16S rDNA鑒定泡椒鳳爪中的腐敗菌

孫玉俠 黃國保

摘 要：泡椒鳳爪是我國西南泡椒肉系列工業(yè)化產(chǎn)品中的代表性產(chǎn)品。本文采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)結(jié)合16S rDNA分子生物學(xué)方法，鑒定引起泡椒鳳爪脹袋變質(zhì)的微生物。結(jié)果顯示，引起腐敗的主要是葡萄球菌、芽孢桿菌、假單胞菌。本文根據(jù)特定腐敗菌的生物學(xué)特性，提出了相關(guān)建議，以期延長泡椒鳳爪的貨架期。

關(guān)鍵詞：泡椒鳳爪；16S rDNA；腐敗菌；鑒定

Special Spoilage Organism of Chicken Feet with Pickle Pepper by 16S rDNA

SUN Yuxia1， HUANG Guobao2

（1.Chengdu Agricultural College， Chengdu 611100， China;

2.Guangxi Key Lab of Agricultural Resources Chemistry and Biotechnology， Yulin 537000， China）

Abstract： Chicken Feet with Pickled Pepper is a representative product of the series of industrialized products of pickled pepper meat in Southwest China. In this paper， the traditional isolation and culture combined with 16S rDNA molecular biology method was used to identify the microorganisms that cause the bag swelling and deterioration of pickled pepper chicken feet. The results showed that Staphylococcus， Bacillus and Pseudomonas were the main causes of corruption. According to the biological characteristics of specific spoilage bacteria， this paper puts forward relevant suggestions to prolong the shelf life of pickled pepper chicken feet.

Keywords： Chicken Feet with Pickle Pepper; 16S rDNA; spoilage organism; identication

雞爪富含膠原蛋白，營養(yǎng)價(jià)值較高，20世紀(jì)70年代以前主要作為禽肉制品烹飪的下腳料，1978年后，我國開始進(jìn)口西方國家肥厚、型大、價(jià)廉的雞爪，西南地區(qū)勞動(dòng)人民以其食物的新鮮麻辣特色為出發(fā)點(diǎn)，創(chuàng)造性地將雞爪與泡椒結(jié)合到一起，制作出具有鮮辣脆嫩風(fēng)味的泡椒鳳爪。

16S rDNA分子生物學(xué)方法主要通過對(duì)微生物染色體上菌種之間差異性特異序列之間的比對(duì)鑒別微生物種屬，靈敏度高，是鑒定微生物常用的分子生物學(xué)方法。本文選取脹袋變質(zhì)樣品與合格樣品進(jìn)行對(duì)照，分離培養(yǎng)純化兩組樣品中的微生物，根據(jù)傳統(tǒng)細(xì)菌菌體菌落形態(tài)，并結(jié)合16S rDNA法鑒定泡椒鳳爪腐敗微生物，分析引起脹袋的特定腐敗菌，從而為加工過程中微生物污染的靶向精準(zhǔn)控制提供科學(xué)依據(jù)，延長產(chǎn)品貨架期。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

泡椒鳳爪樣品由重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院提供。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、EMB瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、CN選擇性瓊脂培養(yǎng)基、MYP瓊脂培養(yǎng)基、Barid-Parker瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根（北京）生化科技有限公司；Mix Ex Taq 寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物的合成以及DNA序列的測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；其余試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腐敗菌的分離純化

在無菌操作條件下，分別從合格樣品和變質(zhì)樣品中選取雞爪、泡椒和汁液共25 g，用無菌剪刀剪碎雞爪，加入225 mL無菌生理鹽水，振蕩1 min，然后取1 mL上清液進(jìn)行梯度稀釋，選擇10-1、10-2、10-3 3個(gè)稀釋度，涂布于不同的選擇性培養(yǎng)基上，合格樣品記為A，變質(zhì)樣品記為B，培養(yǎng)條件見表1。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。從不同選擇性培養(yǎng)基的平板上，挑取各種典型生長的菌落，隨后在其各自培養(yǎng)基上劃線分離2～3次，得到純化的單個(gè)菌落。

1.2.2 觀察菌落特征和菌體形態(tài)

菌落特征：觀察菌落表面呈現(xiàn)出的形狀（褶皺、崎嶇、平滑）、菌落表面形態(tài)（干燥、濕潤）、菌落大小、邊緣形狀（缺刻狀、光滑、波狀、樹枝狀）、菌落顏色。

菌體形態(tài)：觀察芽孢位置（中間、極端）、芽孢是否膨大、芽孢形狀（桿狀、橢圓、球狀）。

1.2.3 DNA的提取與純化

挑取各純化單菌落于營養(yǎng)肉湯中搖床過夜培養(yǎng)，吸取細(xì)菌培養(yǎng)液2 mL，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒要求操作。

1.2.4 16SrDNA的PCR擴(kuò)增

選用細(xì)菌通用引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'[1]。先用20 μL體系進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，設(shè)置52 ℃、53 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃[2]梯度變性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像檢測，觀察目標(biāo)條帶大小，并確定合適PCR反應(yīng)條件，最后選取50 μL體系，即Mix Ex Taq（25 μL）、上游引物（1.25 μL）、下游引物（1.25 μL）、模板（1.25 μL）、重蒸水（21.25 μL）進(jìn)行PCR反應(yīng)，割膠回收并純化，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。對(duì)照實(shí)驗(yàn)，DNA模版替換為重蒸水。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡椒鳳爪腐敗菌的菌落特征和菌體形態(tài)

經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察各種菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并結(jié)合各腐敗菌在瓊脂固體培養(yǎng)基上的菌落特征進(jìn)行判斷，結(jié)果見表2。表2中A為合格樣品，B為變質(zhì)樣品，A1～A4為合格樣品分離檢出的菌株；B1～B10為變質(zhì)樣品分離檢出的菌株。

如表2所示，有4種微生物在兩種樣品中均有檢出，根據(jù)微生物形態(tài)分析可知，兩種樣品均有乳酸菌生長，因?yàn)榕萁辐P爪的pH值偏酸性，pH值為4.5～5.0，且泡椒鳳爪中的泡椒為乳酸菌發(fā)酵，乳酸菌是正常的有益菌，可抑制腐敗菌的生長[3]。B組樣品為脹袋變質(zhì)泡椒鳳爪，初步判斷引起腐敗的為葡萄球菌、假單胞菌、芽孢桿菌，至于樣品在腐敗變質(zhì)的過程中微生物區(qū)系的變化和優(yōu)勢(shì)腐敗菌的腐敗機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)退火溫度設(shè)置為56 ℃較適宜，PCR擴(kuò)增16S rDNA基因片段的凝膠成像圖，測序結(jié)果也表明，PCR實(shí)驗(yàn)所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為實(shí)驗(yàn)?zāi)康木?6S rDNA基因片段。測序結(jié)果見表3。

PCR測序結(jié)果與細(xì)菌形態(tài)學(xué)表現(xiàn)基本一致，其中A1、B1魏斯氏菌屬，是兼性厭氧菌或微需氧菌，常見于泡菜中，也是國外香腸制品的發(fā)酵菌之一[4-5]，在正常泡椒鳳爪和腐敗樣品中均存在，可能是泡椒的發(fā)酵菌。

Staphylococcus pasteuri和Staphylococcus cohnii、Staphylococcus sp.都屬于葡萄球菌科，Staphylococcus pasteuri兼性厭氧，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，無法引起泡椒鳳爪漲袋變質(zhì)；Staphylococcus cohnii被醫(yī)學(xué)研究中心證明抗藥性較高，在我國廣西及湖北部分鴨養(yǎng)殖場有發(fā)現(xiàn)，但其無毒力因子基因檢出，目前還未有雞養(yǎng)殖場報(bào)道，但雞鴨有一些相似的生活特性，因此推測其可能來源于雞養(yǎng)殖場；健康禽類的皮膚、羽毛、腸道等都有Staphylococcus sp.存在，它是家禽孵化、飼養(yǎng)、加工環(huán)境中的常見微生物。

Bacillus subillis常見于飼料中，可改善雞腸道菌群，促進(jìn)吸收；Bacillus amyloliquefaciens在肉雞中可用來改善腸道免疫功能，具有抗氧化的作用；Bacillus licheniformis可降解重金屬，有效提高肉雞的生長性能、免疫力和抗氧化能力。Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus licheniformis可能都是來源于雞飼料殘留。

Pseudomonas sp.在自然界分布廣泛，主要分布在潮濕環(huán)境中。泡椒鳳爪產(chǎn)品有鳳爪、泡椒、泡椒液，適宜Pseudomonas sp.生長。Pseudomonas aeruginosa是一種條件致病菌，在4℃不生長，可采用4 ℃冷藏泡椒鳳爪，來抑制其生長繁殖；Pseudomonas alcaliqenes，適宜溫度35 ℃，可能來源于水源污染。

變質(zhì)樣品比合格樣品多出的微生物可能是導(dǎo)致泡椒鳳爪變質(zhì)的腐敗菌，但由于未接種合格樣品且未進(jìn)行腐敗機(jī)制研究，先不排除，結(jié)合上文及表3來看，引起泡椒鳳爪腐敗變質(zhì)可能是Staphylococcus cohnii、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas alcaliqenes、Pseudomonas aeruginosa。建議加強(qiáng)雞爪采購源頭治理，加強(qiáng)加工過程管理，采用4 ℃冷鏈儲(chǔ)藏銷售，減少微生物污染。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過傳統(tǒng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)和16SrDNA檢測泡椒鳳爪中腐敗菌10種，引起泡椒鳳爪變質(zhì)可能有Staphylococcus cohnii、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas alcaliqenes、Pseudomonas aeruginosa。腐敗菌變變質(zhì)機(jī)制、變質(zhì)途徑等有待進(jìn)一步研究分析。

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作者簡介：孫玉俠（1986—），女，安徽淮南人，碩士，工程師。研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量檢測。