遮陰對(duì)檸檬香茅中萜類化合物及其合成酶基因影響研究

張少平, 邱珊蓮, 黃惠明, 李海明, 李洲, 鞠玉棟, 鄭開(kāi)斌

遮陰對(duì)檸檬香茅中萜類化合物及其合成酶基因影響研究

張少平1, 邱珊蓮1, 黃惠明1, 李海明1, 李洲1, 鞠玉棟1, 鄭開(kāi)斌2*

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福州 350003)

為獲取檸檬香茅()中萜類化合物及其合成酶基因信息，以正常生長(zhǎng)及遮陰下的檸檬香茅嫩葉為材料，進(jìn)行代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合qRT-PCR驗(yàn)證分析。代謝組分析結(jié)果表明，檸檬香茅所含萜類共23種，包括單萜4種、倍半萜4種、二萜8種、三萜3種和四萜4種。在遮陰下，檸檬香茅的二萜類銀杏內(nèi)酯C和四萜類蝦青素相對(duì)含量更高。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，單萜生物合成涉及4類合成酶的24個(gè)基因，二萜生物合成涉及11類合成酶的49個(gè)基因，倍半萜和三萜生物合成涉及12類合成酶的58個(gè)基因，其中6類合成酶的8個(gè)基因在遮陰下的相對(duì)表達(dá)量顯著提高，而前萘二烯加氧酶(c64786.0)基因正好相反。qRT-PCR分析表明，遮陰下4個(gè)FPKM值差異明顯的萜類合成酶基因表達(dá)的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，但不同合成酶基因的差異表達(dá)量存在差異。因此，檸檬香茅所含4類共23種萜類化合物由27類合成酶共131個(gè)基因編碼而來(lái)，不同光照強(qiáng)度影響9個(gè)合成酶基因的表達(dá)和2種萜類化合物含量。

檸檬香茅；萜類；合成酶；代謝組；轉(zhuǎn)錄組

檸檬香茅()又稱檸檬草、香茅草及香茅等，為禾本科(Gramineae)香茅屬多年生密叢型具香味草本[1]。廣泛分布于熱帶及南亞熱帶等地[2]，中國(guó)福建、廣東、廣西、云南等地有栽培。檸檬香茅具有濃郁的檸檬香氣，可提取香茅精油[3–5]。香茅精油主要成分為揮發(fā)性萜類(單萜)物質(zhì)[6–7]，具有殺菌消炎，平喘止咳，舒筋活絡(luò)，抒解抑郁及提振心情等功效[8–10]。萜類也叫萜烯類或類異戊二烯類化合物，為自然界中種類極為豐富的次生代謝產(chǎn)物，數(shù)量多達(dá)55 000多種[11–12]。萜類在植物初生和次生代謝中均起重要調(diào)節(jié)作用，都是從五碳原子(C5)的異戊二烯單元IPP (異戊烯二磷酸)及其異構(gòu)體DMAPP (二甲基烯丙基二磷酸)合成而來(lái), 再形成C10單萜、C15倍半萜、C20二萜、C30三萜及C40類胡蘿卜素等化合物[13–14]。萜類化合物有來(lái)源于細(xì)胞質(zhì)中的法尼基焦磷酸的甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和質(zhì)體中牻牛兒焦磷酸的甲基赤蘚醇磷酸途徑(MEP途徑) 2種, 其中單萜、二萜和類胡蘿卜素來(lái)源于MEP途徑, 倍半萜和三萜來(lái)源于MVA途徑[15–16]。萜類化合物種類繁多，其生物合成所涉及相關(guān)酶基因也多種多樣[17–19]。

香茅為喜陽(yáng)植物，光照充分環(huán)境下生長(zhǎng)更為旺盛，陰涼條件下其生物產(chǎn)量明顯降低，但目前并未見(jiàn)遮陰環(huán)境下香茅萜類成分及其含量差異研究。有大量關(guān)于香茅精油(揮發(fā)性單萜)提取及其成分測(cè)定等研究報(bào)道[20–22]，然而香茅種類繁多, 不同種類香茅所含揮發(fā)性單萜成分差異明顯[23–24]。即使同一種類香茅由于不同提取方式或檢測(cè)手段不同，導(dǎo)致其所含揮發(fā)性單萜具體成分及含量存在差異[25–27]。此外，還未見(jiàn)香茅萜類形成相關(guān)合成酶基因的研究報(bào)道。本試驗(yàn)以大田自然生長(zhǎng)檸檬香茅為研究對(duì)象, 以同環(huán)境生長(zhǎng)但覆蓋60%遮陽(yáng)網(wǎng)為對(duì)照，通過(guò)代謝組檢測(cè)萜類具體成分，同時(shí)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析萜類合成代謝相關(guān)酶基因，為進(jìn)一步進(jìn)行香茅萜類生物合成及其基因工程等研究打下良好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料檸檬香茅()為福建省漳州地區(qū)野生種，于2021年3月中旬分株種植于穴盤(pán)，其中一半放置大田陽(yáng)光照射充足處，另一半放置大田覆蓋遮光率60%的遮陽(yáng)網(wǎng)。6月中旬取不同環(huán)境下生長(zhǎng)的2組植株嫩葉各6份，及時(shí)放入液氮并轉(zhuǎn)至–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 代謝組檢測(cè)及萜類成分篩選

取光照和遮陰下生長(zhǎng)的香茅嫩葉各3份，經(jīng)真空冷凍干燥(凍干機(jī)：Scientz-100 F)后研磨(MM 400研磨儀, Retsch)成粉末狀；稱取100 mg粉末溶解于0.6 mL 70%甲醇提取液，4 ℃下放置10 h，期間渦旋4～6次；離心取上清液用微孔濾膜過(guò)濾，濾液保存于進(jìn)樣瓶中，用于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)分析[28]?；诎龠~客科技有限公司數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB (metware database)，根據(jù)二級(jí)譜信息對(duì)6個(gè)樣品中的萜類成分進(jìn)行定性和定量分析，萜類化合物相對(duì)含量取3份的平均值。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及萜類合成酶篩選

采用Trizol法提取香茅嫩葉總RNA，獲得cDNA后進(jìn)行Illumina HiSeqTM 2500轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析[28]。經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋獲得單萜、二萜、倍半萜和三萜代謝途徑具體合成酶基因信息。

1.4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

光照(標(biāo)號(hào)：陽(yáng)1-1)及遮陰(標(biāo)號(hào)：陰1-1)樣本經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的總RNA，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀(scandrop100)測(cè)定OD值。檢測(cè)合格后采用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TUREscript 1st Stand cDNA Syn- thesis Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒中反應(yīng)體系和反應(yīng)條件合成光照及遮陰香茅cDNA, 以其為模板，進(jìn)行4個(gè)差異表達(dá)明顯的萜類合成酶基因(根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中FPKM值)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，每個(gè)基因檢測(cè)3次，取平均值。具體基因及其引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR分析的5個(gè)基因及其引物

2 結(jié)果和分析

2.1 代謝組檢測(cè)萜類化合物

根據(jù)代謝組檢測(cè)光照及遮陰下生長(zhǎng)的檸檬香茅代謝產(chǎn)物進(jìn)行萜類成分及其相對(duì)含量分析。結(jié)果表明，檸檬香茅含萜類23種，包括單萜、倍半萜和四萜各4種，二萜8種，三萜3種。遮陰下二萜類的銀杏內(nèi)酯C和四萜類蝦青素相對(duì)含量更高，而其他萜類成分相對(duì)含量在不同光照環(huán)境下影響不大，尤其是作為香茅精油主要成分的揮發(fā)性單萜相對(duì)含量差異不明顯。4種揮發(fā)性單萜相對(duì)含量由高到低依次為-羅勒烯、脫氫馬錢素四乙酸酯、橙花醇和-蒎烯(表2)。

表2 23種萜類化合物及其相對(duì)含量

2.2 萜類合成酶基因信息

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，進(jìn)行單萜、二萜以及倍半萜和三萜等合成酶基因信息分析。

2.2.1 單萜生物合成酶基因信息

單萜生物合成酶包括羧基吲哚合成酶的9個(gè)家族基因、新薄荷醇脫氫酶的13個(gè)家族基因、芳樟醇合成酶和荊芥內(nèi)酯單氧化酶各1個(gè)基因(表3)。不同光照下，羧基吲哚合成酶基因和荊芥內(nèi)酯單氧化酶相對(duì)表達(dá)量均很低，芳樟醇合成酶相對(duì)表達(dá)量均較高，而新薄荷醇脫氫酶的13個(gè)家族基因相對(duì)表達(dá)量相差顯著，其中基因在光照下的表達(dá)量顯著低于遮陰環(huán)境。

表3 編碼4類單萜生物合成酶的24個(gè)基因

2.2.2 二萜生物合成酶基因信息

二萜生物合成酶包括赤霉素2-雙加氧酶的26個(gè)家族基因、貝殼杉烯合成酶的5個(gè)家族基因、異貝殼杉烯羥化酶、莫米內(nèi)酯-合成酶及赤霉素20氧化酶各3個(gè)家族基因、貝殼杉烯酸單加氧酶及三甲基十三碳四烯合成酶各2個(gè)家族基因、二烯11-羥化酶、共丙基二磷酸合成酶、二烯氧化酶及荊芥內(nèi)酯合成酶各1個(gè)基因(表4)。對(duì)比光照環(huán)境，遮陰下赤霉素2-雙加氧酶(和)、貝殼杉烯合成酶(和)、莫米內(nèi)酯-合成酶()和貝殼杉烯酸單加氧酶()等6個(gè)二萜生物合成酶基因的相對(duì)表達(dá)量顯著提高。

2.2.3 倍半萜和三萜生物合成酶基因信息

倍半萜和三萜生物合成酶包括大根香葉烯合成酶的16個(gè)家族基因、蓍醇B合成酶的15個(gè)家族基因、橙花叔醇合成酶的13個(gè)家族基因、法呢基二磷酸法呢基轉(zhuǎn)移酶的4個(gè)家族基因、前萘二烯加氧酶的3個(gè)家族基因、法尼醇脫氫酶的2個(gè)家族基因、羽扇豆醇合成酶、無(wú)環(huán)倍半萜合成酶、-法尼烯合成酶、-大蒈烯合成酶以及馬兜鈴烯1,3-二羥基酶各1個(gè)基因(表5)。大根香葉烯合成酶、蓍醇B合成酶及橙花叔醇合成酶等雖含有大量家族基因,但大多數(shù)基因在光照及遮陰環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量均很低，且不存在差異表達(dá)極顯著基因。前萘二烯加氧酶()在光照環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量更高，而法尼醇脫氫酶)在光照環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量正好相反。

2.3 差異表達(dá)基因的qRT-PCR檢測(cè)

對(duì)比光照和遮陰下檸檬香茅的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，挑選FPKM值差異明顯的4個(gè)參與萜類合成的酶基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，4個(gè)萜類合成酶基因在光照及遮陰下的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組的FPKM值結(jié)果一致，但2種檢測(cè)結(jié)果差異表達(dá)倍數(shù)存在差異。前萘二烯加氧酶()基因在光照環(huán)境下表達(dá)量更高，而其他3個(gè)合成酶基因在遮陰環(huán)境下表達(dá)更高(圖1)。

表4 編碼11類二萜生物合成酶的48個(gè)基因

表5 編碼12類倍半萜和三萜生物合成酶的58個(gè)基因

續(xù)表(Continued)

圖1 4個(gè)差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

3 結(jié)論和討論

香茅種類繁多，不同品種香茅提取的精油中揮發(fā)性萜類(單萜)物質(zhì)差異明顯[29]，檸檬香茅精油的揮發(fā)性萜類主要為開(kāi)鏈單萜有機(jī)物檸檬醛(香葉醛和橙花醛)等；而爪哇香茅()提取精油所含揮發(fā)性萜類主要為無(wú)環(huán)單萜香茅醛及香葉醇等。此外，同品種檸檬香茅在不同地域栽培，其精油單萜類成分及含量同樣差異明顯[1]。前人研究香茅萜類揮發(fā)性成分大多通過(guò)提取精油，導(dǎo)致具體萜類成分及含量差異較大。本研究首次通過(guò)代謝組檢測(cè)光照和遮陰下檸檬香茅萜類成分及相對(duì)含量，其4種揮發(fā)性單萜相對(duì)含量依次為-羅勒烯>脫氫馬錢素四乙酸酯>橙花醇>-蒎烯, 這4種單萜相對(duì)含量在光照和遮陰下均差異不明顯。這與之前的研究結(jié)果[1]不同，可能與同一品種在不同地域栽培有關(guān)，或者是分析方法不同，提取精油過(guò)程中的高溫加熱發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致檸檬香茅中單萜類化合物發(fā)生變化。本研究進(jìn)一步對(duì)單萜生物合成酶基因進(jìn)行分析，檸檬香茅單萜有4類合成酶共24個(gè)基因，這些家族基因的相對(duì)表達(dá)量大多在不同環(huán)境下均極低，且差異不顯著。此外，只有1個(gè)新薄荷醇脫氫酶()基因相對(duì)表達(dá)量在光照下顯著低于遮陰環(huán)境。

除揮發(fā)性單萜外，本研究還檢測(cè)到檸檬香茅中有19種倍半萜、二萜、三萜及四萜等萜類化合物，除二萜類的銀杏內(nèi)酯C和四萜類蝦青素相對(duì)含量在遮陰下更高外，其他萜類成分相對(duì)含量在不同光照下的影響不大。在11類二萜生物合成酶的38個(gè)基因中，有2個(gè)赤霉素2-雙加氧酶基因(和)、2個(gè)貝殼杉烯合成酶基因(和)、1個(gè)莫米內(nèi)酯-合成酶基因()和1個(gè)貝殼杉烯酸單加氧酶基因()等6個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量在遮陰下顯著提高。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組研究結(jié)果，遮陰環(huán)境下生長(zhǎng)的檸檬香茅中二萜類成分銀杏內(nèi)酯C相對(duì)含量更高，這與其6個(gè)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量顯著提高成正比。不同光照環(huán)境下檸檬香茅的倍半萜和三萜具體成分和含量差異不大，但其合成酶中前萘二烯加氧酶基因()在光照環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量更高, 而法尼醇脫氫酶基因()正好相反。

有報(bào)道光照能夠提高葡萄()的香茅醇及橙花醇等萜類含量及其相關(guān)基因的表達(dá)量[30],而本研究中遮陰提高了檸檬香茅中銀杏內(nèi)酯C和蝦青素等2個(gè)萜類化合物含量及其相關(guān)的8個(gè)基因的表達(dá)量，這可能是因?yàn)楣庹盏冗m宜環(huán)境能促進(jìn)植物中某些重要萜類成分的生成，而某些萜類成分的提高是因?yàn)橹参镌谡陉幍饶婢趁{迫后作為響應(yīng)的防御信號(hào)。

本研究采用代謝組結(jié)合轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檸檬香茅萜類化合物及其合成酶基因分析，檸檬香茅中有4類共23種萜類化合物，是由27類合成酶共131個(gè)基因編碼而來(lái)；有2種萜類化合物相對(duì)含量在遮陰環(huán)境明顯升高，其對(duì)應(yīng)的6類合成酶8個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量也明顯提高，此外還有1個(gè)合成酶基因在遮陰環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量明顯下降，這些為進(jìn)一步進(jìn)行香茅萜類生物合成及其基因工程等研究打下良好基礎(chǔ)。

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Effects of Shading on the Production and Synthase Genes of Terpenoids in

ZHANG Shaoping1, QIU Shanlian1, HUANG Huiming1, LI Heiming1, LI Zhou1, JU Yudong1, ZHENG Kaibin2*

(1. Subtropical Agriculture Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou 363005, Fujian, China; 2. Agriculture Ecology Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003, China)

In order to obtain the information of terpenoids and their synthase genes of, the changes in the transcriptome and metabolome of young leaves under light and shade were studied, and the expression of terpenoid synthase genes was confirmed by qRT-PCR. Metabolomic analysis showed thatcontained 23 terpenes, including 4 monoterpenes, 4 sesquiterpenes, 8 diterpenes, 3 triterpenes and 4 tetraterpenes. The relative contents of ginkgolide C and astaxanthin under shade was higher than those under light. According to transcriptome sequencing, there were 24, 49 and 58 genes encoding 4, 11 and 12 synthases involved monoterpene, diterpene and sesquiterpene and triterpene biosynthesis pathway, respectively, in which the relative expression of 8 genes encoding 6 synthetases significantly increased under shade, but that of premnaspirodiene oxygenase gene was just reverse. The expression patterns of four terpenoid synthase genes with significant difference FPKM values under shading by qRT-PCR was consistent with the transcriptome sequencing results, however, the differential expression of different synthase genes were different. Therefore, it was suggested thatcontains 23 terpenoids in 4 categories catalyzed by 27 synthetases, which are encoded by 131 genes, and light intensity affects the relative content of 2 terpenoids and the expression of 9 synthetase genes.

; Terpenoid; Synthase; Transcriptome; Metabolome

10.11926/jtsb.4600

2021-12-30

2022-02-22

福建省公益類科研院所專項(xiàng)(2020R1030001, 2020R1030005)；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新平臺(tái)專項(xiàng)(CXPT202103); 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CXTD2021006-3)資助

This work was supported by the Special Project for Public Welfare Research Institutes in Fujian (Grant No. 2020R1030001, 2020R1030005), the Special Project for Science and Technology Innovation Platform in FAAS (Grant No. CXPT202103), and the Project for Youth Innovation Team of FAAS (Grant No. CXTD2021006-3).

張少平(1975年生)，男，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事功能植物次生代謝產(chǎn)物相關(guān)研究。E-mail: zspnc@163.com

. E-mail: 409119296@.qq.com