植物組織培養(yǎng)中污染的產(chǎn)生與防控

顏盟 劉美香

摘? ?要? ?隨著育苗技術(shù)的發(fā)展，組培工廠化育苗已是目前最便捷高效的方式之一，但隨之而來(lái)的問(wèn)題也日益突出，其中生產(chǎn)中出現(xiàn)的各類污染無(wú)疑成為影響育苗效率的大問(wèn)題。就組培育苗中污染產(chǎn)生的原因進(jìn)行分析歸納，對(duì)癥下藥，提出有效防治意見(jiàn)。

關(guān)鍵詞? ?組織培養(yǎng);育苗;污染

組培污染是指在組織培養(yǎng)過(guò)程中，由于皮膚、衣服和周圍環(huán)境中微生物的侵入，在培養(yǎng)容器中大量繁殖，導(dǎo)致培養(yǎng)材料無(wú)法正常生長(zhǎng)的現(xiàn)象。污染存在于組培生產(chǎn)中的每一個(gè)環(huán)節(jié)，一旦污染發(fā)生，將會(huì)對(duì)組培生產(chǎn)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，甚至成為組培工廠化育苗成敗的關(guān)鍵。污染主要分為真菌和細(xì)菌污染，細(xì)菌污染是瓶苗或者培養(yǎng)基上出現(xiàn)黏液狀物或不透明水跡，真菌污染常見(jiàn)的是黑、白、黃、紅、青等各色霉菌。大多產(chǎn)生在高溫高濕的環(huán)境中，控制不當(dāng)或處理不及時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致污染大面積擴(kuò)散，對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。

1? ?污染的產(chǎn)生與危害

1.1? ?污染的產(chǎn)生? ?污染由多種因素引起，制劑、接種、洗滌等生產(chǎn)過(guò)程均會(huì)發(fā)生，消殺不徹底的生產(chǎn)環(huán)境也會(huì)滋生細(xì)菌霉菌等。

1）接種操作不規(guī)范。接種是培養(yǎng)前最后一個(gè)環(huán)節(jié)，接種時(shí)不嚴(yán)格無(wú)菌操作，接種環(huán)境不清潔，工人防護(hù)不到位，接種切苗裝瓶時(shí)技術(shù)不規(guī)范，接種臺(tái)堆放過(guò)多材料等物品擋住氣流，降低工作臺(tái)的清潔效率，都會(huì)使瓶苗在培養(yǎng)初期出現(xiàn)污染。

2）制劑洗滌。制劑與洗滌為組培生產(chǎn)的準(zhǔn)備工作，屬于滅菌前流程，若清洗不到位，培養(yǎng)瓶和蓋有殘存的孢子，或制劑灌裝時(shí)污染瓶或蓋，滅菌不到位，都會(huì)產(chǎn)生污染。一般這種污染細(xì)菌偏多，會(huì)在培養(yǎng)基滅菌后3～5天內(nèi)產(chǎn)生，出現(xiàn)白色或乳白色團(tuán)狀污染，應(yīng)及時(shí)將其撿出并處理;個(gè)別會(huì)出現(xiàn)霉菌污染，多是因?yàn)楣嘌b時(shí)培養(yǎng)基瓶蓋未擰好，或滅菌后培養(yǎng)瓶或蓋、透氣膜等破損，在培養(yǎng)基冷卻過(guò)程中，環(huán)境中的霉菌孢子隨著空氣的流動(dòng)進(jìn)入培養(yǎng)基而產(chǎn)生。

3）外植體的選取與消毒。建立新材料時(shí)外植體選取不合適，本身帶菌則會(huì)在后續(xù)擴(kuò)繁中一直出現(xiàn)內(nèi)生菌污染;或者外植體選取適宜但消毒不到位也會(huì)導(dǎo)致后續(xù)接種過(guò)程中出現(xiàn)霉菌污染，甚至出現(xiàn)黃色或者白色細(xì)菌污染，從而導(dǎo)致新材料建立失敗。

4）培養(yǎng)環(huán)境不潔凈。潮濕溫暖的環(huán)境容易滋生細(xì)菌、霉菌。一般在多雨或者高溫季節(jié)，如北方的4月、7—8月，培養(yǎng)室因環(huán)境濕度、溫度的升高易產(chǎn)生大范圍霉菌污染，若不能及時(shí)治理，會(huì)對(duì)當(dāng)年的生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失。

1.2? ?污染的危害? ?工廠化育苗時(shí)，組培瓶苗出現(xiàn)污染后一般是直接舍棄，不能再繼續(xù)培養(yǎng)，一旦引起大規(guī)模污染將會(huì)產(chǎn)生不可挽回的損失，輕則繼代大量減產(chǎn)導(dǎo)致后續(xù)生產(chǎn)計(jì)劃推進(jìn)困難，重則損失掉整個(gè)種源，直接停產(chǎn)。

對(duì)于保留種源或者實(shí)驗(yàn)性用苗，產(chǎn)量少，品質(zhì)要求高，污染更是殺傷力巨大，會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)估的影響。

2? ?污染的防治

常態(tài)化預(yù)防，及時(shí)治理，防治同步進(jìn)行。

2.1? ?規(guī)范接種? ?接種前換好無(wú)菌服、帶好口罩帽子、穿接種室專用的無(wú)菌鞋;手部用肥皂水清洗多次;用肥皂水清洗接種所用抹布，并用純凈水清洗，在使用前噴適量75%的酒精。隨后打開接種臺(tái)風(fēng)機(jī)，用75%酒精噴灑臺(tái)面及接種空間，用抹布擦干凈臺(tái)面，包括臺(tái)面的滅菌器、酒精燈及泡鑷桶等，所用培養(yǎng)基及待轉(zhuǎn)接母瓶上接種臺(tái)前用噴了酒精的抹布擦凈瓶身，并擦凈雙手。接種時(shí)使用滅過(guò)菌的刀、鑷、接種盤或培養(yǎng)皿，刀、鑷及刀鑷架在酒精燈外焰進(jìn)行灼燒滅菌，灼燒后取用時(shí)手不過(guò)刀鑷柄，切苗時(shí)雙手平持刀鑷在接種盤外操作，不得豎拿刀鑷使雙手凌空在接種盤上方。裝瓶時(shí)，要灼燒培養(yǎng)基瓶口，然后保持培養(yǎng)瓶在酒精燈周15 cm內(nèi)，瓶蓋不得放在雙手下方，裝苗時(shí)苗不可碰觸到瓶口，鑷子不得伸入到培養(yǎng)基中，封口前瓶口及瓶蓋再次用酒精燈灼燒滅菌。

2.2? ?制劑、洗滌注意細(xì)節(jié)? ?在制劑洗滌的過(guò)程中，破損及霉菌侵染無(wú)法清洗干凈的培養(yǎng)容器，及時(shí)揀出棄用;灌裝機(jī)清洗到位，不留衛(wèi)生死角;滅菌鍋定期檢修，確保其滅菌質(zhì)量。在滅菌結(jié)束壓力降到零后，待鍋內(nèi)稍冷卻后再出鍋，避免冷空氣被倒吸入培養(yǎng)瓶中引起霉菌污染。為防治接種后內(nèi)生菌的產(chǎn)生，制劑時(shí)可加入適宜的抑菌劑。

2.3? ?嚴(yán)把外植體選擇及消毒關(guān)? ?外植體的采摘一般是在連續(xù)晴朗的晴天早上9：00前后入園采摘，選擇無(wú)病蟲害、長(zhǎng)勢(shì)健壯的植株，采其頂尖嫩芽部位。消毒時(shí)先剪掉較大的葉片，然后在接種臺(tái)上用1%的升汞消毒6～8分鐘，用高溫消毒的無(wú)菌水清洗后放在無(wú)菌瓶中。

2.4? ?調(diào)控適宜的溫濕度? ?根據(jù)季節(jié)的變化，對(duì)生產(chǎn)車間環(huán)境的濕度溫度進(jìn)行調(diào)控，在高溫多雨的季節(jié)，及時(shí)降溫除濕，維持適合培養(yǎng)基存放、瓶苗生長(zhǎng)的環(huán)境條件。確保培養(yǎng)基不被污染，才能有效降低瓶苗污染率。

2.5? ?常規(guī)清潔到位? ?日常定時(shí)使用臭氧機(jī)、紫外燈對(duì)接種室、培養(yǎng)室等進(jìn)行消殺處理，一般建議紫外燈采用時(shí)控器定時(shí)，早中晚各開燈滅菌半小時(shí)，接種臺(tái)紫外燈可在下班后打開半小時(shí)。臭氧機(jī)則可以設(shè)置為晚上進(jìn)行工作，避免影響工作人員。另外，生產(chǎn)車間要做好日常衛(wèi)生，及時(shí)揀出污染瓶苗，在指定地方處理污染，并將污染瓶先用消毒液浸泡，再常規(guī)清洗，可用84消毒液或新潔爾滅，有條件的可以在倒掉污染瓶苗前先高溫高壓消毒。及時(shí)處理廢棄瓶苗、垃圾，日常用新潔爾滅對(duì)環(huán)境進(jìn)行常規(guī)消殺。

2.6? ?定期消殺預(yù)防? ?對(duì)容易滋生污染的環(huán)境針對(duì)性防治。定期對(duì)生產(chǎn)車間消毒，傳統(tǒng)的消毒方法有甲醛熏蒸，該方法滅菌效果最好，但因甲醛對(duì)人體危害較大，且熏蒸時(shí)所用甲醛純度較高，所以熏蒸后一定要徹底通風(fēng)。也可選用其他消毒溶液，選擇適宜于自家車間的，科學(xué)配比，既減少對(duì)員工的健康威脅，又確保車間環(huán)境消殺到位。定期保養(yǎng)、清理接種臺(tái)過(guò)濾網(wǎng)，避免使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者保養(yǎng)不到位，濾網(wǎng)壞掉或者積灰嚴(yán)重，影響過(guò)濾效果，產(chǎn)生污染。

3? ?小結(jié)

總體來(lái)說(shuō)，導(dǎo)致植物組織培養(yǎng)污染的原因，可概括為兩個(gè)方面，一是生產(chǎn)環(huán)節(jié)操作不當(dāng)，包括但不限于制劑、接種、洗滌等;二是培養(yǎng)環(huán)境消殺不到位，包括日常各個(gè)車間的常規(guī)、定期消殺等。污染的防治則是以日常預(yù)防為主，防治結(jié)合，根據(jù)污染產(chǎn)生的原因，采取針對(duì)性措施，對(duì)癥下藥，確保污染及時(shí)被控制。