰島素以維持體內(nèi)葡萄糖水平[16]，在PCOS 患者體內(nèi)就會(huì)表現(xiàn)為高胰島素血癥[17]，從而導(dǎo)致機(jī)體空腹血糖受損甚至發(fā)生糖尿病等糖代謝異常疾病。劉舒婷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 患者血脂異常發(fā)生率與其IR 程度成正比。有文獻(xiàn)報(bào)道大豆異黃酮（包括GEN 和大豆黃素）可改善高糖血癥與高胰島素血癥[19-20]。Jayagopal 等[21]給32 例Ⅱ型糖尿病絕經(jīng)后婦女飲食中添加植物雌激素（異黃酮132 mg·d-1）與安慰劑（纖維素30 g·d-1）12 周，發(fā)現(xiàn)植物雌激素可顯著降低空腹血糖和空腹胰島素水平，改善IR。Goo dman-G ruens 對(duì)絕經(jīng)后女性的一項(xiàng)研究也表明GEN 和大豆黃素可以降低胰島素對(duì)口服葡萄糖負(fù)荷的反應(yīng)，改善胰島素敏感性[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)GEN 可以有效降低PCOS 大鼠空腹血糖和空腹胰島素水平，改善IR。這些結(jié)果說(shuō)明GEN 能夠有效改善PCOS 大鼠的糖代謝。

研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素素可以增強(qiáng)胰島素敏感性促進(jìn)聯(lián)胰島素分泌，同時(shí)抑制糖異生，但是PCOS 患者脂聯(lián)素水平降低，導(dǎo)致糖異生增加[23]；瘦素能夠作用于胰島素細(xì)胞受體，影響胰島素分泌和釋放，脂肪細(xì)胞分泌瘦素，進(jìn)而導(dǎo)致IR，而且PCOS 患者都存在瘦素抵抗現(xiàn)象，進(jìn)一步導(dǎo)致糖脂代謝異常[24-25]；其次，過(guò)量的脂肪會(huì)導(dǎo)致胰島素受體數(shù)量減少，胰島素敏感性降低，進(jìn)一步造成IR[26]。文章的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了上述內(nèi)容，與對(duì)照組相比，模型組瘦素、RBP4水平顯著增加，經(jīng)Gen 灌胃后，瘦素、RBP4 水平顯著降低；模型組脂聯(lián)素、GLUT4 和IRS-1 水平顯著低于對(duì)照組，Gen 灌胃有效提高脂聯(lián)素、GLUT4 和IRS-1 水平。

4 結(jié)論

研究金雀異黃素對(duì)由皮下注射脫氫表雄酮（DHEA）和人絨毛膜促性腺激素（HCG）結(jié)合高脂飼料建立的多囊卵巢綜合征（PCOS-IR）大鼠血糖、血脂及胰島素抵抗的改善作用。研究結(jié)果表明，J 金雀異黃素可以有效改善PCOS 大鼠體重、卵巢和子宮質(zhì)量；金雀異黃素通過(guò)調(diào)節(jié)瘦素、脂聯(lián)素、RBP4、GLUT4和IRS-1 水平進(jìn)一步改善PCOS 大鼠IR 現(xiàn)象，從而調(diào)節(jié)PCOS 大鼠血糖和血脂代謝情況。