芍藥苷通過調(diào)控巨噬細胞活性抗幽門螺桿菌作用及其機制研究

徐 微,徐建光,何雪云,林小花

徐微,徐建光,何雪云,林小花,衢州市人民醫(yī)院(衢州四省邊際中心醫(yī)院)消化內(nèi)科 浙江省衢州市 324000

0 引言

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)為一種微需氧、螺旋狀革蘭陰性菌,多定植于機體胃腸道內(nèi),Warren與Marshall在1983年首次從胃內(nèi)分離中.流行病學(xué)研究表明H.pylori感染了世界范圍內(nèi)一半以上的人口.目前已知發(fā)病率的高低與社會經(jīng)濟水平,人口密集程度,公共衛(wèi)生條件以及水源供應(yīng)有較密切的關(guān)系.中國及大多數(shù)發(fā)展中國家人群H.pylori感染因地區(qū)有所不同.低達20%,高達90%,人群中總感染率高于發(fā)達國家.臨床研究已經(jīng)明確,H.pylori的長期慢性感染為人們發(fā)生胃癌、消化性潰瘍、慢性活動性胃炎及黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等疾病主要因素[1,2].當前,臨床對預(yù)防H.pylori相關(guān)胃十二指腸疾病主要療法為根除H.pylori,西醫(yī)的三聯(lián)治療,如BAM、OAC等一度使臨床患者H.pylori根除率達90%以上[3],但近些年來,由于患者對西藥耐藥率的升高、治療依從性差及藥物不良反應(yīng)等,使H.pylori根除率明顯降低,因此,臨床急需一些新的治療方案.當前,隨著中醫(yī)學(xué)在臨床的廣泛應(yīng)用,中藥有對患者耐藥性低、不良發(fā)應(yīng)小及不引起腸道菌群失調(diào)等特點,這說明在對H.pylori感染的治療方案中醫(yī)藥有一定優(yōu)勢[4].芍藥苷(paeoniflorin,PF)為單萜類糖苷化合物,是傳統(tǒng)中藥芍藥主要成分,有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗血小板聚集及抗氧化等影響[5].有研究顯示,PF可經(jīng)過對TLR2信號路徑抑制來降低巨噬細胞活化[6].因此,本研究經(jīng)過分析PF通過調(diào)控巨噬細胞活性抗H.pylori作用及相關(guān)機制,為臨床患者診療提供一些借鑒.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物: 昆明小鼠6只,雌雄各半,體重22 g-26 g;新西蘭家兔4只,雌雄各半,體重2.0 kg-2.6 kg,均購自上海斯萊克實驗動物公司.常規(guī)飼養(yǎng)3 d后開始實驗,室溫維持22 ℃-26 ℃,相對濕度55%-65%,晝夜循環(huán),保持12 h光照,小鼠灌胃、添加飼料及換水等均有專人進行.

1.1.2 實驗藥物、試劑: 芍藥苷(南京廣潤生物公司),兔抗TLR2多克隆抗體(美國EMD Millipore公司),兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、Toll樣受體4(toll-like receptor-4,TLR4)多克隆抗體(美國Abcam公司),人單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)試劑盒(北京瑞博奧生物公司),白細胞介素(interleukin,IL)-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(美國RD Systems公司).

1.2 方法 (1)確定實驗劑量.急毒實驗14 d,設(shè)置藥物梯度濃度,分別為(10,30,50,70,90) mg/kg,確定安全的給藥劑量EC50,以EC50進行動物實驗;(2)制備含藥血清,家兔實驗前禁食12 h,依據(jù)人和動物劑量轉(zhuǎn)換,藥物組灌胃家兔26 mg/kg的PF藥液,對照組家兔灌胃等劑量生理鹽水,共灌胃3次,首次和第二次灌藥間隔20 h,第二次和第三次灌藥間隔4 h.末次給藥后2 h在無菌條件下心臟采血,室溫下靜置3 h,離心機3000 rmp離心15 min,血清分離,在同種條件下將藥物血清搖勻,于56 ℃下水浴滅活20 min,保存?zhèn)溆?(3)提取小鼠腹腔巨噬細胞,無菌淀粉肉湯2 mL注入至小鼠腹腔內(nèi),1次/d,共注射3 d.末次注射后小鼠脫頸椎處死,在75%乙醇內(nèi)浸泡5 min.小鼠取出后酒精瀝干,在無菌紗布上仰臥放置.在下腹皮膚處剪一小口,在將全部腹部皮膚剪開,暴露腹壁.采用針管吸出3 mL至4 mL的腹腔液,離心機離心后上清去除.DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%雙抗)培養(yǎng),放置與37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi);(4)含藥血清作用于小鼠腹腔巨噬細胞,實驗組加入5%含藥血清,對照組加入無藥血清,各組同時在加入H.pylori11637,每組小鼠腹腔內(nèi)巨噬細胞達到4×106.含藥血清在作用6 h后收集細胞.未經(jīng)H.pylori11637作用的巨噬細胞作為空白組.

1.3 觀察指標 (1)采集樣品,小鼠所分離腹腔巨噬細胞注入培養(yǎng)皿內(nèi),在加入培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng).在細胞貼壁后將上清和細胞碎片吸走,實驗組在加入含藥血清、培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)與H.pylori11637培養(yǎng)上清,含藥血清作用6 h后采用2×106個細胞用于各項檢測;(2)采集巨噬細胞培養(yǎng)的上清液,ELISA法檢測各組小鼠MCP-1、IL-1β、TNF-α含量,具體步驟依據(jù)試劑盒說明書進行;(3)Western-Blot檢測熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)、iNOS、Toll樣受體2(toll-like receptor-2,TLR2)及TLR4蛋白表達,細胞研磨,經(jīng)組織裂解上樣電泳,起始電壓80 V,溴酚藍染料前緣進入分離膠上緣后電壓提升至100 V,溴酚藍泳出分離膠下緣電泳結(jié)束.半干電轉(zhuǎn)移儀于PVDF膜內(nèi)行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移,恒流30 mA,連續(xù)90 min.PVDF膜取出5%TBST脫脂奶粉封閉,震蕩60 min.結(jié)束封閉TNS-T漂洗液洗膜10 min,3次,膜轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至雜交袋,加入適量漂洗液稀釋抗體,封口后4 ℃下孵育過夜;TBST漂洗液洗膜10 min,3次,加入漂洗液稀釋辣根過氧化物酶標記二抗,震蕩60 min.PVDF膜放置在ECL顯色液內(nèi)震蕩溫育5 min,暗室下曝光、顯影及定影.清水沖洗以后,晾干掃描,IPP軟件對掃描圖像目的條帶行灰度分析;(4)檢測小鼠細胞HSP70 mRNA、TLR2 mRNA及TLR4 mRNA表達,Trizol法提取小鼠細胞總RNA行RT-PCR擴增,HSP70上游引物5’-GATTGAGATGATTTTGGAG-3’,下游引物5’-GTATGTTAAGTATATGATTG-3’,擴增片段是482 bp;TLR2上游引物5’-GCTCCAGGAATTCCTCGGTA-3’,下游引物5’-GAGTCCTGCATGCTAGCTAG-3’,擴增片段為389 bp;TLR4上游引物5’-GAATTGCGCGATGTAGTACG-3’,下游引物5’-GTTGTACTGTACTAGGTGCT-3’,擴增片段531 bp;內(nèi)參β-actin上游引物5’-CTTGATCGTACGTAGCCTGA-3’,下游引物5’-GTGTAGTGTACTGTCATGCA-3’,擴增片段482 bp.PCR反應(yīng)條件: 94 ℃下45 s,55 ℃下50 s,72 ℃下75 s,在40次循環(huán)以后獲取核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB) mRNA、MyD88 mRNA及TLR4 mRNA循環(huán)閾值(Ct),使用△△Ct(△△Ct=Ct目的基因-△Ct內(nèi)參基因)分析,算出2-△△Ct目的基因相對表達量.

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料(mean±SD)表示,t檢驗,計數(shù)資料采用n(%)表示,χ2檢驗,多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗,P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 PF的有效濃度的確定 通過有效濃度曲線得出,PF對于家兔的EC50為45 mg/mL.

2.2 各組小鼠巨噬細胞上清液內(nèi)MCP-1、IL-1β及TNF-α含量 對照組小鼠MCP-1、IL-1β及TNF-α含量較空白組升高,實驗組小鼠MCP-1、IL-1β及TNF-α含量較對照組降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),詳見表1.

表1 各組小鼠巨噬細胞上清液內(nèi)MCP-1、IL-1β及TNF-α含量(n=2×106,mean±SD)

2.3 各組小鼠巨噬細胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表達對照組巨噬細胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表達較空白組升高;實驗組巨噬細胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表達較對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),詳見表2,圖1.

表2 各組小鼠巨噬細胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表達對比(n=2×106,mean±SD)

圖1 各組巨噬細胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表達.iNOS: 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;TLR4: Toll樣受體4;TLR2: Toll樣受體2;β-actin: β-肌動蛋白.

2.4 各組小鼠巨噬細胞TLR4、TLR2 mRNA相對表達量 對照組小鼠巨噬細胞TLR4、TLR2 mRNA相對表達量較空白組升高,實驗組小鼠巨噬細胞TLR4、TLR2 mRNA相對表達量較對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),詳見表3.

表3 各組小鼠巨噬細胞TLR4、TLR2 mRNA相對表達量(n=2×106,mean±SD)

2.5 各組小鼠巨噬細胞HSP70 mRNA及蛋白表達 對照組小鼠巨噬細胞HSP70 mRNA及蛋白表達較空白組升高,實驗組小鼠巨噬細胞HSP70 mRNA及蛋白表達較對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),詳見表4,圖2.

表4 各組小鼠巨噬細胞HSP70 mRNA及蛋白表達(n=2×106,mean±SD)

圖2 各組小鼠巨噬細胞HSP70蛋白表達.HSP70: 熱休克蛋白70;β-actin: β-肌動蛋白.

3 討論

機體感染H.pylori后,抵抗H.pylori感染天然屏障為機體內(nèi)固有免疫,胃組織內(nèi)樹突狀細胞、巨噬細胞等固有免疫細胞經(jīng)過分泌IL-18等細胞因子,將免疫細胞激活并分泌炎癥介質(zhì),從而起到抗感染的作用[7,8].H.pylori感染胃組織內(nèi)巨噬細胞后,炎癥組織局部巨噬細胞經(jīng)浸潤、增生、激活同時分泌TNF-α等細胞因子,將入侵微生物殺傷并將淋巴細胞活化.同時TNF-α協(xié)同誘導(dǎo)巨噬細胞形成NO,導(dǎo)致DNA受損引起宿主細胞凋亡[9-11].

長期以來西藥治療H.pylori感染取得了較好療效,但對于H.pylori清除仍有一定困難,患者在停藥后易復(fù)發(fā).目前,在臨床上H.pylori對于抗生素,尤其是甲硝唑、克拉霉素等原發(fā)耐藥率普遍升高,這了嚴重影響了常用根治方案的治療效果.PF有多重生物學(xué)功效,包含抗風(fēng)濕、神經(jīng)保護、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、加速肝細胞再生等,由于其毒副影響較小而在臨床廣泛使用.近些年來,相關(guān)研究顯示PF還可下調(diào)IL-6、IL-1β、TNF-α等細胞因子活性,發(fā)揮廣泛抗炎影響[12].本文研究顯示,實驗組小鼠MCP-1、IL-1β及TNF-α含量較對照組降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,和上述研究結(jié)果一致.

TLR4與TLR2為Toll樣受體,為Ⅰ型跨膜受體蛋白,多在抗原提呈細胞內(nèi)表達,激活以后可將MyD88通路啟動,對IRAKs家族招募并結(jié)合TRAF6,將NF-κB活化[13].NF-κB是Rel家族轉(zhuǎn)錄因子,一般指p65和p50所構(gòu)成異源二聚體,在靜息時結(jié)合抑制蛋白IkB存在細胞質(zhì)內(nèi),在外界刺激后和IkB解離并進入到細胞核中,進而釋放MCP-1、TNF-α及IL-1β等促炎細胞因子.另外,TLR4還能夠經(jīng)過TRIF路徑將IRF3激活,行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將炎癥反應(yīng)啟動[14].本文研究顯示,實驗組巨噬細胞LR4、TLR2 mRNA及蛋白表達較對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明PF對H.pylori感染的治療,有巨噬細胞的參與,且這一抗炎作用可能和TLR2/4通路有關(guān).

HSP70為熱休克蛋白家族內(nèi)主要成員之一,其分子量約為70 kD.正常細胞內(nèi)HSP70水平比較低,但在應(yīng)激情況其含量會顯著提升.對于機體胃腸道來講,H.pylori感染為長期慢性應(yīng)激,一般會造成胃黏膜內(nèi)HSP70高表達.通常HSP70多位于胞漿中,若受到熱休克刺激細胞核內(nèi)HSP70含量會快速升高,僅有少量存在于胞漿內(nèi),細胞在恢復(fù)階段時細胞核中HSP70則會消失,而胞漿內(nèi)依然有低水平的HSP70表達,對細胞內(nèi)HSP70細胞檢測可反映其胃炎進展情況[15].實驗組小鼠巨噬細胞HSP70 mRNA及蛋白表達較對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明PF可調(diào)控巨噬細胞分泌HSP70,降低H.pylori對胃黏膜刺激作用.

4 結(jié)論

綜上所述,芍藥苷經(jīng)過調(diào)節(jié)巨噬細胞活性起到抗H.pylori感染作用,可抑制巨噬細胞分泌炎癥因子與HSP70應(yīng)激因子,其抗炎作用可能和抑制巨噬細胞TLR2/4信號通路有關(guān).

文章亮點

實驗背景

中國有的地區(qū)感染幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的人群高達90%,容易引起胃癌、消化性潰瘍、慢性活動性胃炎及黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等胃部疾病.西藥治療效果顯著,但是易反復(fù),且長期服用副作用明顯.

實驗動機

目前,H.pylori感染治療藥物主要是四聯(lián)療法.相當一部分人并不適合其中的抗生素治療,因此療效欠佳.芍藥苷治療H.pylori,作為中成藥,不僅副作用下,而且適用于更廣泛的人群.

實驗?zāi)繕?/p>

芍藥苷的重要特性在治療H.pylori中發(fā)揮了不錯的療效,但是具體發(fā)揮作用的機制并不清楚,本研究從巨噬細胞的調(diào)控入手,分析芍藥苷抗H.pylori的作用及相關(guān)機制.

實驗方法

通過小鼠動物模型,采用Western Blot和熒光定量PCR的方法對巨噬細胞相關(guān)的免疫指標進行檢測,觀察H.pylori的數(shù)量,分析相關(guān)信號通路的相互影響,判斷芍藥苷對H.pylori的影響.

實驗結(jié)果

與對照組相比,經(jīng)過芍藥苷處理的小鼠的單核細胞趨化蛋白1、白介素1β、腫瘤壞死因子含量、巨噬細胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、Toll樣受體4(toll-like receptor-4,TLR4)、Toll樣受體2(toll-like receptor-2,TLR2)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)mRNA及蛋白表達均較低.

實驗結(jié)論

芍藥苷通過調(diào)節(jié)巨噬細胞分泌炎癥因子、HSP70應(yīng)激因子以及TLR2/4信號通路,調(diào)節(jié)巨噬細胞活性,對H.pylori的感染起到積極的治療作用.

展望前景

本研究從巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)了芍藥苷對H.pylori殺滅的機理,但是是否還有其他相關(guān)作用機制還需進一步研究.