短枝木麻黃家系對(duì)青枯病的抗性評(píng)價(jià)與選擇

魏龍, 魏永成, 孟景祥, 張勇, 周毅*

短枝木麻黃家系對(duì)青枯病的抗性評(píng)價(jià)與選擇

魏龍1, 魏永成2, 孟景祥2, 張勇2, 周毅1*

(1. 廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣州 510520；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520)

為探討短枝木麻黃()對(duì)青枯病()侵染后的生理生化響應(yīng)，利用其生理生化響應(yīng)指標(biāo)與抗病性特征的相關(guān)性開展短枝木麻黃家系的抗病評(píng)價(jià)和選擇。結(jié)果表明，26個(gè)短枝木麻黃家系褐梗小枝接種青枯病后，病情指數(shù)(DI)和相對(duì)病害強(qiáng)度(RDI)均存在極顯著差異(<0.01)。在接種青枯病后，家系間的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、總酚(TP)和類黃酮(Flav)差異均達(dá)顯著或極顯著水平，說明參試家系對(duì)青枯病抗性的變異豐富，具有較大的選擇潛力。短枝木麻黃家系的病情癥狀與6個(gè)生理生化指標(biāo)間均呈顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明青枯病侵染后防御酶活性或次生代謝物含量越高，木麻黃的病害程度越低。利用2個(gè)病情特征性狀和6個(gè)生理生化指標(biāo)對(duì)短枝木麻黃不同家系進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)和選擇，按照30%的入選率初步選出201、206、198、207、202、213、208和195號(hào)等8個(gè)抗病家系。這些抗病家系的RDI和DI比總體均值分別低25.94%和28.93%，SOD、CAT、PAL、PPO、TP和Flav比總體均值分別高11.90%、13.50%、24.77%、12.71%、25.68%和18.76%。篩選出的8個(gè)家系的病害程度低，萎蔫枝條少，植株生長(zhǎng)基本不受影響，表明抗病性較強(qiáng)，可以在后續(xù)生產(chǎn)中廣泛使用。

短枝木麻黃；家系；青枯病；生理生化性狀；抗病

木麻黃()是熱帶和亞熱帶沿海地區(qū)海岸防護(hù)林和農(nóng)田防護(hù)林建設(shè)的主要樹種，也是困難立地植被恢復(fù)的重要先鋒樹種，具有重要的生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益[1]。在我國(guó)華南沿海地區(qū)，木麻黃在防風(fēng)固沙和植被恢復(fù)等方面發(fā)揮著不可替代的作用，庇護(hù)著沿岸人民的生命和財(cái)產(chǎn)安全[2]。然而，木麻黃青枯病對(duì)我國(guó)海岸防護(hù)林的生態(tài)安全構(gòu)成了重大威脅，導(dǎo)致沿海木麻黃防護(hù)林出現(xiàn)許多“斷帶”和“林窗”，甚至大面積死亡。青枯病由土壤傳播的細(xì)菌性病原菌青枯雷氏菌()引起的，傳播快、死亡率高，是世界范圍內(nèi)最難防治的重大病害之一[3]。自木麻黃青枯病被發(fā)現(xiàn)以來，在青枯菌分離[4]、致病機(jī)理[5]和抗病機(jī)制[6]等方面做了一些相關(guān)研究，且大都以木麻黃無性系為研究材料。在家系層次選育能擴(kuò)大抗病性的遺傳基礎(chǔ)，僅有部分研究依據(jù)木麻黃的保存率和枯萎情況進(jìn)行家系初步選育[4]，而在抗病選育的基礎(chǔ)問題上如抗病遺傳變異規(guī)律的揭示、家系抗病育種機(jī)理等方面未見系統(tǒng)性研究報(bào)道。

選育抗病品種是解決木麻黃青枯病的主要途徑之一，而豐富的木麻黃基因資源能為選育抗病新品種提供廣闊的遺傳基礎(chǔ)。選擇合適的抗病性指標(biāo)是植物抗病選育能否成功的關(guān)鍵。受到病原菌侵襲后，植物的生理和生化性狀會(huì)立即產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng), 通過改變防御物質(zhì)合成量來抵御病原菌的入侵或繁殖，其中防御酶系統(tǒng)變化是病原菌作用于寄主植物后的明顯反應(yīng)之一[7]。因此研究植物體內(nèi)的防御酶變化規(guī)律是評(píng)價(jià)植物抗病性的重要因子。另外, 研究表明植物的次生代謝物質(zhì)與抗病性密切相關(guān), 在受到病原菌侵襲后次生代謝物會(huì)迅速合成以減輕病原菌造成的危害[8]。木麻黃感染青枯病后，總酚和類黃酮等次生代謝物質(zhì)能大量合成并直接發(fā)揮免疫作用，降低體內(nèi)的活性氧(ROS)濃度以保護(hù)植物細(xì)胞免受傷害[9]。因此，有必要深入探討次生代謝物質(zhì)及其合成關(guān)鍵酶在不同遺傳材料之間的差異特征，為抗性種質(zhì)材料的篩選提供理論支持。

本課題組在大量引種的基礎(chǔ)上已經(jīng)開展了木麻黃種源層次的研究，初步選出了一些抗病種源。本研究以短枝木麻黃26個(gè)家系為材料，以小枝中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化物酶活性，以及總酚、類黃酮含量為評(píng)價(jià)性狀，探討木麻黃響應(yīng)青枯病的家系遺傳變異規(guī)律，旨在篩選和挖掘優(yōu)良木麻黃抗青枯病家系，為木麻黃抗病育種材料的選育和推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于廣東省徐聞縣湛江國(guó)營(yíng)防護(hù)林場(chǎng),位于20°28′20″ N，110°31′41″ E，屬于熱帶海洋性季風(fēng)氣候。全年陽(yáng)光充足，年均溫23.3 ℃，年均降水量1 364 mm，全年無霜凍。土壤為濱海沙土，土壤肥力低。前茬為木麻黃無性系林，青枯病爆發(fā)后砍伐清理。

1.2 材料來源

短枝木麻黃()種源家系試驗(yàn)林營(yíng)建于2015年5月，試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，6次重復(fù)，5株小區(qū)。因一些重復(fù)中部分小區(qū)缺失，只利用了其中4個(gè)重復(fù)的家系材料進(jìn)行試驗(yàn)。參試家系分別來自于福建廈門(家系號(hào)219、220、221、222、223、224、226、227、228)、廣東電白(家系號(hào)192、194、195、198、201、202、203)和海南島東(家系號(hào)205、206、207、208、210、211、213、214、216、218)。

1.3 青枯病菌液的制備

參考許秀玉等[4]方法，野外收集并經(jīng)過致病力測(cè)試后，挑選致病力強(qiáng)的菌株在TTC培養(yǎng)基(2,2,3-三苯基四唑氯瓊脂培養(yǎng)基)上活化培養(yǎng)48 h后，挑選單菌落接種到CPG液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L, 水解酪蛋白1 g/L，葡萄糖5 g/L)中，30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)28～36 h。培養(yǎng)液于2 795×離心15 min，將青枯菌濾液稀釋成3×108cfu/mL(平板計(jì)數(shù)法)的懸浮液用于人工接種試驗(yàn)。

1.4 取樣和處理方法

于2020年6月對(duì)參試家系進(jìn)行取樣，每植株選擇2枝長(zhǎng)約40 cm的1 a生褐梗小枝，一枝插到青枯菌懸液中進(jìn)行接種培養(yǎng)[4]，另一枝插到清水中作為對(duì)照。每家系采集40枝(2×5×4)褐梗小枝，26個(gè)家系共采集1 040條。待褐梗小枝開始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象時(shí)，分別從處理和對(duì)照的綠色小枝(木麻黃的葉已退化為小齒狀，依靠綠色小枝進(jìn)行光合作用)上截取2 cm嫩枝，–80 ℃保存用于后續(xù)的生理生化響應(yīng)測(cè)定。待處理的褐梗小枝的萎蔫程度表現(xiàn)明顯差異時(shí)(約25 d，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)判斷，部分無性系小枝已枯萎死亡，部分無性系小枝可保持健康生長(zhǎng))，根據(jù)短枝木麻黃枝條的萎蔫數(shù)量，計(jì)算植株的相對(duì)病害強(qiáng)度，并做病情指數(shù)分析[10]。

1.5 性狀測(cè)定和數(shù)據(jù)處理

木麻黃褐梗小枝接種青枯病菌后的病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)為完全無萎蔫；1級(jí)為<20%幼苗出現(xiàn)萎蔫；2級(jí)為20%～40%幼苗出現(xiàn)萎蔫；3級(jí)為40%～60%幼苗出現(xiàn)萎蔫；4級(jí)為>60%幼苗出現(xiàn)萎蔫；5級(jí)為完全萎蔫或死亡。相對(duì)病害強(qiáng)度(RDI)=萎蔫分枝數(shù)/分枝總數(shù)；病情指數(shù)(DI)=∑(各級(jí)萎蔫株數(shù)×該萎蔫級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值)×100。

按陳建勛等[11]的方法提取和測(cè)定樣品的生理生化指標(biāo)，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD, U/g)、過氧化氫酶(catalase, CAT, U/g)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase, PAL, U/g)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO, U/g)的活性。按王翠穎等[12–13]的方法提取和測(cè)定總酚(total phenolics, TP, mg/100 g FW)和類黃酮(flavonoid, Flav, mg/100 g FW)的含量。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

利用SPSS和Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。方差分析模型：Y=B+F+BF+E, 式中,Y為方差分析模型，B為區(qū)組效應(yīng)，F為家系效應(yīng)，BF為區(qū)組與家系的交互效應(yīng)值，E為誤差項(xiàng)效應(yīng)。

2 結(jié)果和分析

2.1 家系間病情特征的差異

接種青枯菌后，各家系表現(xiàn)出不同的染病特征(圖1, 2)。部分家系(如206、218號(hào)等)有大量小枝枯萎變黃，甚至出現(xiàn)整株死亡現(xiàn)象，而部分家系(如207、208號(hào)等)植株無明顯變化，整體正常生長(zhǎng), 絕大多數(shù)小枝呈綠色，偶見小枝萎蔫但未變黃。26個(gè)短枝木麻黃家系小枝接種青枯病后, 病情指數(shù)和相對(duì)病害強(qiáng)度在家系間均存在極顯著差異(<0.01), 家系間平均病情指數(shù)為8.84～58.24，平均相對(duì)病害強(qiáng)度為0.2456～0.7787。

2.2 家系間生理生化性狀的差異

26個(gè)短枝木麻黃家系的SOD、CAT、PAL、PPO活性分別為327.84、16.93、179.89和19.83 U/g, TP和Flav含量分別為966.11和108.55 mg/100 g FW, 其變異系數(shù)分別為22.33%、33.73%、50.39%、33.48%、52.05%和42.96% (表1)。方差分析表明, PAL和PPO活性在家系間的差異達(dá)極顯著水平, SOD和CAT活性、TP和Flav含量在家系間的差異均達(dá)顯著水平, 說明參試家系受到青枯病菌侵染后的生理生化響應(yīng)強(qiáng)度呈顯著差異，具有較大的選擇潛力。

2.3 性狀的相關(guān)性分析

短枝木麻黃26個(gè)家系的生理生化性狀間的相關(guān)分析表明(表2)，SOD與CAT、TP、Flav間呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.604 7～0.671 6。CAT與PAL存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。PAL、PPO、TP、Flav性狀間呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.574 7～ 0.884 9。這表明木麻黃感染青枯病后，過氧化氫酶、合成防御物質(zhì)的關(guān)鍵酶和次生代謝物質(zhì)含量均相應(yīng)增加，協(xié)同響應(yīng)病原菌的侵襲。

圖1 家系的病情指數(shù)

圖2 家系的相對(duì)病害強(qiáng)度

表1 木麻黃生理生化性狀的方差分析

*:<0.05; **:<0.01

從表2可見，木麻黃家系褐梗小枝接種青枯病菌后，家系相對(duì)病害強(qiáng)度和病情指數(shù)與6個(gè)生理生化性狀均呈顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為–0.8107～–0.5590,其中相對(duì)病害強(qiáng)度和病情指數(shù)分別與TP和Flav呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這說明短枝木麻黃在青枯病原菌感染后或抵御其侵入過程中體內(nèi)產(chǎn)生的防御酶或次生代謝物質(zhì)越多，該家系的相對(duì)病害強(qiáng)度或病情指數(shù)越低，對(duì)青枯病的抗性越強(qiáng)。因此，對(duì)短枝木麻黃開展抗青枯病選育，可以將上述6個(gè)生理生化響應(yīng)參數(shù)作為抗病性選育的重要指標(biāo)，再結(jié)合其他性狀進(jìn)行聯(lián)合選擇，可取得較好的選擇效果。

2.4 抗病家系選擇

將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)并排序(表3)，若按照30%的入選率可選出8個(gè)抗青枯病家系(201、206、198、207、202、213、208和195號(hào))。這8個(gè)入選抗病家系相對(duì)病害強(qiáng)度和病情指數(shù)比總體均值分別低25.94%和28.93%；SOD、CAT、PAL、PPO、TP和Flav比總體均值分別高11.90%、13.50%、24.77%、12.71%、25.68%和18.76%。

表2 生理生化性狀間及其與病情特征相關(guān)性分析

*:<0.05; **:<0.01; SOD、CAT、PAL、PPO、TP、Flav見表1; RDI: 相對(duì)病害強(qiáng)度; DI: 病情指數(shù)。下同

*:<0.05; **:<0.01; SOD, CAT, PAL, PPO, TP, Flav see Table 1. RDI: Relative disease intensity; DI: Disease index. The same below

表3 優(yōu)良家系的篩選及性狀表現(xiàn)

3 結(jié)論和討論

短枝木麻黃不同家系接種青枯病菌后的生長(zhǎng)狀況呈現(xiàn)顯著差別，說明它們對(duì)青枯病的抗性差異較大，開展抗病選育具有較大的選擇潛力。在開展選育工作時(shí)，抗病性指標(biāo)的選擇是不可忽視的。本研究以病情特征、防御酶系統(tǒng)、次生代謝物質(zhì)及其合成關(guān)鍵酶為基礎(chǔ)，分析了不同家系在受到侵襲后的差異性特征，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了抗病家系篩選, 為木麻黃響應(yīng)青枯病的抗性機(jī)制提供了理論依據(jù)。

受到病原菌侵襲后，植物體內(nèi)ROS物質(zhì)快速積累，這些物質(zhì)的大量產(chǎn)生會(huì)造成植物過氧化傷害。研究表明木麻黃青枯病在干旱年份的病情發(fā)展較快，病情最嚴(yán)重的地方是干旱的沙丘地和保水力差的粗砂地[14]，在干旱脅迫下，木麻黃膜質(zhì)過氧化嚴(yán)重而造成不可逆的細(xì)胞損傷，同時(shí)青枯菌在植株體內(nèi)迅速增殖并由根侵入導(dǎo)管分子，形成侵填體堵塞導(dǎo)管[15]，使植株無法有效運(yùn)輸水分而枯萎死亡。SOD和CAT等防御酶能夠起到清除活性氧物質(zhì)的作用，可有效降低病原菌引起的細(xì)胞過氧化傷害。有研究表明桉樹可以通過大量表達(dá)SOD來提高抗病性，樟樹為了增強(qiáng)抗逆性會(huì)積累CAT[16]。本研究中，篩選出的優(yōu)良抗病家系的SOD和CAT活性顯著高于參試家系的均值，這表明抗病短枝木麻黃家系受到青枯菌侵襲后，能顯著提高SOD和CAT活性來清除積累的活性氧物質(zhì)，以減輕病原菌對(duì)植株的傷害，這與朱金方等[17]的研究結(jié)果一致。

PPO和PAL是植物次生代謝途徑的關(guān)鍵酶，與植物抗病性密切相關(guān)，參與調(diào)控酚類物質(zhì)、類黃酮、木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)的合成[18]，其活性變化可以作為衡量植物抗病性的重要生理生化特征。美洲黑楊()的抗病無性系接種病原菌后, PAL和PPO活性大幅升高，且酶活性絕對(duì)值明顯高于抗病性弱的品系[19]。青楊()受到病原菌侵襲后，能通過提高根莖葉PPO活性降低潰瘍病的發(fā)病率，也可通過提高PAL酶活性增強(qiáng)次生代謝物質(zhì)的合成，進(jìn)而提高楊樹抗病性[20]。本研究所選抗病家系的PPO和PAL活性較高，能有效抑制青枯菌的入侵和繁殖，減輕病原菌對(duì)木麻黃的傷害。

總酚包括許多類物質(zhì)，在植物抗病方面發(fā)揮著重要的作用，類黃酮也與植物抗病密切相關(guān)。植物體內(nèi)的生物堿、蒽酮、黃酮和皂苷等物質(zhì)能顯著抑制真菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，為評(píng)價(jià)植物抗病強(qiáng)弱的關(guān)鍵指標(biāo)[21]。研究表明總酚和類黃酮物質(zhì)合成量的提高能使轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)黑斑病的抗性明顯增強(qiáng)[22]，本研究也獲得類似的結(jié)果。本研究中26個(gè)木麻黃家系受青枯病侵染后，它們體內(nèi)總酚和類黃酮含量差異顯著或極顯著，相關(guān)性分析表明次生代謝物質(zhì)含量高的家系對(duì)青枯病的抗性顯著提高，植株受到病原菌侵襲后依然正常生長(zhǎng)，因此這2種次生代謝物可以作為短枝木麻黃抗青枯病選育的重要指標(biāo)。

短枝木麻黃不同家系接種青枯病病原菌后病情特征和生理生化響應(yīng)指標(biāo)存在著顯著差異，說明它們對(duì)青枯病的抗性差異較大，具有較大的選擇潛力?；谏砩憫?yīng)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)，篩選出了8個(gè)優(yōu)良家系，這些家系的 6個(gè)生理生化響應(yīng)指標(biāo)顯著高于群體均值，且在褐梗枝條接種青枯病菌試驗(yàn)中表現(xiàn)的病害程度低，萎蔫枝條少，生長(zhǎng)基本不受影響。后續(xù)可以結(jié)合生長(zhǎng)速度、干形等性狀進(jìn)行綜合選擇，從這8個(gè)家系中選擇出優(yōu)良單株進(jìn)行無性繁殖形成無性系, 進(jìn)一步在青枯病發(fā)病區(qū)開展田間抗病性測(cè)定和驗(yàn)證試驗(yàn)，最終獲得抗病無性系在生產(chǎn)中廣泛使用。

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Resistance Evaluation and Selection ofFamilies Against

WEI Long1, WEI Yongcheng2, MENG Jingxiang2, ZHANG Yong2, ZHOU Yi1*

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization/ Guangdong Academy of Forestry,Guangzhou 510520, China; 2. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry,Guangzhou 510520, China)

In order to explore the physiological and biochemical response patterns ofagainst infection of, the disease-resistant assessment and selection of differentfamilies were studied based on the correlations between physiological and biochemical traits and disease-resistant characteristics. The results showed that the disease index (DI) and relative disease intensity (RDI) of 26families were significantly different after inoculated with. The differences of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), phenylalanine ammonialyase (PAL), polyphenol oxidase (PPO), total phenolics (TP) and flavonoid (Flav) among the families were significant or very significant, indicating that the tested families had huge variation at resistance againstand great selection potential is expectable. The disease incidence and intensity of the 26 families presented negative correlation with the six physiological and biochemical indexes at significant or very significant level. It was indicated in a certain range that the more defense enzyme activities or secondary metabolite contents, the lower disease incidence and intension were detected. Two disease characteristics and six physiological and biochemical parameters were used to evaluate and selectfamilies against, eight resistant families, including 201, 206, 198, 207, 202, 213, 208 and 195, were preliminarily selected according to the selection rate of 30%. The mean RDI and DI of eight resistant families were 25.94% and 28.93%, respectively, which was lower than those of overall mean values. And the activities of SOD, CAT, PAL, PPO, and contents of TP, Flav in these eight families were 11.90%, 13.50%, 24.77%, 12.71%, 25.68% and 18.76% higher than those of overall mean values, respectively. Therefore, the selected 8 families showed low disease degree, few wilting branches, and plant growth was not affected, indicating strong disease resistance and could be widely used in subsequent production.

; Family selection;; Physiological and biochemical character; Disease-resistant

10.11926/jtsb.4614

2021-01-21

2022-05-05

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2018KJCX011)；省級(jí)生態(tài)公益林效益補(bǔ)償資金省統(tǒng)籌項(xiàng)目(2020STC-03)資助

This work was supported by the Project for Forestry Science and Technology Innovation in Guangdong (Grant No. 2018KJCX011), and the Provincial Planning Project of Guangdong Ecological Public Welfare Forest Benefit Compensation (Grant No. 2020STC-03).

魏龍(1976年生), 男, 高級(jí)工程師, 主要從事林業(yè)碳匯、沿海防護(hù)林生態(tài)系統(tǒng)研究。E-mail: weilong@sinogaf.cn

. E-mail: zycqr0522@163.com