響應(yīng)面法優(yōu)化醬渣中大豆異黃酮超聲輔助乙醇提取工藝

唐銀 朱梓瑞 許樹(shù)榮 何貴萍 李碩 呂遠(yuǎn)平

摘要：以醬渣為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化醬渣中大豆異黃酮的超聲輔助乙醇提取工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探究乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率對(duì)大豆異黃酮提取率的影響，并利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，在乙醇濃度54.6%、提取溫度49.7 ℃、提取時(shí)間127.9 min、超聲功率436.7 W條件下提取率最高，為0.711%。簡(jiǎn)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到大豆異黃酮的提取率為0.708%，與理論值基本吻合，模型可靠。該研究為醬渣的綜合利用及大豆異黃酮的提取提供了理論參考。

關(guān)鍵詞：醬渣；大豆異黃酮；響應(yīng)面法；超聲提取

中圖分類號(hào)：TS201.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）04-0115-05

Abstract： With sauce residue as the raw material， response surface methodology is used to optimize the ultrasonic-assisted ethanol extraction process of soy isoflavones from sauce residue. Based on the single factor test， the effects of ethanol concentration， extraction temperature， extraction time and ultrasonic power on the extraction rate of soy isoflavones are studied. The Box-Behnken response surface method is used to optimize the extraction process. The results show that the extraction rate is the highest of 0.711% when the ethanol concentration is 54.6%， the extraction temperature is 49.7 ℃， the extraction time is 127.9 min， and the ultrasonic power is 436.7 W. Simplifying the conditions for verification test， and the results show that the extraction rate of soy isoflavones is 0.708%， which is close to the theoretical value， indicating that the model is reliable. The study has provided theoretical references for the comprehensive utilization of sauce residue and the extraction of soy isoflavones.

Key words： sauce residue; soy isoflavones; response surface methodology; ultrasonic extraction

大豆異黃酮是一類主要存在于大豆及其豆制品中的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1—2]。大豆異黃酮因具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等作用[3—4]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和食品等行業(yè)[5]。

醬渣是醬油釀造的副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1噸醬油將產(chǎn)生0.67 噸醬渣[6]。醬渣水分含量較高，在空氣中極易腐敗變質(zhì)，若不妥善處理將造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。醬渣中含有豐富的蛋白質(zhì)、油脂、粗纖維及大豆異黃酮等[7]，具有較高的利用價(jià)值；而醬渣中較高的鹽含量制約了其深加工利用的發(fā)展[8]。目前將醬渣用于制備動(dòng)物飼料和肥料的工藝附加值低，且存在適口性差或易導(dǎo)致土壤鹽化等問(wèn)題[9-10]。因此，進(jìn)行大豆異黃酮的提取是醬渣高值化利用的一個(gè)重要方向[11]。

大豆異黃酮的提取方法主要有微波提取法、溶劑萃取提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取提取法等[12]。微波提取法和超臨界流體萃取提取法具有不利于純化或提取成本過(guò)高的缺點(diǎn)[13—14]。傳統(tǒng)溶劑提取法雖然提取成本比較低，但提取率不高。超聲波提取法是利用超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈的攪拌等作用，使原料中的大豆異黃酮進(jìn)入溶劑中，能夠提高大豆異黃酮的提取率[15]。因此，本文將結(jié)合超聲波與溶劑萃取提取技術(shù)提取大豆異黃酮，并應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化提取條件，以尋找一種成本低廉、提取率高且具有較高經(jīng)濟(jì)效益的提取方法，為醬渣的綜合利用及大豆異黃酮的提取提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬渣：四川合江縣永興誠(chéng)釀造有限責(zé)任公司；染料木素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海同田生物技術(shù)有限公司；石油醚、無(wú)水乙醇等：均為國(guó)產(chǎn)分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-6000PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；H1850高速臺(tái)式離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SMF01磨粉機(jī) 浙江紹興蘇泊爾用品有限公司；SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 醬渣的預(yù)處理

將新鮮醬渣置于60 ℃烘箱中干燥，烘干后用粉碎機(jī)粉碎得到干醬渣樣品；取適量干醬渣，按照料液比1∶10用石油醚浸泡24 h，過(guò)濾除去石油醚并烘干得到脫脂醬渣。

1.3.2 大豆異黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取脫脂醬渣1 g于100 mL具塞錐形瓶中，以料液比1∶50加入60%乙醇溶液并攪拌均勻，設(shè)置溫度50 ℃、超聲功率420 W，在此條件下提取120 min，提取結(jié)束后將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，于6 000 r/min條件下離心20 min，離心所得上清液即為大豆異黃酮粗提液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取5 mg染料木素標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，以95%乙醇溶液定容，再以95%乙醇溶液為空白對(duì)照，在259 nm處測(cè)定吸光度。分別以染料木素含量（μg/mL）和吸光度為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。染料木素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度具有較好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.118 2x+0.116 3，R2=0.999 5。

1.3.4 樣品檢測(cè)及提取率計(jì)算

取200 μL“1.3.2”中所得的粗提液于10 mL容量瓶中，以95%乙醇溶液定容，再以95%乙醇溶液為空白對(duì)照，在259 nm處測(cè)定吸光度，并按下式計(jì)算醬渣中大豆異黃酮的提取率。

w=c×n×Vm×1 000×100%。

式中：w為醬渣中大豆異黃酮提取率，%；c為測(cè)試液中大豆異黃酮濃度，μg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按“1.3.2”中方法對(duì)醬渣中大豆異黃酮進(jìn)行提取。選擇乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率5個(gè)因素，考察各個(gè)因素對(duì)醬渣中大豆異黃酮提取率的影響。

1.3.5.1 乙醇濃度對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

在料液比為1∶50的條件下，設(shè)置提取溫度50 ℃、超聲功率300 W、提取時(shí)間60 min，分別選擇乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行試驗(yàn)，并計(jì)算提取率。

1.3.5.2 料液比對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

在乙醇濃度為60%的條件下，設(shè)置提取溫度50 ℃、提取時(shí)間60 min、超聲功率300 W，分別選擇料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70進(jìn)行試驗(yàn)，并計(jì)算提取率。

1.3.5.3 提取溫度對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

在乙醇濃度為60%的條件下，設(shè)置料液比1∶50、提取時(shí)間60 min、超聲功率300 W，分別選擇提取溫度為40，45，50，55，60 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，并計(jì)算提取率。

1.3.5.4 提取時(shí)間對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

在乙醇濃度為60%的條件下，設(shè)置料液比1∶50、提取溫度50 ℃、超聲功率300 W，分別選擇提取時(shí)間為30，60，90，120，150，180 min進(jìn)行試驗(yàn)，并計(jì)算提取率。

1.3.5.5 超聲功率對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度60%、料液比1∶50、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間60 min，分別選擇超聲功率為240，300，360，420，480，540，600 W進(jìn)行試驗(yàn)，并計(jì)算提取率。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率4個(gè)因素，利用Design Expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方法見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆異黃酮提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度較低時(shí)，大豆異黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增大而增大；而當(dāng)乙醇濃度超過(guò)60%后，大豆異黃酮的提取率降低。根據(jù)相似相溶原理，乙醇濃度的增大使溶液的極性與大豆異黃酮的極性逐漸接近，大豆異黃酮更容易溶出，提取率增大；而當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)、糖類等大分子聚集，使物料質(zhì)構(gòu)緊密，阻礙了大豆異黃酮的溶出[16]，故合適的乙醇濃度為60%左右。

2.1.2 料液比的影響

由圖3可知，大豆異黃酮的提取率隨著液料比的增大而增大，但在料液比達(dá)到1∶50后，大豆異黃酮的提取率增大不明顯。當(dāng)料液比較小時(shí)，高濃度的溶液影響了大豆異黃酮分子溶出，導(dǎo)致提取率較低；隨著料液比的增大，溶液濃度降低，大豆異黃酮分子擴(kuò)散速度加快，提取率增大；當(dāng)料液比達(dá)到1∶50時(shí)，大豆異黃酮的提取接近飽和，因此提取率不再隨料液比的增大而增大[17]。考慮到提取成本以及操作難度，固定料液比為1∶50。

2.1.3 提取溫度的影響

由圖4可知，大豆異黃酮的提取率隨著提取溫度的升高先增大后減小，并在溫度為50 ℃時(shí)最高。溫度的提高加快了分子運(yùn)動(dòng)，使異黃酮加快溶出，提取率增大；但過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致醬渣中蛋白質(zhì)等變性凝固，物料質(zhì)構(gòu)變得質(zhì)密堅(jiān)實(shí)，阻礙了大豆異黃酮溶出，使提取率下降[18]。因此，控制提取溫度為50 ℃左右。

2.1.4 提取時(shí)間的影響

由圖5可知，隨著提取時(shí)間的增加，大豆異黃酮的提取率總體呈上升趨勢(shì)；但當(dāng)提取時(shí)間大于120 min時(shí)，大豆異黃酮的提取率開(kāi)始下降?？赡苁且?yàn)殡S著提取的進(jìn)行，大豆異黃酮逐漸進(jìn)入溶液中，提取率逐漸提升；但當(dāng)提取時(shí)間太長(zhǎng)時(shí)，大豆異黃酮可能發(fā)生了降解，導(dǎo)致提取率降低[19]。本試驗(yàn)合適的提取時(shí)間為120 min左右。

2.1.5 超聲功率的影響

由圖6可知，當(dāng)超聲功率小于420 W時(shí)，大豆異黃酮的提取率隨著超聲功率的增大而提升；當(dāng)超聲功率大于420 W時(shí)，大豆異黃酮的提取率明顯減小。可能是因?yàn)殡S著超聲功率的增大，超聲波產(chǎn)生的機(jī)械作用增強(qiáng)，使醬渣中大豆異黃酮分子振動(dòng)加快，大豆異黃酮分子更易溶出；當(dāng)超聲功率過(guò)大時(shí)，超聲空化作用所產(chǎn)生的空化泡半徑變小，空化泡爆裂所產(chǎn)生的能量減小，大豆異黃酮分子的振動(dòng)減弱，導(dǎo)致其溶出效率降低，使提取率下降[20]。因此，適宜的超聲功率為420 W左右。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以A（乙醇濃度）、B（提取溫度）、C（提取時(shí)間）、D（超聲功率）為變量，以醬渣中大豆異黃酮的提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Design Expert 10軟件提供設(shè)計(jì)的組合進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 響應(yīng)面模型分析

響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出醬渣中大豆異黃酮提取率的回歸方程，提取率=0.69-0.039A+0.028B+0.016C+0.020D+3.25×10-3AB+6.25×10-3AC+0.013AD-0.011BC-0.016BD-0.018CD-0.035A2-0.045B2-0.024C2-0.017D2。

由表3可知，本試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜<0.01，回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)的P=0.485 6，表明該模型可用于分析和預(yù)測(cè)超聲輔助乙醇提取醬渣中大豆異黃酮的提取率。

模型中乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間及超聲功率的P值均小于0.01，表明這4個(gè)因素對(duì)醬渣中大豆異黃酮提取率的影響都顯著。各因素的F值分別為280.60，149.30，46.96，75.72，可知各因素對(duì)醬渣中大豆異黃酮提取率的影響程度由高到低為A（乙醇濃度）>B（提取溫度）>D（超聲功率）>C（提取時(shí)間）。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

由軟件根據(jù)回歸方程得到響應(yīng)面與等高線，通過(guò)等高線的形狀可以看出兩因素交互對(duì)大豆異黃酮提取率的影響強(qiáng)弱，等高線為圓形則影響弱，等高線為橢圓則影響強(qiáng)。

乙醇濃度與提取溫度、乙醇濃度與提取時(shí)間的兩兩交互作用不強(qiáng)，對(duì)大豆異黃酮提取率的影響不顯著（P>0.05），響應(yīng)面圖與等高線圖不做展示；提取溫度與提取時(shí)間兩兩交互作用強(qiáng)，對(duì)大豆異黃酮提取率的影響顯著（P<0.05），乙醇濃度與超聲功率、提取溫度與超聲功率、提取時(shí)間與超聲功率兩兩交互作用極強(qiáng)，對(duì)大豆異黃酮提取率的影響極顯著（P<0.01），見(jiàn)圖7～圖10。

2.2.4 最佳工藝確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)軟件分析，醬渣中大豆異黃酮提取的最優(yōu)條件為乙醇濃度54.6%、提取溫度49.7 ℃、提取時(shí)間127.9 min、超聲功率436.7 W，在此條件下，大豆異黃酮的理論提取率為0.711%。考慮到試驗(yàn)條件，根據(jù)實(shí)際情況，選擇乙醇濃度55%、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間130 min、超聲功率420 W進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到大豆異黃酮提取率平均值為0.708%，與理論值接近，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)與實(shí)際較為吻合，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的大豆異黃酮提取工藝具有一定理論參考價(jià)值。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以大豆異黃酮提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化醬渣中大豆異黃酮的提取工藝。結(jié)果表明，最佳提取條件為乙醇濃度54.6%、提取溫度49.7 ℃、提取時(shí)間127.9 min、超聲功率436.7 W，將此條件優(yōu)化后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得到大豆異黃酮的提取率為0.708%，與理論值0.711%接近。該研究結(jié)果可以為醬渣的綜合利用提供理論參考，為大豆異黃酮的提取提供理論技術(shù)指導(dǎo)。

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