正交試驗法優(yōu)選液體發(fā)酵云芝糖肽提取工藝條件

摘 要：基于正交試驗法優(yōu)化了液體發(fā)酵云芝糖肽的水提醇沉提取工藝。通過提取時間、料液比、提取溫度與提取次數(shù)等單因素分析，建立了4因素3水平正交試驗方案，確定了液體發(fā)酵云芝糖肽的最佳水提醇沉提取工藝為提取時間120 min、料液比150 g·L-1、提取溫度95 ℃、提取次數(shù)3次，在此條件下，云芝糖肽得率為4.2%。此工藝可為功效成分云芝糖肽的工業(yè)化提供參考。

關(guān)鍵詞：液體發(fā)酵；正交試驗；云芝糖肽；提取

Optimization of Extraction Conditions of Polysaccharopeptide from Coriolus versicolor by Liquid Fermentation by Orthogonal Test

LI Yan

（Guangdong Lingnan Vocational and Technical College， Guangzhou 510663， China）

Abstract： Based on the orthogonal test， the extraction process of liquid fermentation Coriolus versicolor glycopeptides by water extraction and alcohol precipitation was optimized. Through single factor analysis such as extraction time， solid-liquid ratio， ， extraction temperature and extraction times， a four-factor and three-level orthogonal test scheme was established， and the optimum extraction process for liquid fermentation of Coriolus versicolor glycopeptides was determined as follows： extraction time 120 min， solid-liquid ratio 150 g·L-1， extraction temperature 95 ℃， extraction times 3 times. Under this condition， the yield of Coriolus versicolor glycopeptides was 4.2%. This process can provide reference for the industrialization of the effective ingredient Coriolus versicolor glycopeptide.

Keywords： liquid fermentation; orthogonal test; Coriolus versicolor glycopeptide; extract

云芝糖肽（Posaverptidum）是從多孔菌科（Polyporaceae）云芝屬（Polystictus）真菌云芝（Coriolus versicolor L.ex.Fr.）（菌株Cov-1）的菌絲體中提取的高分子糖肽聚合物[1-3]，具有補益精氣、健脾養(yǎng)心的功效，對細胞免疫功能和血象有一定的保護作用，可用于食管癌、胃癌及原發(fā)性肺癌患者放療、化療所致的氣陰兩虛，已開發(fā)為中成藥[4-6]。

目前，云芝糖肽通常采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，因為液體發(fā)酵具有高效生產(chǎn)、萃取工藝簡便、萃取成本低等特點[7-9]。已報道的云芝糖肽的提取方法有水提法、水提醇沉法、酶制劑提取法、超聲提取法和微波提取法等，其中水提醇沉法因操作簡便且安全而被廣泛使用[10]。為提高液體發(fā)酵云芝糖肽的提取率，本文以云芝糖肽含量為指標，采用單因素和正交試驗法對液體發(fā)酵的云芝進行水提醇沉工藝優(yōu)化，采用苯酚-硫酸法進行云芝糖肽含量的測定，從而篩選出高提取率的提取方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

云芝菌種由本實驗室保存，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速150 r·min-1，溫度28 ℃，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，培養(yǎng)96 h。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖30 g、玉米粉15 g、豆餅粉20 g、麩皮7.5 g、磷酸二氫鉀3 g、蛋白胨1 g、硫酸鎂0.2 g，用水定容至1 L，滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與試劑

BSA224S型電子天平，賽多利斯上海貿(mào)易有限公司；CARY 300Conc型紫外可見分光光度計，美國Varina 公司；BSI-3型恒溫培養(yǎng)搖床，上海貝茵生物科技有限公司；FSSJG型高壓滅菌鍋，歐業(yè)食品工業(yè)裝備（諸城）有限公司；PHSJ-3F型pH計，上海精密科學儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、蒽酮、硫酸和乙醇，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 水提醇沉法提取云芝糖肽單因素試驗

將云芝置于三角瓶中，以云芝糖肽提取率為指標，按照一定料液比加入蒸餾水，經(jīng)一定溫度水浴提取一定時間后，趁熱抽濾至澄清，濾液濃縮后加入4倍體積無水乙醇，于4 ℃靜置過夜，3 000 r·min-1離心30 min，沉淀即為云芝糖肽。

1.4.2 正交試驗法優(yōu)化云芝糖肽提取工藝

選取提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取次數(shù)（D）為考察因素，以云芝糖肽提取率為指標進行優(yōu)化設計，選用L9（34）正交試驗設計表，正交試驗設計因素水平見表1。

1.4.3 云芝糖肽含量的測定

參考李巖等[5]的方法采用苯酚-硫酸法進行云芝糖肽含量的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同提取時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min和180 min）對云芝糖肽提取率的影響。由表2可知，隨著提取時間的延長，云芝糖肽提取率逐漸升高，當提取時間超過120 min后，云芝糖肽提取率逐漸趨于平衡穩(wěn)定，不再提高。故水提醇沉法提取云芝糖肽的時間選擇120 min。

2.1.2 料液比對云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同料液比（10 g·L-1、20 g·L-1、30 g·L-1、50 g·L-1、100 g·L-1和150 g·L-1）對云芝糖肽提取率的影響。由表3可知，隨著料液比的增加，云芝糖肽提取率逐漸升高，當料液比≥100 g·L-1時，云芝糖肽提取率逐漸趨于平衡穩(wěn)定，若繼續(xù)增大料液比，對后續(xù)提取工序增加難度。故水提醇沉法提取云芝糖肽的料液比選擇100 g·L-1。

2.1.3 提取溫度對云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同提取溫度（45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃和95 ℃）對云芝糖肽提取率的影響。由表4可知，隨著提取溫度的增加，云芝糖肽提取率逐漸升高，當提取溫度超過85 ℃時，云芝糖肽提取率下降。故選擇85 ℃作為最適提取溫度。

2.1.4 提取次數(shù)對云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同提取次數(shù)（1次、2次、3次和4次）對云芝糖肽提取率的影響。由表5可知，隨著提取次數(shù)的增加，云芝糖肽提取率逐漸升高，當提取次數(shù)超過2次時，云芝糖肽提取率增長情況逐漸趨于平衡，故提取次數(shù)選擇2次。

2.2 正交試驗法優(yōu)化云芝糖肽提取工藝

根據(jù)上述單因素試驗的結(jié)果，并綜合考慮各因素經(jīng)濟成本和效益，以云芝糖肽提取率為試驗指標，采用L9（34）正交試驗設計，分別考察提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取次數(shù)（D）對云芝糖肽提取率的影響，優(yōu)化水提醇沉法工藝參數(shù)，具體結(jié)果見表6。由表6可知，根據(jù)極差R值對云芝糖肽提取率的影響排序為提取時間＞料液比＞提取溫度＞提取次數(shù)；云芝糖肽的最佳水提醇沉法工藝為A2B3C3D3，即提取時間120 min、液料比150 g·L-1、提取溫度95 ℃、提取次數(shù)3次。由表7可知，提取時間對水提醇沉法提取云芝糖肽的提取率有顯著影響（P＜0.05），而料液比、提取溫度和提取次數(shù)對其無顯著性影響（P＞0.05）；在最優(yōu)提取條件下，云芝糖肽得率為4.2%，此工藝可為功效活性成分云芝糖肽的工業(yè)化提取及應用提供技術(shù)參考。

3 結(jié)論

本文以云芝糖肽提取率為指標，并采用正交試驗法對液體發(fā)酵的云芝進行水提醇沉工藝優(yōu)化，采用苯酚-硫酸法進行云芝糖肽含量的測定，從而篩選出高提取率的提取方法。結(jié)果顯示，水提醇沉法提取云芝糖肽工藝中，提取時間對云芝糖肽提取率具有顯著影響（P＜0.05），而料液比、提取溫度和提取次數(shù)對其無顯著性影響（P＞0.05）；液體發(fā)酵云芝糖肽的最佳水提醇沉提取工藝為提取時間120 min、液料比150 g·L-1、提取溫度95 ℃、提取次數(shù)3次，在此條件下，云芝糖肽得率為4.2%，此工藝為功效成分云芝糖肽的工業(yè)化提供參考。

參考文獻

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