烏梅水提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

臧 蕾,劉明雨,邢揚(yáng)帆,李 振

(臨沂大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,山東 臨沂 276000)

金黃色葡萄球菌(SA)是臨床上常見的致病菌,廣泛存在于自然界中,是醫(yī)院和社區(qū)感染致病的重要病原菌[1],隨著抗菌藥物的廣泛使用,致使耐藥菌菌株數(shù)量漸增。而化學(xué)合成藥物研發(fā)難度大,時(shí)間長(zhǎng),毒副作用明顯,故從中草藥中獲取抗菌物質(zhì)、提高機(jī)體抗病力成為研究熱點(diǎn)。

烏梅是薔薇科植物梅的用藥部分[2],研究發(fā)現(xiàn)其含有有機(jī)酸、萜類、脂類、黃酮[2]等多種有效成分,具有抑菌[3]、抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫和降血糖等作用[4]。探討烏梅水提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性及作用機(jī)制,可為其開發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

高速中藥粉碎機(jī)(浙江哈瑞工貿(mào)有限公司生產(chǎn))、分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司生產(chǎn))、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海貝茵生物科技有限公司生產(chǎn))、臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司有限公司生產(chǎn))、電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司生產(chǎn))、高壓滅菌鍋(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))、電熱套(常州潤(rùn)華電器有限公司生產(chǎn))、SW-CJ-1D 超凈工作臺(tái)(蘇州精華設(shè)備總廠生產(chǎn))、生化培養(yǎng)箱(常州欣耀宇儀器制造有限公司生產(chǎn))、酶標(biāo)儀(濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))、超純水機(jī)(杭州億捷科技有限公司生產(chǎn))、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鶴壁市冶金機(jī)械設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

1.2 藥物與試劑

烏梅(山東老百姓大藥房提供)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(青島高科學(xué)海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))、堿性磷酸酶(ATP)試劑盒與乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒及蛋白定量測(cè)定試劑盒(上海嘉楚生物工程有限公司生產(chǎn))、磷酸氫二鈉與氯化鉀(天津市鑫鉑特化工有限公司生產(chǎn))。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌(中國(guó)藥品檢驗(yàn)研究院生產(chǎn))。

1.4 方法

1.4.1 烏梅提取物的制備

取20 g烏梅粉置于500 mL燒瓶,加入200 mL蒸餾水,浸泡0.5 h,煮沸回流1.5 h,過(guò)濾,制得提取液。濾渣,再加蒸餾水100 mL,再次煮沸回流45 min并過(guò)濾,合并提取液,濃縮,4 ℃保存,備用[5]。

1.4.2 藥敏試驗(yàn)

采用管碟法,取融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基適量,置培養(yǎng)皿中靜置3～5 min,凝固后每個(gè)培養(yǎng)皿中加入107CFU/mL的SA菌懸液適量,用L型玻璃棒涂抹均勻,放置于5個(gè)牛津杯。將不同濃度烏梅提取液(50、25、12.5 mg/mL)、青霉素(陽(yáng)性對(duì)照)、生理鹽水(陰性對(duì)照)按250 μL/個(gè)加入牛津杯,放置在生化培養(yǎng)箱中,37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h,測(cè)量抑菌圈直徑(IZD,mm),進(jìn)行結(jié)果判定。IZD≥20 mm,極度敏感;15≤IZD<20 mm,高度敏感;10≤IZD<15 mm,中度敏感;5≤IZD<10 mm,輕度敏感;IZD<5 mm,不敏感[6]。

1.4.3 最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

利用試管二倍稀釋法,取9支干燥無(wú)菌試管,各加入1 mL含107CFU/mL的SA菌懸液。第1管加入0.4 g/mL的烏梅提取液1 mL,混勻,吸出1 mL加至第2管中,順次操作至第7管,混勻,吸取1 mL棄去。第8管加入青霉素1 mL,為陽(yáng)性對(duì)照管。第9管加入生理鹽水1 mL,為陰性對(duì)照管。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)16～24 h,以無(wú)SA生長(zhǎng)的試管所在的藥物濃度認(rèn)定為最小抑菌濃度(MIC)。將未見細(xì)菌生長(zhǎng)的試管搖勻,分別吸取100 μL加入到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,置生化培養(yǎng)箱內(nèi),37 ℃培養(yǎng)18～24 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況,計(jì)算平板上的SA菌落,以活菌計(jì)數(shù)法表示平均菌落數(shù),<5個(gè)對(duì)應(yīng)的最小稀釋度的提取物質(zhì)量濃度即最小殺菌濃度(MBC)[6-7]。

1.4.4 烏梅水提取物抑菌機(jī)制研究

1)烏梅水提取物對(duì)金黃色葡萄球菌堿性磷酸酶的影響[8]。準(zhǔn)備LB液體培養(yǎng)基,分別加入烏梅水提取物,使其濃度分別為MIC和2MIC。以不含烏梅水提取物的培養(yǎng)基作為對(duì)照,分別加入SA菌懸液,37 ℃、150 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng),于0、2、4、6、8 h時(shí)吸取菌液,3 500 r/min離心10 min,取上清液,用試劑盒測(cè)定AKP活性。

2)烏梅水提取物對(duì)金黃色葡萄球菌乳酸脫氫酶活性的影響[9]。分別于0、2、4、6、8 h時(shí)取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組SA菌懸液,3 500 r/min離心5 min,取上清液,用試劑盒測(cè)定胞外LDH活性。

3)烏梅提取物對(duì)金黃色葡萄球菌胞外蛋白的影響。分別于0、2、4、6、8 h時(shí)取試驗(yàn)組與對(duì)照組SA菌懸液,3 500 r/min離心5 min,取上清液,加入考馬斯亮藍(lán)染色劑,靜置5 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處吸光度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 烏梅水提取物抑菌效果

2.1.1 藥敏試驗(yàn)

從表1可知,烏梅水提取物可明顯抑制SA。濃度分別為12.5、25、50 mg/mL時(shí),抑菌圈直徑分別為17.50±0.94、20.11±1.03、22.82±0.88 mm,陽(yáng)性對(duì)照,抑菌圈直徑為15.34±1.26 mm,陰性對(duì)照,無(wú)抑菌現(xiàn)象,說(shuō)明金黃色葡萄球菌對(duì)烏梅水提取物高度敏感。

表1 烏梅水提取物抑菌直徑Tab.1 Bacteriostatic diameter of plum extract

2.1.2 對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

MIC和MBC能夠直觀反映抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度。由表2可知,烏梅提取物對(duì)SA的MIC和MBC分別為6.25 mg/mL、12.5 mg/mL,陰性對(duì)照組菌體生長(zhǎng)良好。

表2 烏梅提取物對(duì)SA的MIC、MBC測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of MIC and MBC of plum extract against Staphylococcus aureus

2.2 烏梅水提取物抑菌作用機(jī)制

2.2.1 對(duì)金黃色葡萄球菌堿性磷酸酶的影響

烏梅水提取物對(duì)SA堿性磷酸酶(AKP)的影響結(jié)果見圖1。隨著處理時(shí)間的增加,經(jīng)過(guò)MIC和2MIC烏梅水提取物處理后,菌懸液中AKP含量持續(xù)升高,在6 h后趨于平穩(wěn)。2MIC烏梅提取物處理的SA菌懸液AKP含量超過(guò)MIC,表明烏梅水提取物可破壞SA細(xì)胞壁,從而使AKP含量增加[10]。

圖1 烏梅水提取物對(duì)SA堿性磷酸酶的影響Fig.1 Effect of plum extract on alkaline phosphatase of Staphylococcus aureus

2.2.2 對(duì)金黃色葡萄球菌乳酸脫氫酶的影響

烏梅水提取物對(duì)SA乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響結(jié)果見圖2。隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng),烏梅水提物處理菌液中LDH活性不斷增強(qiáng),2 MIC組烏梅提取物處理的SA菌懸液LDH活性高于MIC組,說(shuō)明烏梅提取物的處理使SA細(xì)胞膜通透性增加,導(dǎo)致LDH含量增加。

圖2 烏梅提取物對(duì)SA乳酸脫氫酶的影響Fig.2 Effect of plum extract on lactic dehydrogenase of Staphylococcus aureus

2.2.3 對(duì)金黃色葡萄球菌胞外蛋白的影響

烏梅水提取物對(duì)SA胞外蛋白的影響如3圖所示。隨著處理時(shí)間的增加,胞外蛋白濃度逐漸增加,其中2MIC烏梅水提取物處理的SA菌懸液胞外蛋白含量高于MIC,表明烏梅水提取物可增加SA的細(xì)胞膜通透性,造成細(xì)菌蛋白質(zhì)外泄,從而引起菌體胞外蛋白含量的增加。

圖3 烏梅水提取物對(duì)SA胞外蛋白的影響Fig.3 Effect of plum extract on extracellular protein of Staphylococcus aureus

3 討論

通過(guò)宿主細(xì)胞內(nèi)的支撐和保護(hù),金黃色葡萄球菌可以逃避宿主防御機(jī)制和大多傳統(tǒng)的抗菌藥物治療[11]。研究表明,烏梅提取物濃度分別為12.5、25 mg/mL時(shí),對(duì)SA分別達(dá)到高度敏感和極度敏感狀態(tài),MIC、MBC分別為6.25 mg/mL和12.5 mg/mL,表現(xiàn)出良好的抑菌作用。AKP位于SA細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜間隙中,一般不向外分泌,當(dāng)SA細(xì)胞壁遭到破壞,AKP才會(huì)進(jìn)入胞液中,因此細(xì)胞外AKP含量變化可表明細(xì)菌細(xì)胞壁的完好性[8]。細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障,當(dāng)烏梅水提取物作用SA后,細(xì)胞膜通透性增加,細(xì)胞漿內(nèi)的LDH、可溶性蛋白質(zhì)可釋放到培養(yǎng)液中[12],因此LDH水平、可溶性蛋白質(zhì)含量的變化可間接反映細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明,烏梅水提取物對(duì)SA的最低抑菌濃度為6.25 mg/mL、最小殺菌濃度為12.5 mg/mL。經(jīng)過(guò)烏梅水提取物處理后,SA的胞外AKP、LDH活性及胞外蛋白含量明顯增加,因此烏梅水提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用可能是通過(guò)破壞菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使細(xì)胞內(nèi)容物外泄所致。