基于生物信息學(xué)研究分析彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的潛在靶標(biāo)與挖掘治療藥物

梅漢瑋,何國(guó)平,趙軒竹,王華慶

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,天津 301617; 2.天津市人民醫(yī)院 腫瘤診療中心,天津 300122; 3.南開大學(xué)人民醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,天津 300122)

0 引言

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤是最常見的非奇霍金淋巴瘤類型,約占所有非霍奇金淋巴瘤的31%。不同類型的DLBCL具有不同分子特征和預(yù)后特點(diǎn)[1],盡管臨床基于R-CHOP的化療可治愈大多數(shù)患者,但仍有30%～40%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)難治等問題。研究驅(qū)動(dòng)DLBCL的發(fā)病機(jī)制,預(yù)測(cè)尋找治療DLBCL的化學(xué)藥物具有重要的實(shí)踐和理論價(jià)值。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)集數(shù)據(jù)獲取

從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取DLBCL基因芯片GSE56315測(cè)序基因集,從ICGC數(shù)據(jù)庫中獲取DLBCL基因數(shù)據(jù),通過R語言軟件篩選出各數(shù)據(jù)集中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異基因取交集。將兩者數(shù)據(jù)共同差異基因芯片與GSE180161芯片數(shù)據(jù)中暴露風(fēng)險(xiǎn)一致的基因再次取交集,獲得實(shí)驗(yàn)集基因差異表達(dá)基因。

1.2 關(guān)鍵基因篩選

將實(shí)驗(yàn)集DEGs基因輸入STRING11.5數(shù)據(jù)庫中,繪制出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖;將PPI數(shù)據(jù)輸出保存,采用Cytoscape 3.9.1軟件實(shí)現(xiàn)可視化,基于CytoHubba插件中的MCC算法,篩選出PPI蛋白互作中排名前10的hub基因。

1.3 化學(xué)藥物篩選

將預(yù)測(cè)Top10靶標(biāo)作為治療靶點(diǎn),在Cmap數(shù)據(jù)庫中篩選對(duì)Top10具有生物學(xué)效應(yīng)的化學(xué)藥物。

1.4 關(guān)鍵基因驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證Top10關(guān)鍵基因?qū)LBCL患者預(yù)后情況的影響,采用帶有預(yù)后的芯片GSE180161作為驗(yàn)證集數(shù)據(jù),驗(yàn)證DEGs中Top10關(guān)鍵基因的預(yù)后生存情況。

1.5 靶點(diǎn)-藥物分子對(duì)接

根據(jù)分析結(jié)果選擇具有生存意義的hub基因與預(yù)測(cè)的治療藥物進(jìn)行分子對(duì)接,通過Pymol軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-藥物可視化結(jié)果。

2 研究結(jié)果

2.1 差異基因數(shù)據(jù)分析

通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫匯總DLBCL組織芯片GSE56315進(jìn)行R語言分析,得到差異表達(dá)基因,上調(diào)基因1 336個(gè),下調(diào)基因1 257個(gè)(圖1);在ICGC數(shù)據(jù)庫中獲取的DLBCL差異基因中,上調(diào)基因3 483個(gè),下調(diào)基因368個(gè)(圖2)。用R語言軟件取交集,共獲取上調(diào)基因456個(gè),下調(diào)基因38個(gè)。將高表達(dá)與低表達(dá)差異基因分別與芯片GSE180161數(shù)據(jù)集中風(fēng)險(xiǎn)因素一致的基因做交集,使用R語言軟件分析芯片GSE180161數(shù)據(jù)集與高表達(dá)基因,取交集共獲得61個(gè)DEGs基因。將芯片GSE180161數(shù)據(jù)集中的基因(HR<1.0)與低表達(dá)基因取交集,得到13個(gè)DEGs基因。

圖1 組織芯片GSE56315(55個(gè)淋巴瘤組織與33個(gè)扁桃腺組織)差異基因Fig.1 Differential genes of tissue microarray GSE56315 (55 lymphoma tissues and 33 tonsil tissues)

圖2 ICGC數(shù)據(jù)庫(27個(gè)DLBCL組織樣本和7個(gè)扁桃腺組織樣本)差異基因Fig.2 Differential genes of ICGC database (27 DLBCL tissue samples and 7 tonsil tissue samples)

2.2 PPI篩選關(guān)鍵基因

將上述DEGs基因?qū)隨TRING 11.5數(shù)據(jù)庫中,以圖片形式和數(shù)據(jù)格式輸出PPI關(guān)系結(jié)果。利用Cytoscape 3.9.1 軟件分析PPI數(shù)據(jù),利用插件中的MCC算法計(jì)算出前10位hub基因,即TLR2、IL10、CCRL2、CD163、S100A9、C1QA、SIGLEC1、C5AR1、VSIG4、S100A8。

2.3 治療DLBCL的化學(xué)藥物篩選

將與DLBCL發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的Top 10靶標(biāo)導(dǎo)入Cmap數(shù)據(jù)庫中,從中篩選出治療DLBCL最優(yōu)的靶標(biāo)化學(xué)藥物Palomid-529。

2.4 Top10基因預(yù)后生存情況

為進(jìn)一步驗(yàn)證Top10基因是否對(duì)DLBCL發(fā)生發(fā)展及預(yù)后生存具有臨床意義,基于芯片GSE180161數(shù)據(jù)集驗(yàn)證Top10基因預(yù)后生存情況,發(fā)現(xiàn)CCRL2、SIGLEC1、VSIG4具有顯著生存意義,而CD163基因的預(yù)后生存差異值為(P=0.05),因此將CCRL2、SIGLEC1、VSIG4、CD163靶點(diǎn)作為治療DLBCL疾病的關(guān)鍵靶標(biāo)。

2.5 靶標(biāo)-藥物分子對(duì)接

基于Cmap數(shù)據(jù)庫篩選出治療DLBCL的最優(yōu)化學(xué)物質(zhì),利用Auto dock軟件,對(duì)化學(xué)藥物與關(guān)鍵的4個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行治療性模擬對(duì)接,發(fā)現(xiàn)對(duì)接結(jié)Palomid-529能有效地與靶標(biāo)結(jié)合,CD163、CCRL2、VSIG4、SIGLEC1的能量值分別為-6.79 KJ/mol、-8.99 KJ/mol、-6.12 KJ/mol、-5.17 KJ/mol。

3 討論

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤臨床治療基于R-CHOP方案可治愈大多數(shù)患者,但仍有部分患者發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,因此迫切需要尋找有效、特異性高、敏感的分子靶標(biāo)及治療藥物。對(duì)GEO與ICGC數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),CCRL2、SIGLEC1、VSIG4、CD163基因是可能驅(qū)動(dòng)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因。CCRL2又名為趨化因子誘餌受體2,是一種跨膜G蛋白偶聯(lián)受體,在人體組織和器官中廣泛分布并參與了腫瘤炎癥浸潤(rùn)與免疫反應(yīng)。研究表明,敲除CCRL2基因可抑制骨髓增生異常綜合征的發(fā)生發(fā)展[2]。VSIG4又名V-set和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包含4,是I型膜蛋白的一種,臨床上一直被認(rèn)為是致癌基因。研究發(fā)現(xiàn),VSIG4基因在肝癌、肺癌、卵巢癌等癌種中出現(xiàn)過表達(dá)且抑制招募T細(xì)胞淋巴細(xì)胞激活,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。Jin Roh等對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),VSIG4高表達(dá)組的總生存期明顯低于VSIG4低表達(dá)組,說明多發(fā)性骨髓瘤中的VSIG4基因表達(dá)可作為預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn),在DLBCL患者中VSIG4高表達(dá)組的總生存期明顯低于VSIG4低表達(dá)組,由此猜想VSIG4 基因表達(dá)可作為DLBCL患者預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo),VSIG4靶點(diǎn)可作為治療靶標(biāo)。CD163和VSIG4均是I型膜蛋白,研究表明,CD163的表達(dá)與DLBCL不良預(yù)后有關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),CD163陽性乳腺癌患者明顯出現(xiàn)較差的總生存期和較短的無病生存率且高表達(dá)預(yù)后情況差,因此CD163基因有望作為治療DLBCL的一個(gè)重要靶標(biāo)。SIGLEC1是唾液酸黏附素,又名CD169。SIGLECS蛋白廣泛表達(dá)分布于免疫細(xì)胞的表面,在維持平衡免疫與炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞能夠通過唾液酸化配體與抑制性SIGLECS結(jié)合,實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸,這是腫瘤治療出現(xiàn)復(fù)發(fā)難治的重要原因[3]。而淋巴瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)難治問題很可能是因?yàn)镈LBCL患者存在SIGLEC1基因的高表達(dá)情況。

通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)和ICGC數(shù)據(jù)庫中DLBCL的基因表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因61個(gè)DEGs、下調(diào)基因13個(gè)DEGs,將其作為靶標(biāo)蛋白得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò),運(yùn)用Cytoscape軟件中的算法,分析了Top10靶點(diǎn)(TLR2、IL10、CCRL2、CD163、S100A9、C1QA、SIGLEC1、C5AR1、VSIG4、S100A8)并對(duì)其預(yù)后生存情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)CCRL2、SIGLEC1、VSIG4、CD163對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的預(yù)后有一定的臨床價(jià)值,有望成為評(píng)估預(yù)后的新指標(biāo)和治療靶點(diǎn)?；贑map數(shù)據(jù)分析篩選發(fā)現(xiàn),Palomid-529可能會(huì)成為新的靶向治療藥物。通過分子-靶標(biāo)對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn),Palomid-529能與CCRL2、SIGLEC1、VSIG4、CD163關(guān)鍵靶標(biāo)結(jié)合良好,可能成為治療DLBCL的新的靶向藥物,為治療提供新思路。