維生素D 調(diào)控Kupffer 細(xì)胞極化在非酒精性脂肪性肝病防治中的作用

羅雯靜 董顯文 趙巧素 郭雯瑩 柳惠未 葉樺

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是與胰島素抵抗密切相關(guān)的遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激性臨床病理綜合征，被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)[1]。作為人體必需的維生素之一，維生素D除了調(diào)節(jié)骨代謝和鈣磷代謝，還具有非經(jīng)典效應(yīng)，包括調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗凋亡、抗炎和抗纖維化等作用[2]。多項流行病學(xué)研究顯示血清低水平維生素D 是NAFLD 發(fā)生、發(fā)展的獨(dú)立危險因素，然而補(bǔ)充維生素D 對NAFLD 的保護(hù)作用及其中的機(jī)制尚未明確[3-6]。Kupffer 細(xì)胞是肝臟炎癥-免疫調(diào)控的關(guān)鍵細(xì)胞，具有高度的可塑性和異質(zhì)性，可在不同的微環(huán)境信號作用下分化為不同的表型，即經(jīng)典活化的M1 型（classically activated macrophages，CAM）和替代活化的M2 型（alternative activated macrophages，AAM）[7]。Kupffer 細(xì)胞表型和功能改變在NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[8]。本研究擬通過高脂飲食建立NAFLD 小鼠模型并給予維生素D 補(bǔ)充治療，探討維生素D 調(diào)控Kupffer 細(xì)胞極化在影響NAFLD 進(jìn)程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑 30 只健康雄性4～6 周齡野生型C57BL/6 小鼠（SPF 級）購自中國維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；普通飼料（SPF 級小鼠維持飼料，批號：1010001）購自中國協(xié)同生物工程有限公司；高脂飼料（60%脂肪熱量飼料，批號：D12492）購自中國SYSE Bio 公司；D-Hanks 液、DMEM 培養(yǎng)液、FBS 購自美國Gibco 公司（批號分別為14170112、12430054、16000-044）；Ⅰ型和Ⅳ型膠原酶（批號分別為C0130、C5138）購自美國Sigma公司；Percoll分離液（批號：sc-500790A）購自美國Santa Cruz 公司；活性維生素D-1，25（OH）2D3（批號：HY-10002）購自美國MedChemExpress 公司，以PBS 為溶媒配制成0.5 mg/L 溶液；Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒購自日本Takara 公司；兔抗鼠單克隆抗體購自英國Abcam 公司（批號分別為ab28481、ab128870、ab184032、ab234111）。PCR 引物由中國上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 動物分組和模型建立 30 只C57BL/6 小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組，每組10 只。對照組予正常飲食（普通飼料）喂飼，高脂飲食組予高脂飲食（高脂飼料）喂飼，維生素D 補(bǔ)充組予高脂飲食喂飼并給予活性維生素D-1，25（OH）2D3，20 μg/kg，隔日灌胃；3 組小鼠均飼養(yǎng)16 周。每組取5 只小鼠以4%水合氯醛腹腔注射麻醉后頸椎脫臼法處死，獲取肝組織液氮冷凍或4%甲醛溶液固定待測；另5 只小鼠行膠原酶原位灌注獲取Kupffer 細(xì)胞：各組小鼠以4%水合氯醛腹腔注射麻醉，分離門靜脈，24 G 留置針穿刺插管固定，予DHanks 液灌注至肝臟呈土黃色后改為含0.025%Ⅰ型膠原酶和0.050% Ⅳ型膠原酶的DMEM 溶液灌注20 min，分離肝臟，置于灌注液中消化10 min，以100 μm 無菌篩網(wǎng)過濾獲得細(xì)胞懸液，密度梯度離心獲得細(xì)胞團(tuán)，4%臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率，調(diào)整細(xì)胞密度至4×106/ml，用含12% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，洗去未貼壁細(xì)胞，余貼壁細(xì)胞即為原代Kupffer 細(xì)胞，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 肝組織病理學(xué)檢查 取各組小鼠肝組織標(biāo)本，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.3.2 小鼠肝組織脂質(zhì)代謝基因、原代Kupffer 細(xì)胞M1/M2 極化基因mRNA 表達(dá)的檢測 采用real-time PCR 法。取各組小鼠肝組織、各組小鼠原代Kupffer 細(xì)胞，以Trizol 試劑提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別檢測肝組織脂質(zhì)合成基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C（sterol-regulatory element binding protein 1C，SREBP1C）和脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）、脂質(zhì)分解基因脂酰輔酶A 氧化酶（acyl-CoA oxidase，ACOX）1 和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）、Kupffer 細(xì)胞M1 極化基因誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）2、TNF-α、IL-6 和M2 極化基因精氨酸酶（arginase, Arg）1、甘露糖受體C2（mannose receptor c type 2，Mrc2）、IL-10 mRNA 表達(dá)水平。引物序列見表1。Real-time PCR 的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA 的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3.3 小鼠肝組織脂質(zhì)代謝蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot 法。取各組小鼠肝組織，裂解液提取組織蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入兔抗鼠SREBP1C 單克隆抗體、兔抗鼠FASN 單克隆抗體、兔抗鼠ACOX1 單克隆抗體、兔抗鼠CPT1A 單克隆抗體，兔抗鼠GAPDH 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔第二抗體，室溫孵育1 h，以電化學(xué)發(fā)光劑顯色，置暗盒X 線曝光，常規(guī)顯影、定影。采用Image J 軟件計算分析蛋白相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad Prism 9 統(tǒng)計軟件，計量資料兩兩比較采用非配對t檢驗，所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組小鼠肝臟脂肪變性情況的比較 肝組織HE染色顯示，高脂飲食組小鼠肝組織呈現(xiàn)大量的空泡樣脂肪變性，以大泡性脂肪變?yōu)橹?；維生素D 補(bǔ)充組小鼠肝組織脂肪空泡數(shù)量減少，以小泡性脂肪變?yōu)橹鳎妶D1（插頁）。

圖1 3 組小鼠肝臟組織病理學(xué)HE 染色結(jié)果

2.2 3 組小鼠肝臟脂質(zhì)代謝基因mRNA 表達(dá)的比較相比對照組，高脂飲食組小鼠肝組織SREBP1C、FASN、ACOX1 和CPT1A mRNA 相對表達(dá)水平均明顯升高；相比高脂飲食組，維生素D 補(bǔ)充組小鼠肝組織SREBP1C、FASN、ACOX1 和CPT1A mRNA 相對表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 3 組小鼠肝臟脂質(zhì)代謝基因mRNA 表達(dá)的比較（A：脂質(zhì)合成基因mRNA 相對表達(dá)水平比較；B：脂質(zhì)分解基因mRNA 相對表達(dá)水平比較）

2.3 3 組小鼠肝臟脂質(zhì)代謝蛋白表達(dá)的比較 相比對照組，高脂飲食組小鼠肝組織SREBP1C、FASN、ACOX1 和CPT1A 蛋白相對表達(dá)水平均明顯升高；相比高脂飲食組，維生素D 補(bǔ)充組小鼠肝組織SREBP1C、FASN、ACOX1 和CPT1A 蛋白相對表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 3 組小鼠肝臟脂質(zhì)代謝蛋白表達(dá)的比較（A：蛋白電泳圖；B：4 種蛋白相對表達(dá)水平比較）

2.4 3 組小鼠Kupffer 細(xì)胞M1/M2 極化基因表達(dá)的比較 相比對照組，高脂飲食組小鼠Kupffer 細(xì)胞iNOS2、TNF-α、IL-6、Arg1、Mrc2 和IL-10 mRNA 相對表達(dá)水平均明顯升高；相比高脂飲食組，維生素D 補(bǔ)充組小鼠Kupffer 細(xì)胞iNOS2、TNF-α、IL-6 和IL-10 mRNA 相對表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 3 組小鼠Kupffer 細(xì)胞M1/M2 極化基因mRNA 表達(dá)的比較（A：M1 極化基因mRNA 相對表達(dá)水平比較；B：M2 極化基因mRNA相對表達(dá)水平比較）

3 討論

NAFLD 是一種除外乙醇攝入和其他明確損肝因素所致的肝臟異常脂質(zhì)沉積為主要特征的臨床病理綜合征，是與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，其疾病發(fā)展譜包括非酒精性單純性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及其相關(guān)的肝硬化和肝細(xì)胞癌[9]。近年來中國NAFLD 發(fā)病率呈逐年上升趨勢，一項新近的流行病學(xué)研究顯示中國成人NAFLD 患病率高達(dá)30%[10]。

血清維生素D 水平與NAFLD 關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)血清低水平維生素D 是加重NAFLD 脂肪變性、炎癥和纖維化的獨(dú)立危險因素[3-4]。肝功能正常的NAFLD成人體內(nèi)維生素D 呈低水平狀態(tài)，而血清高水平維生素D 則顯著降低NASH 的患病風(fēng)險，可見血清維生素D 水平可作為獨(dú)立的代謝特征來預(yù)測NAFLD 的嚴(yán)重程度[11-13]。維生素D 可能對NAFLD 具有保護(hù)作用，但維生素D 補(bǔ)充治療在NAFLD/NASH 患者中是否獲益仍然存在爭議[5-6]，且其中的機(jī)制鮮有探討。本研究通過高脂飲食建立小鼠NAFLD 模型并給予維生素D 補(bǔ)充治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充維生素D 明顯改善NAFLD 肝臟脂肪變性，為補(bǔ)充維生素D 延緩NAFLD 發(fā)生、發(fā)展提供實驗基礎(chǔ)。

NAFLD 發(fā)病機(jī)制可用“二次打擊”學(xué)說來解釋：動物體內(nèi)胰島素抵抗可引起循環(huán)胰島素水平及游離脂肪酸水平升高，脂質(zhì)代謝發(fā)生異常，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過量沉積；而過量沉積的脂質(zhì)會發(fā)生氧化應(yīng)激，從而造成線粒體功能障礙，產(chǎn)生炎性介質(zhì)并引起肝細(xì)胞炎癥[14]?？梢姼闻K脂質(zhì)代謝紊亂是NAFLD 發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成增多、氧化分解代謝不足是肝細(xì)胞脂肪變性的主要原因[15]。SREBP1C 是參與調(diào)控脂肪酸、TG 和合成膽固醇的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可激活下游靶基因，增強(qiáng)多種脂肪酸合成基因的表達(dá)，如FASN[16]。肝細(xì)胞線粒體通過β-氧化分解游離脂肪酸，這一過程的限速酶主要包括ACOX1、CPT1A[15]。本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食的小鼠補(bǔ)充維生素D 后，NAFLD 肝臟脂質(zhì)合成和分解代謝水平降低，這可能正是既往多項臨床實驗中NAFLD 患者接受維生素D 補(bǔ)充治療療效增加的原因，后續(xù)研究可關(guān)注藥物干預(yù)方式、劑型、劑量等以提高其對改善NAFLD 脂質(zhì)代謝紊亂的作用。

Kupffer 細(xì)胞是定居于肝臟的巨噬細(xì)胞，主要位于肝竇，在生理條件下具有調(diào)節(jié)肝內(nèi)炎癥及免疫平衡的作用。NAFLD 形成過程中，脂質(zhì)代謝失衡，過度積累的脂肪酸通過多種信號通路激活Kupffer 細(xì)胞，后者通過產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)參與肝損傷的發(fā)生與發(fā)展[17]。巨噬細(xì)胞可針對不同刺激信號作出應(yīng)答，并分化成為具有不同功能的表型細(xì)胞即極化，其極化類型主要包括經(jīng)典活化的M1 型和替代活化的M2型。M1 型巨噬細(xì)胞由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、IFN-γ 或TNF-α 等誘導(dǎo)活化，其活化標(biāo)志包括iNOS2、TNF-α、IL-6 等，與炎癥反應(yīng)的啟動和維持有關(guān)；M2 型巨噬細(xì)胞由IL-4、IL-13、IL-10 或免疫復(fù)合物等誘導(dǎo)活化，其活化標(biāo)志包括Arg1、Mrc2、IL-10 等，與炎癥反應(yīng)的緩解、組織重塑和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[18]。既往研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠Kupffer 細(xì)胞主要表現(xiàn)為促炎的M1 型極化[19]。Maina 等[20]通過膽堿甲硫氨酸缺乏飲食誘導(dǎo)建立小鼠NASH 模型，研究發(fā)現(xiàn)肝臟巨噬細(xì)胞M1 型偏倚是NAFLD 向NASH 進(jìn)展的重要因素。因此，Kupffer 細(xì)胞極化轉(zhuǎn)變與NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。此外，近期研究顯示不同極化表型的巨噬細(xì)胞可直接影響肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝，其中M1 型巨噬細(xì)胞可能通過促進(jìn)分泌炎性細(xì)胞因子以增強(qiáng)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成代謝從而增加脂質(zhì)沉積[21]。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充維生素D 后NAFLD 小鼠Kupffer 細(xì)胞M1 型極化被抑制。由此推測維生素D 可能通過逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的Kupffer 細(xì)胞M1 極化表型來減少肝臟脂質(zhì)合成代謝，從而緩解NAFLD 肝臟脂肪變性。

綜上所述，補(bǔ)充維生素D 改善NAFLD 肝臟脂肪變性，可能與抑制Kupffer 細(xì)胞M1 型極化進(jìn)而影響肝臟脂質(zhì)代謝水平有關(guān)。補(bǔ)充維生素D 治療為發(fā)展NAFLD 防治手段提供新方向。