兩種廠家堿性磷酸酶性能評(píng)估

王玉堂，逯陣毫，馬明，閆淼，陳永奇，渠海

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

近年來(lái)，化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA）發(fā)展如火如荼，該分析方法是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)最新免疫測(cè)定技術(shù)。在化學(xué)發(fā)光免疫分析平臺(tái)中，有辣根過(guò)氧化物酶-魯米諾體系、堿性磷酸酶-3-（2'-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4-（3"-磷酰氧基）苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷體系［1-2］、吖啶酯-H2O2體系等，其中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）是一種水解酶，在堿性環(huán)境中能水解很多磷酸單酯化合物。該酶的用途廣泛，它可以作為某些疾病的標(biāo)志物，也經(jīng)常用于在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）中標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)而幫助檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體的含量［1］。然而堿性磷酸酶來(lái)源于多種渠道，比如大腸桿菌、小牛腸等，而不同廠家的提取工藝又千差萬(wàn)別，這就導(dǎo)致市場(chǎng)上堿性磷酸酶的活性魚(yú)龍混雜，能應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域的堿性磷酸酶需要仔細(xì)甄別和評(píng)價(jià)。為此，我們通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法評(píng)估了商業(yè)化的不同廠家的AP，甄選出廠家S 的堿性磷酸酶能夠較好地應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

堿性磷酸酶A01B03-X（廠家C）、堿性磷酸酶A01B03-X1（廠家C）、堿性磷酸酶S1（廠家S）、4-（N-馬來(lái)酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯（SMCC，sigma）、2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷鹽酸鹽（aladdin 生產(chǎn)）、磁微粒促甲狀腺激素混懸液（廠家A）、磁微粒促甲狀腺激素酶稀釋液（廠家A）、全自動(dòng)免疫檢驗(yàn)系統(tǒng)用底物液（廠家M），磁微粒促甲狀腺激素校準(zhǔn)品（廠家A），內(nèi)分泌質(zhì)控（廠家A），促甲狀腺激素（TSH）抗體（廠家A）；磁微粒促甲狀腺激素檢測(cè)試劑盒（廠家M）。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（CL-2000i，廠家M）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（型號(hào)A2000PLUS，廠家A）。

1.2 方法

堿性磷酸酶-抗體標(biāo)記物的制備：目前常用的用于蛋白質(zhì)交聯(lián)的交聯(lián)劑種類(lèi)繁多，比如同端雙功能交聯(lián)劑有：戊二醛、雙琥珀酰亞胺辛二酸酯鈉鹽、雙琥珀酰亞胺戊二酸酯、3,3'-二硫代二丙酸二（N-羥基丁二酰亞胺酯）、二（N-琥珀酰亞胺）乙烯乙二醇二琥珀酸酯；異端雙功能交聯(lián)劑有：3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯、6-（馬來(lái)酰亞胺基）己酸琥珀酰亞胺酯、4-（N-馬來(lái)酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯等。但被成熟應(yīng)用的主要有戊二醛、馬來(lái)酰亞胺-琥珀酰亞胺系列交聯(lián)劑。這兩種交聯(lián)劑都屬于雙功能交聯(lián)劑，在交聯(lián)過(guò)程中可避免破壞蛋白質(zhì)的自身結(jié)構(gòu)，不影響其生物活性。本實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)對(duì)琥珀酰亞胺基-［4-（N-馬來(lái)酰亞胺甲基）］-環(huán)己烷-1-甲酸-（6-氨基己酸酯）（LC-SMCC）的交聯(lián)方法［3］做了探索，并優(yōu)化出了一套較為成熟的AP 標(biāo)記工藝，其過(guò)程如下（以下稱(chēng)為L(zhǎng)C-SMCC 法）：①AP的馬來(lái)酰胺化。取1.9 mg，溶于190 μL DMSO 中；用PBS 溶解AP，并調(diào)整濃度至5 mg/mL；將5 μL LC-SMCC 溶液和10 μL AP 溶液相混合，在25℃下孵育2 h；再將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，在pH 7.0 的PBS 透析6 h，期間更換一次透析液；取出透析物，備用。②促甲狀腺素抗體的巰基化。將單抗用pH 7.0 的PB 調(diào)整至2.5 mg/mL；將2 μL 的ITL水溶液（10 mg/mL）加入到100 μL 的促甲狀腺激素單抗PBS 溶液中（2.5 mg/mL），混勻后調(diào)節(jié)pH 8.0，在室溫25℃下振蕩反應(yīng)2 h；再將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，在pH7.0 的PBS 透析6 h，期間更換一次透析液；取出透析物，備用。③標(biāo)記和純化。將馬來(lái)酰胺化的AP 和巰基化的單抗混合，在室溫25℃振蕩反應(yīng)2 h；取出加入等體積甘油，存放2～8℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 幾種堿性磷酸酶標(biāo)記物性能評(píng)價(jià)

將3 種堿性磷酸酶標(biāo)記的TSH 抗體搭配磁珠試劑制備成3 套工作試劑，分別在廠家A 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定上按樣本100 μL、磁珠試劑20 μL、酶試劑50 μL 的加樣量，以一步法測(cè)試磁微粒TSH項(xiàng)目。

1.3.1 校準(zhǔn)品梯度以及信號(hào)值評(píng)價(jià) 將廠家A 磁微粒TSH 試劑的校準(zhǔn)品分別用上述3 套工作試劑進(jìn)行檢測(cè)，可得到三種堿性磷酸酶用同一種工藝進(jìn)行抗體標(biāo)記后的校準(zhǔn)品梯度和信號(hào)值，其中抗體-堿性磷酸酶偶聯(lián)物用廠家A 酶稀釋液稀釋2 000 倍。

1.3.2 靈敏度考核 連續(xù)測(cè)定20 次濃度值為0 的校準(zhǔn)品S0，計(jì)算發(fā)光值的平均值（average,AV）和標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation,SD），在校準(zhǔn)曲線(xiàn)上回算出信號(hào)值M+2SD 的濃度值，即為最低檢測(cè)限。最低檢測(cè)限是一個(gè)試劑盒靈敏度最關(guān)鍵的指標(biāo)。

1.3.3 精密性考核 將廠家A 內(nèi)分泌質(zhì)控成品（其中包含高值約1 000 mIU/mL、中值約100 mIU/mL、低值約10 mIU/mL），用自制的磁微粒TSH 堿性磷酸酶檢測(cè)試劑進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試方案為：第一天分別高中低值質(zhì)控品各5 孔，第二天、第三天、第四天、第五天分別測(cè)試高中低值質(zhì)控品各兩孔，計(jì)算第一天各個(gè)濃度值5 個(gè)信號(hào)值的變異系數(shù)（coefficient of variation,CV），即得到試劑盒的分析內(nèi)精密性，然后計(jì)算每個(gè)濃度值13 個(gè)信號(hào)值的變異系數(shù)，即為試劑盒的分析間精密性。

1.3.4 不同試劑盒臨床對(duì)比 ①取10 份臨床樣本按照標(biāo)準(zhǔn)處理，無(wú)溶血或脂血現(xiàn)象，在-20℃保存不超過(guò)三周；②經(jīng)廠家M 公司促甲狀腺激素檢測(cè)試劑盒（堿性磷酸酶促發(fā)光法）測(cè)定；③在0～30 mIU/mL 范圍內(nèi)均勻分布。

2 結(jié)果

2.1 不同堿性磷酸酶所建試劑盒的信號(hào)值以及校準(zhǔn)品梯度

將不同堿性磷酸酶標(biāo)記TSH 抗體，制成三個(gè)磁微粒TSH 檢測(cè)試劑盒，并進(jìn)行校準(zhǔn)品信號(hào)值以及梯度對(duì)比，見(jiàn)表1。

表1 不同AP 標(biāo)記抗體后試劑盒發(fā)光值對(duì)比

從表1 中可知：廠家S 堿性磷酸酶制備的試劑盒不僅本底較低，靈敏度較高，且信號(hào)值最高達(dá)到五百萬(wàn)；而廠家C 堿性磷酸酶試劑盒本底均較高，且靈敏度較低，信號(hào)值均不超過(guò)三百萬(wàn)，顯然，這兩個(gè)試劑盒是不足以應(yīng)用的。接下來(lái)，只評(píng)價(jià)廠家S 堿性磷酸酶試劑盒。

2.2 靈敏度考核

分別由廠家S 的堿性磷酸酶S1 和廠家C 的堿性磷酸酶A01B03-X、A01B03-X1 標(biāo)記TSH 抗體而得的酶試劑測(cè)定所得的最低檢測(cè)限為0.01 mIU/mL、0.16 mIU/mL、0.06 mIU/mL。因此本指標(biāo)中廠家S 的堿性磷酸酶S1 最優(yōu)，而與廠家C的A01B03-X1 次之，廠家C 的堿性磷酸酶A01B03-X 最差。

2.3 精密性考核

通過(guò)以上兩個(gè)性能指標(biāo)的考核，確定廠家S的堿性磷酸酶S1 標(biāo)記TSH 抗體得到的酶試劑最優(yōu)，故精密性只進(jìn)行該酶試劑的考核。進(jìn)行精密性考核后得到該磁微粒TSH 檢測(cè)試劑盒的高中低質(zhì)控分析內(nèi)精密性分別為2.64%、1.75%、1.68%，分析間精密性分別為2.70%、1.96%、1.32%。該試劑盒的精密性性能滿(mǎn)足體外診斷試劑的國(guó)家要求。見(jiàn)表2。

表2 廠家S 堿性磷酸酶試劑的精密性考核（%）

2.4 臨床相關(guān)性

征集10 例按照樣本處理要求處理的血清樣本，分別用廠家A 磁微粒TSH 檢測(cè)試劑、廠家M磁微粒TSH 檢測(cè)試劑、由廠家S 堿性磷酸酶S1 標(biāo)記TSH 抗體制成的磁微粒TSH 檢測(cè)試劑測(cè)定，計(jì)算結(jié)果后比較彼此之間臨床相關(guān)性，見(jiàn)圖1～3、圖1 以廠家A 磁微粒TSH 試劑測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)，廠家M 磁微粒TSH 試劑測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)；圖2 以廠家A 磁微粒TSH 試劑測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)，自制堿性磷酸酶磁微粒TSH 試劑測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)；圖3 以自制堿性磷酸酶磁微粒TSH 試劑檢測(cè)結(jié)果為橫坐標(biāo)，廠家M 磁微粒TSH 試劑檢測(cè)結(jié)果為總坐標(biāo)，分別作兩組結(jié)果的相關(guān)性方程，并計(jì)算相關(guān)性系數(shù)R2。

圖1 廠家A 磁微粒TSH 試劑與廠家M 磁微粒TSH 試劑臨床相關(guān)性

圖2 廠家A 磁微粒TSH 試劑與廠家S 堿性磷酸酶自制磁微粒TSH 試劑臨床相關(guān)性

圖3 廠家M 磁微粒TSH 試劑與廠家S 堿性磷酸酶自制磁微粒TSH 試劑臨床相關(guān)性

通過(guò)對(duì)比三個(gè)試劑盒的臨床相關(guān)性可以得知，自制磁微粒TSH 檢測(cè)試劑與另外兩個(gè)市售的磁微粒TSH 檢測(cè)試劑盒在臨床相關(guān)系數(shù)R2上均能達(dá)到0.9 以上，初步說(shuō)明自制磁微粒TSH 檢測(cè)試是可以在臨床上應(yīng)用的。

3 討論

綜合以上評(píng)價(jià)結(jié)果，可以初步看出廠家S 的堿性磷酸酶活性較高，其來(lái)源于小牛腸膜［4］，較適合用于化學(xué)發(fā)光診斷試劑，廠家C 的兩批次堿性磷酸酶活性較低，信號(hào)值不能滿(mǎn)足化學(xué)發(fā)光試劑的臨床需求。而用廠家S 的堿性磷酸酶標(biāo)記TSH 活材制得的磁微粒TSH 檢測(cè)試劑在各個(gè)方面的性能均表現(xiàn)較好并得到驗(yàn)證，該堿性磷酸酶可用于臨床用化學(xué)發(fā)光診斷試劑的開(kāi)發(fā)。

堿性磷酸酶已被廣泛用于化學(xué)發(fā)光診斷試劑，其是一種水解酶［5］，它的酶學(xué)性質(zhì)已經(jīng)被廣泛的研究，特別是對(duì)于從不同的來(lái)源中提取的堿性磷酸酶，在Km、Vmax、最適pH 和最適反應(yīng)溫度等基本性質(zhì)方面進(jìn)行了不同程度的深入研究。不同來(lái)源的堿性磷酸酶，其蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，活性等有很大不同，目前初步推測(cè)以上三種堿性磷酸酶之所以表現(xiàn)出較大的差別，是不同結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的，還需進(jìn)一步更加詳細(xì)的研究。