向日葵AGO和DCL基因家族的鑒定和表達分析

張紅, 員世宇, 王文浩, 劉文俊, 何麗芬, 閆玉星, 王彥尊, 王鵬冬, 鄭洪元, 張鑫,2

向日葵和基因家族的鑒定和表達分析

張紅1, 員世宇1, 王文浩1, 劉文俊1, 何麗芬1, 閆玉星1, 王彥尊1, 王鵬冬1, 鄭洪元1*, 張鑫1,2*

(1. 山西農業(yè)大學經濟作物研究所，太原 030031；2. 省部共建有機旱作農業(yè)國家重點實驗室(籌)，太原 030031)

為了解向日葵()的Argonaute (AGO)和Dicer-like (DCL)的功能，利用擬南芥()的和基因序列在向日葵基因組數據庫中進行同源比對，對向日葵AGO和DCL家族成員進行生物信息學分析。結果表明，從向日葵中鑒定到15個和5個家族成員；這2類基因在染色體上的分布均不均勻。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，與擬南芥相似，家族成員可分為3個分支，可分為4個分支；所有的都具有保守的N domain、DUF1785、PAZ和PIWI結構域，家族成員都含有PAZ和RIBOc結構域。表達分析表明，和在莖和花序中高度表達；亞細胞定位表明HaAGO多定位于細胞核。這表明向日葵中可能存在典型的RNAi干擾機制，并可能參與了協(xié)調向日葵的生長發(fā)育過程。

RNA干擾；AGO家族；DCL家族；向日葵；基因表達

RNAi (RNA interference)即RNA干擾，是在生物體內普遍存在的一種古老的生物學現象，是一種高度保守的基因表達調節(jié)機制。典型的RNAi是指在Dicer-like (DCL)和Argonaute (AGO)作用下，利用雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)誘導形成的小RNA (small RNA, sRNA)，對目標序列的mRNA進行降解從而特異性地阻斷或抑制相應基因表達的過程[1]。DCL和AGO分別參與了RNAi過程中的啟動階段和效應階段。具有RNaseIII型活性DCL蛋白可將dsRNA加工成為包括siRNAs (small interfering RNAs)、miRNAs (microRNAs)和piRNAs (piwiRNA)等，長度約為20～30個核苷酸的sRNA (small RNA, sRNA)[2–3],進而啟動RNAi。AGO蛋白則分別與miRNAs、siRNAs和piRNAs等不同類型的小非編碼RNA (small non-coding RNA)結合，在這些小RNA的引導下，AGO蛋白特異地停留在與小RNA互補的靶基因mRNA上，通過AGO蛋白自身的內切酶活性對目標基因mRNA進行切割或翻譯抑制等以引起靶基因的沉默[4–5]。

DCL是植物中一種高度保守的核糖核酸酶,屬于RNase Ⅲ家族，是RNAi途徑中至關重要的組分[6]。DCL蛋白是加工dsRNA前體生成小分子RNA的關鍵酶，可通過剪切dsRNA產生sRNA，啟動RNAi途徑。AGO是一個進化上高度保守、成員數量較多的家族[7]。該基因最初由Bohmert等[8]在擬南芥中發(fā)現，并在生物界中廣泛存在。在動、植物中，AGO與小RNA共同參與維持基因組的穩(wěn)定性。兩者介導的RNAi沉默機制在調控植物個體的生長發(fā)育水平及生物和非生物脅迫的反應等重要的生理活動中發(fā)揮了關鍵作用[9–10]。目前對RNAi途徑及其關鍵成分的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物上，在其他作物中的研究還較少。

向日葵()是重要的油料作物之一，在鹽堿和貧瘠地區(qū)廣泛種植，具有抗旱和耐鹽堿特性，是優(yōu)異的抗逆基因資源[11]。向日葵生長發(fā)育過程中會受到許多逆境影響，培育和科學利用抗逆品種是提高向日葵產量最經濟有效的方式。RNAi機制在植物中普遍存在，解析RNAi通路關鍵基因，從RNAi分子機制的角度分析向日葵基因，對提高向日葵的抗逆性、抗病性、產量及品質等有重要意義。本研究利用生物信息學方法，結合向日葵基因組測序數據，鑒定了向日葵和基因家族，分析了AGO和DCL的理化性質、系統(tǒng)進化樹、蛋白保守結構域、三級結構和亞細胞定位，以及基因的染色體定位和組織特異性表達等，進而對和基因功能進行預測，以期為深入研究向日葵RNAi沉默機制提供依據，為向日葵抗逆分子育種奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 基因的搜索與確認

在擬南芥數據庫TAIR (http://www.arabidopsis. org)以關鍵詞“AGO”和“DCL”搜索全部和家族，得到10個和4個基因的核酸序列及其對應的氨基酸序列。

參考和家族的序列信息，以向日葵()自交系XRQ為研究對象, 在Phytozome13向日葵基因組r1.2數據庫(https://phyto zome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中用擬南芥同源序列比對得到向日葵和基因家族所有候選成員的氨基酸序列，先刪除掉氨基酸數量過少的序列，再將剩余蛋白的氨基酸序列提交到蛋白質結構域預測網站PFAM (http://pfam.sanger.ac.uk/)及SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)，根據基因家族典型結構域PAZ與PIWI，基因家族結構域PAZ和RIBOc，篩除不具有上述結構域的基因,得到向日葵相應基因家族的所有成員和，進而得到相應的CDS序列、氨基酸序列、基因登錄號和染色體定位信息。

1.2 生物信息學分析

使用在線軟件ExPASy (http://www.expasy.org./ tools/protparam.html)分析和基因家族成員的理化特性。使用在線軟件NCBI (https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)獲得基因外顯子數量。使用GSDS 2.0 [Gene Structure Display Server 2.0 (gao-lab.org)]獲得基因內含子數量。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹建立

使用Phylogeny (http://phylogeny.lirmm.fr/)軟件構建向日葵和擬南芥的AGO和DCL蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。MUSCLE參數設置為Run mode:full processing mode；Gblocks參數設置為Min. seq. for flank pos.: 85%、Max. contig. nonconserved pos.:8、Min. block length:10、Gaps in final blocks:no；Phy ML參數設置為Model: Default、Statistical test: alrt、Number of categories: 4、Gamma: estimated、Invariable sites: estimated; Tree Dyn參數設置為Conformation: rec- tangular、Branch annotation: bootstra。

1.4 多序列比對

用Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/clustalo/)和Mview (https://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/mview/)多重比對工具進行保守殘基可視化和結構域的顯示。參數設置為Output Format: Mview、Html Markup: Head、Alignment Width: 120、Con- sensus: OFF、Congaps: On。

1.5 蛋白質和基因結構域的搜索及繪制

用SMART和PFAM進行結構域搜索，為保證氨基酸序列的準確性，去除在SMART中結構域殘缺的氨基酸序列，確定所需每個結構域的具體位置, 并使用IBS 1.0 (Illustrator for Biological Sequences)進行可視化繪圖。SMART具體參數設置為Outlier homologues and homologues of known structure、PFAM domains、signal peptides、internal repeats。

1.6 三維結構預測

用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy. org/)對HaAGO蛋白進行三維結構同源性建模。首先通過SWISS-MODEL模板庫進行BLAST和HHBlits模板搜索，其次根據檢索結果篩選QMEAN (-4～0)和GMQE (0～1)最大值的模板，并在SAVES v 6.0 (http:// saves.mbi.ucla.edu)中進行鑒定，最后通過PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System)軟件對預測的三維結構模型進行可視化。

1.7 植物亞細胞定位預測

利用PSI (http://bis.zju.edu.cn/psi/)在線工具對HaAGOs和HaDCLs蛋白進行亞細胞定位，設置- values<0.01。

1.8 組織特異性表達分析

將和基因的ID號輸入eFP- Browser數據庫(http://bar.utoronto.ca/)中查詢，分析其相對表達模式，參數設置為：Use Local Max。

2 結果和分析

2.1 向日葵AGO和DCL基因的篩選及其編碼蛋白的理化性質分析

利用擬南芥中的10個和4個基因進行同源比對分析，最終確定向日葵中有15個和5個基因家族成員(表1)。HaAGOs蛋白由869～1 387氨基酸組成，最多的是HaAGO1b, 最少的是HaAGO4b；等電點為8.98～ 9.57，均為堿性；分子量為97.77～155.88 kDa;的外顯子和內含子數量均比較少，只有2～4個，而其他s成員的外顯子數量均較多。HaAGOs蛋白的親水性值均為負值，表明均為親水蛋白，最小值是-0.924, 為HaAGO1b, 親水性最強; 除HaAGO1b外, HaAGOs蛋白的脂溶性指數都較大，平均73.00～83.97。HaDCLs有1 272～1 710氨基酸組成，最多的為HaDCL1, 最少為HaDCL3a；等電點為6.10～6.46，均為酸性; 分子量為142.26～191.99 kDa，脂溶性指數最大的是HaDCL2，親水性值最大的也是HaDCL2，且HaDCLs親水性值均為負值，預測均為親水蛋白。

本研究分析了和基因的染色體定位，結果表明，在14號染色體上有5個基因，分別是和；在16號染色體上有3個，分別是和；其他染色體上分布的較少，大多為1～2個。2、4、7、8、9、15號染色體上無和基因分布，表明向日葵和基因在染色體上分布不均勻。

2.2 HaAGOs和HaDCLs的系統(tǒng)進化分析

基于擬南芥和向日葵和基因編碼蛋白的氨基酸序列，采用最大似然法構建系統(tǒng)進化樹。從圖1: A可見，25個AGO家族成員可分為3類，第I類分支中有6個成員，其中3個HaAGOs家族成員，分別是HaAGO2a、HaAGO2b和HaAGO7, 編碼該類成員的基因外顯子數目較少(表1); 第II類分支有9個成員，其中6個HaAGOs家族成員，分別是HaAGO1a、HaAGO1b、HaAGO1c、HaAGO5a、HaAGO5b和HaAGO10; 第III類分支有10個成員，其中6個HaAGOs家族成員，分別是HaAGO4a、HaAGO4b、HaAGO8a、HaAGO8b、HaAGO8c和HaAGO8d。相比第I類分支，編碼第II和第III類成員的基因外顯子數目明顯較多(表1)。

表1 向日葵AGO和DCL基因家族成員信息

圖1 向日葵和擬南芥AGO (A)和DCL (B)家族蛋白的系統(tǒng)進化樹。分支上的數字為1 000次復制的支持值。

從圖1: B可見，5個HaDCL蛋白可分為4個分支, AtDCL1與HaDCL1、AtDCL2與HaDCL2、AtDCL3與HaDCL3a和HaDCL3b、AtDCL4與HaDCL4分別聚在同一分支中。

2.3 HaAGOs和HaDCLs蛋白的保守結構域預測

本研究使用SMART進行了蛋白結構域搜索,結果表明，15個HaAGOs蛋白都包含PAZ和PIWI結構域(圖2: A)。位于進化樹第I分支的HaAGO2a、HaAGO2b、HaAGO7和第III分支的HaAGO8a、HaAGO8B沒有預測到MID結構域。位于進化樹第II分支的HaAGO1a、HaAGO1b、HaAGO1c、HaAGO5a、HaAGO10和第III分支的HaAGO4a、HaAGO4b、HaAGO8c、HaAGO8d均有保守結構域N domain、DUF1785、PAZ、L2、MID和PIWI。在HaAGO1a中有1個富含甘氨酸(A Gly-Rich)的特異性結構域。

與擬南芥的DCL相似，HaDCLs家族也包含DEXDc、HELICc、Dicer_dimer、PAZ、RIBOc和DSRM等保守結構域(圖2: B)。位于進化樹第I分支的HaDCL3b沒有預測到DEXDc結構域, HaDCL3a和HaDCL3b沒有預測到HELICc、Dicer_dimer和DSRM結構域。位于進化樹第II分支的HaDCL1和第IV分支的HaDCL4沒有預測到上述結構域。位于第III分支的HaDCL2沒有預測到DSRM結構域。而HaDCL1和HaDCL4在N末端有1個額外的DSRM結構域。

圖2 HaAGOs (A)和HaDCLs (B)蛋白的保守結構域

2.4 HaAGOs蛋白PIWI結構域的多重序列比對

15個HaAGOs中有8個(第I分支的HaAGO2a、HaAGO2b、HaAGO7和第II分支的HaAGO1a、HaAGO1c、HaAGO5a、HaAGO5b、HaAGO10)具有保守的H798位點，而位于第II分支的HaAGO1b的H798位點則被P (脯氨酸)替換。位于第III分支的HaAGO4a和HaAGO4b的H798位點也被P替換，HaAGO8a和HaAGO8b的H798位點被S (絲氨酸)替換，HaAGO8c和HaAGO8d的H798位點被A (丙氨酸)替換，預示這些被替換的蛋白酶活性功能可能喪失。除了第I分支的HaAGO2a和HaAGO2b有DEDD基序外，其余HaAGOs蛋白均為DEDH基序(圖3)。

2.5 HaAGOs的三級結構預測

結合系統(tǒng)發(fā)育關系和蛋白質結構域可以看出,向日葵和擬南芥的AGO蛋白三維模型總體上都是帶有底部凹槽的新月形結構，但各自又有所不同(圖4)。第I分支的HaAGO2a、HaAGO2b和HaAGO7 和第II分支都沒有預測到MID結構域(紅色區(qū)域)，而第III分支僅部分成員有MID結構域。

圖3 向日葵AGO蛋白PIWI結構域的多重序列比對。紅色框: DEDD/H和QF-F基序。

圖4 HaAGOs蛋白的三級結構。黃色: PAZ; 藍色: PIWI; 紅色: MID; 紫紅色: DEDD/H。

2.6 HaAGOs和HaDCLs的表達模式和亞細胞定位

利用eFP-Brower對和在花序、莖、葉和種子4種組織中的特異性表達進行了分析，結果表明(表2)，和在不同組織中的表達差異明顯。其中和在花序中高表達，和分別在種子和葉中高表達。值得注意的是,和在4個組織中均不表達。5個基因在各組織中均有不同程度的表達,和在莖和花序中高表達。

亞細胞定位分析結果表明(表3)，HaAGO1b、HaAGO2a和HaAGO8c定位于細胞核，HaAGO1c和HaAGO2b定位于細胞核和細胞質，HaAGO7定位于細胞核和線粒體，HaAGO1a、HaAGO4a、HaAGO4b和HaAGO10定位于線粒體，HaAGO8a定位于高爾基體和質體。

表2 向日葵AGO和DCL家族的組織特異性表達

3 結論和討論

RNAi是真核生物調節(jié)基因表達的一種保守機制, 在植物生長發(fā)育、表觀遺傳修飾、對非生物和生物脅迫的反應和防御等多個過程中發(fā)揮著重要作用[12–14]。由AGO和DCL介導的RNAi是一個重要的生理調控過程，二者協(xié)同作用，參與了不同種類小RNA的產生、靶基因的沉默和生物途徑的調節(jié)。在擬南芥中，和分別在抗病毒防御和表觀遺傳途徑中發(fā)揮重要作用，并且這兩個基因編碼的氨基酸序列表現出高度的同源性[15], AtAGOs蛋白還包括介導mRNA裂解的AtAGO1、指導DNA甲基化的AtAGO4、調控植株發(fā)育的AtAGO7等[16]。擬南芥AtDCL1主要參與miRNA的生物生成[17]，AtDCL2主要負責切割dsRNA從而產生22nt siRNA，對病毒起抵抗作用[18]，AtDCL3參與RNA指導的DNA甲基化和染色體修飾過程, AtDCL4與ta-siRNA的產生有關，并在轉錄后水平的基因沉默發(fā)揮作用[19]。但是在向日葵中RNAi途徑的關鍵基因尚未見報道。

本研究共挖掘出向日葵15個和5個家族成員，分析并注釋了這些成員的氨基酸數量、分子量及基因登錄號等，并通過對20個蛋白的理化性質分析以及染色體定位預測，以確定不同基因間的進化關系。與擬南芥類似，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明基因包含3個分支, 并且基因的內、外顯子數量、大小在不同分支內保持較高的一致性, 這些與擬南芥中基因家族的結構和特征一致，說明他們的基因起源甚至功能有一定的關聯(lián)性。每個分支都有來自向日葵和擬南芥的基因，推斷向日葵的祖先種類含有至少3個基因，也說明向日葵在進化上相對保守。有趣的是，向日葵家族成員數量高于擬南芥，第Ⅲ分支且位于14號染色體上的，以及第I分支且位于16號染色體的出現在同一基因區(qū)間，且不超過1個干預基因，推測基因的串聯(lián)復制導致了向日葵基因的多樣性。

AGO和DCL蛋白成員結構域存在差異, HaAGO家族包含7種結構域，15個HaAGOs都有PAZ和PIWI結構域，有研究表明PAZ有助于siRNA 3′末端的結合，而PIWI則將siRNA 5′末端與靶RNA結合[20]，暗示所有的HaAGO具有與小RNA結合的功能。在HaAGO1a中有1個富含甘氨酸(Gly-rich)的特異性結構域，這與擬南芥和咖啡等植物中AGO1富含甘氨酸(Gly-rich)的結構域類似，具體功能未知，有待進一步研究。PIWI會形成一種類似于RNase H酶的折疊結構，具有內源核酸酶的活性[21]，可將siRNA的5′末端與靶RNA結合，是核心AGO蛋白家族最主要的功能域。H798 (組氨酸)位點、QF-V (谷氨酰胺-苯丙氨酸-纈氨酸)和DEDD/H基序則是PIWI功能域的核心元件，有研究表明H798是AtAGO1蛋白行使體外內切酶活性的重要位點[22],QF-V是sRNA雙重識別和分類中所必需的高度保守的基序[23]，DEDD/H是PIWI行使切割功能不可或缺的保守基序[24]。本研究中的PIWI大部分都包含了上述主要的功能元件，也有部分殘基被取代, 說明了向日葵AGO在功能上與擬南芥存在一定的差異。三維建模是解析蛋白功能的有效方式，用SWISS-MODEL對向日葵AGO蛋白的氨基酸序列進行蛋白質三維結構同源性建模[25]。SWISS-MODEL是迄今為止AGO蛋白的首選建模工具[26]，并通過PyMOL分子進行可視化顯示。HaAGO家族三級結構模型更明顯的顯示向日葵與擬南芥AGO結構相似但有細微差別。HaDCLs家族成員都含有PAZ、RIBOc結構域，氨基酸數量較多的HaDCL1和HaDCL4包含有DEXDc、HELICc、Dicer_dimer、PAZ、RIBOc和DSRM等6種結構域；而HaDCL3a和HaDCL3b沒有預測到Dicer_dimer結構域, 有研究表明AtDCL3也沒有預測到Dicer_dimer結構域，而擬南芥中Dicer---_dimer結構域參與介導AtDCL4的異源二聚作用[27]，因此沒有預測到Dicer_dimer可能會導致HaDCL3a和HaDCL3b相應功能的喪失。綜上所述，與擬南芥相比，向日葵在進化的過程中既有保守性又有自身的特點。

和組織特異性表達分析表明,在花序和種子中表達量最高，而在擬南芥的花和種子的各發(fā)育階段，也有較高的表達[28]，這可能是由于積極參與植物分生組織活動的結果。和基因在花序和莖中的表達量比其他組織高，推測其在花序和莖的生長發(fā)育中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。

本研究對向日葵的AGO和DCL家族進行了挖掘和鑒定，共發(fā)掘出15個和5個家族成員，并對其理化性質、染色體定位、系統(tǒng)進化樹、蛋白保守結構域、三級結構、亞細胞定位及組織特異性表達等進行了分析，結果表明向日葵中可能存在典型的RNAi干擾機制，向日葵和基因其功能在進化上是保守的，但有其自己的特殊性，并且在花序和莖的生長發(fā)育中發(fā)揮著關鍵作用，但具體的功能還需要更多試驗數據去佐證，以便全面解析向日葵RNAi途徑及其介導的沉默機制。這為揭示向日葵AGO和DCL蛋白功能、發(fā)掘向日葵的抗逆育種靶向基因資源提供了一定的理論依據。

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Identification and Expression Analysis ofandGene Families in Sunflower

ZHANG Hong1, YUAN Shiyu1, WANG Wenhao1, LIU Wenjun1, HE Lifen1, YAN Yuxing1, WANG Yanzun1, WANG Pengdong1, ZHENG Hongyuan1*, ZHANG Xin1,2*

(1. Institute of Industrial Crops, Shanxi Agricultural University,Taiyuan 030031, China; 2.State Key Laboratory of Sustainable Dryland Agriculture (in preparation), Taiyuan 030031, China)

Ribonucleic acid interference (RNAi) is a biological process in which small RNAs regulate gene silencing at the transcriptional or post-transcriptional level. The argonaute (AGO) and dicer-like (DCL) proteins are two of the key components in the RNAi machinery of eukaryotes. In order to understand the function of AGO and DCL in sunflower (), the sequence ofandinwere used for homology alignment in the sunflower database. The bioinformatics of AGO and DCL family members in sunflower were analysed. The results showed that there were 15and 5members obtained, which were unevenly distributed on chromosomes. Themembers could be cluster into 3 clades, containing conserved domains of N domain, DUF1785, PAZ and PIWI, whereas those ofcould be cluster into 4 clades, containing conserved domains of PAZ and RIBOc. The expressions ofandin the steam and peduncle were stronger than those in other tissues. The subcellular localization showed that HaAGO was mostly localized in the nucleus. Therefore, it was suggested that a typical RNAi mechanism might exist in sunflower, and involve in coordinating growth and development in sunflower.

RNAi; AGO; DCL;; Gene expression

10.11926/jtsb.4612

2022-01-17

2022-05-02

山西省重點研發(fā)計劃項目(201903D221088)；國家特色油料產業(yè)技術體系項目(CARS-14-2-05)；山西農業(yè)大學生物育種工程項目(YZGC047)；山西省現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金(2022-05)資助

This work was supported by the Project for Key Research and Development in Shanxi (Grant No. 201903D221088), the Project of National Characteristic Oil Industry Technology System (Grant No. CARS-14-2-05), the Project for Biological Breeding Engineering in Shanxi Agricultural University (Grant No. YZGC047), and the special Project for Modern Agricultural Industry Technology Research System in Shanxi (Grant No. 2022-05).

張紅(1984年生)，女，助理研究員，主要從事向日葵栽培與育種。E-mail: foogoohoo@126.com

. E-mail: 18935439365@163.com; 15177178@qq.com