丹貝醬的抗氧化活性及風(fēng)味成分分析

李夢(mèng)茹 楊文清 李西西 李佳瑩 趙雪如 付瑋琦 李風(fēng)娟

摘要：丹貝是一種以大豆為原料經(jīng)根霉等發(fā)酵而制得的產(chǎn)品，文章采用后發(fā)酵工藝對(duì)鮮丹貝進(jìn)行進(jìn)一步加工得到衍生產(chǎn)品丹貝醬，考察了丹貝醬在后發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)、抗氧化能力、總酚含量、總黃酮含量和游離氨基含量的變化。結(jié)果表明，丹貝經(jīng)后發(fā)酵72 h后所得丹貝醬樣品水提物呈現(xiàn)良好的抗氧化活性，DPPH、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力分別為1.526，1.609，0.983 mg TE/g DW，總酚及總黃酮含量分別為1.811 mg GAE/g DW和0.113 mg CE/g DW；風(fēng)味成分分析發(fā)現(xiàn)，后發(fā)酵72 h丹貝醬樣品中1-辛烯-3-酮、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、壬醛和2-正戊基呋喃的氣味活性值（OAV）較高，可被視為主要香氣成分，將為具有良好功能活性及感官品質(zhì)的丹貝醬及其他丹貝衍生產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎(chǔ)理論參考。

關(guān)鍵詞：后發(fā)酵；丹貝醬；抗氧化能力；酚類物質(zhì)；風(fēng)味

中圖分類號(hào)：TS264.24? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）04-0015-05

Abstract： Tempeh is is a product made from soybeans through the fermentation by Rhizopus. In this paper， the fresh tempeh is further processed by post fermentation to obtain the derivative product tempeh paste. The changes of flavor components， antioxidant capacity， the content of total phenols， total flavonoids and free amino groups of tempeh paste during post fermentation are investigated. The results show that the water extract of tempeh paste obtained after post fermentation for 72 h shows good antioxidant activity， with DPPH， ABTS radicals scavenging capacity and Fe3+ reducing capacity of 1.526， 1.609， 0.983 mg TE/g DW respectively. The content of total phenols and total flavonoids is 1.811 mg GAE/g DW and 0.113 mg CE/g DW respectively. Through the analysis of flavor components， it is found that 1-octene-3-ketone， 3-octanone， 1-octene-3-alcohol， nonanal and 2-n-pentylfuran in tempeh paste samples after post fermentation for 72 h have higher odor activity values （OAV）， which could be regarded as the main flavor components， would provide basic theoretical references for the development of tempeh paste and other tempeh derivative products with good functional activities and sensory quality.

Key words： post fermentation; tempeh paste; antioxidant capacity; phenolic substances; flavor

丹貝（tempeh）是一種以大豆為原料，經(jīng)少孢根霉、米根霉等微生物發(fā)酵而成的大豆發(fā)酵制品，起始于印度尼西亞。與大豆相比，丹貝中氨基酸種類、大豆異黃酮苷元、煙酸、核黃素和維生素B12等生物活性成分均有所提高[1-2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，丹貝具有抗菌、抗氧化等生理調(diào)節(jié)功能[3-4]。丹貝在日本、歐洲、北美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)已日趨流行，對(duì)其衍生產(chǎn)品的研究也日益受到關(guān)注。

后發(fā)酵是發(fā)酵食品加工的一個(gè)重要工藝流程，指經(jīng)過前發(fā)酵處理，物料在一定的溫度、時(shí)間等條件下，由微生物和酶的共同作用，對(duì)發(fā)酵基質(zhì)中的大分子物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分解，發(fā)生新的生化反應(yīng)，從而有助于產(chǎn)品獨(dú)特風(fēng)味、質(zhì)地和組織狀態(tài)的形成，比如豆瓣醬、腐乳、酸奶等發(fā)酵食品在加工時(shí)所經(jīng)歷的后熟過程[5]。有報(bào)道指出，豆豉的后發(fā)酵過程是改變其外觀狀態(tài)、形成獨(dú)特風(fēng)味、增強(qiáng)生物活性、提高營養(yǎng)成分的關(guān)鍵工藝[6]；豆瓣在后熟過程中通過添加一定比例的水、辣椒和食鹽后，在微生物和酶的作用下形成其特有的風(fēng)味[5]；茶經(jīng)過后發(fā)酵處理，茶中的刺激物質(zhì)減少，滋味醇厚甘甜，茶性平和，這為開發(fā)丹貝衍生產(chǎn)品提供了新的思路。

本研究對(duì)鮮丹貝進(jìn)行后發(fā)酵處理制得丹貝醬產(chǎn)品，考察了丹貝醬在后發(fā)酵過程中抗氧化能力、總黃酮、總酚和游離氨基等的變化，并對(duì)其風(fēng)味成分進(jìn)行了分析，旨在為丹貝醬的研發(fā)提供理論指導(dǎo)，并促進(jìn)丹貝衍生產(chǎn)品的開發(fā)及大豆發(fā)酵食品的進(jìn)一步發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

去皮大豆：購于濰坊市天下糧倉食品有限公司；少孢根霉（Rhizopus oligosporus）：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

1.2.1 主要試劑

2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde， OPA）、沒食子酸（GA）、兒茶素（C）、Folin-Ciocalteu試劑：購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2.2 主要儀器

Model 1680酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

通過浸泡大豆、蒸煮、調(diào)酸、降溫、接種（孢子懸浮液濃度7.36×106 CFU/mL）、裝袋（扎孔）、前發(fā)酵（42 h）制作丹貝。將發(fā)酵好的丹貝切成小塊，加鹽水調(diào)制混勻（丹貝醬終產(chǎn)品含鹽量為4%），放于滅菌的玻璃罐中，將玻璃罐密封后放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，后發(fā)酵24，48，72 h后分別取樣。

1.3.2 樣品水提物的制備

稱取凍干后打粉的0.5 g丹貝醬粉末樣品與5 mL蒸餾水于10 mL離心管中混合，振蕩2 min，超聲5 min，30 ℃搖床1 h，然后于3 800 r/min離心15 min，用注射器吸取上清液后過0.45 μm濾膜得到樣液，樣品濃度標(biāo)記為100 mg/mL。

1.3.3 抗氧化活性的測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照Brand-Williams等[7]的方法。取5 μL濃度為25 mg/mL的樣液和195 μL濃度為0.079 mg/mL的DPPH反應(yīng)液混合并于暗處反應(yīng)30 min，測定517 nm波長下的吸光值，計(jì)算清除率，用Trolox為標(biāo)準(zhǔn)，將樣品結(jié)果表示為Trolox的毫克數(shù)（mg TE/g DW）。

1.3.3.2 ABTS自由基清除能力的測定

參照高一芳等[8]的方法。取5 μL濃度為25 mg/mL的樣液和200 μL的ABTS反應(yīng)液混合反應(yīng)30 min，測定732 nm波長下的吸光值，計(jì)算清除率，樣品結(jié)果表示為Trolox的毫克數(shù)（mg TE/g DW）。

1.3.3.3 FRAP還原能力的測定

參照高一芳等[8]的方法。取10 μL濃度為50 mg/mL的樣液和145 μL的TPTZ反應(yīng)液混合后于37 ℃反應(yīng)10 min，測定593 nm波長處的吸光值，樣品結(jié)果表示為Trolox的毫克當(dāng)量數(shù)（mg TE/g DW）。

1.3.4 總黃酮含量的測定

采用硝酸鋁顯色法，取30 μL濃度為50 mg/mL的樣液依次加入132 μL蒸餾水、9 μL 5% NaNO2溶液混合反應(yīng)6 min后，再加入9 μL 10% AlCl3·6H2O溶液，放置5 min，再加入120 μL NaOH溶液混合反應(yīng)，測定510 nm波長處的吸光值，將樣品結(jié)果表示為兒茶素的毫克數(shù)（mg CE/g DW）。

1.3.5 總酚含量的測定

取100 μL濃度為25 mg/mL的樣液依次加入80 μL福林酚、80 μL 10% Na2CO3溶液混合反應(yīng)，37 ℃放置1 h，測定750 nm波長處的吸光值，將樣品結(jié)果表示為沒食子酸的毫克數(shù)（mg GAE/g DW）。

1.3.6 游離氨基的測定

OPA反應(yīng)液的配制參考丁一[1]的方法，現(xiàn)配現(xiàn)用。取10 μL濃度為5 mg/mL的樣液，加入200 μL OPA反應(yīng)液混合，暗反應(yīng)2 min，以蒸餾水為對(duì)照，測定340 nm波長處的吸光值。以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)，樣品游離氨基含量表示為g/100 g。

1.3.7 頂空固相微萃取及氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）檢測

將萃取頭（75 μm CAR/PDMS）于250 ℃的進(jìn)樣口進(jìn)行老化30 min的預(yù)處理。稱取4 g丹貝醬樣品于微萃取瓶中，加1 μL稀釋的2-甲基-3-庚酮，擰好封蓋，將磁力攪拌器調(diào)至60 ℃預(yù)熱10 min，萃取頭在60 ℃頂空吸附30 min。

程序設(shè)置：初溫40 ℃，持續(xù)3 min；終溫250 ℃，持續(xù)6 min，運(yùn)行總時(shí)間50 min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃，載氣為He，流速為1 mL/min。電離方式為電子轟擊（EI）離子源，電離電壓70 eV，接口溫度220 ℃，離子源溫度200 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～500 amu。

1.3.8 風(fēng)味物質(zhì)的定性、定量標(biāo)準(zhǔn)

1.3.8.1 定性標(biāo)準(zhǔn)

第一，通過NIST 11譜庫分析，將檢測到的風(fēng)味物質(zhì)與NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)比匹配，初步篩選風(fēng)味物質(zhì)；第二，根據(jù)風(fēng)味物質(zhì)在DB-WAX色譜柱上的線性保留指數(shù)（retention index，RI）計(jì)算獲得。

1.3.8.2 定量標(biāo)準(zhǔn)

采用面積歸一化法計(jì)算待測樣品風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量，并用內(nèi)標(biāo)法（內(nèi)標(biāo)為2-甲基-3-庚酮）精確定量丹貝中的風(fēng)味物質(zhì)。

1.3.9 氣味活性值

目前結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的閾值及其在體系中的濃度，是精確衡量其對(duì)食品貢獻(xiàn)大小的方法，即氣味活性值（odor activity value，OAV）。通常OAV≥1表示其對(duì)風(fēng)味具有貢獻(xiàn)作用。風(fēng)味物質(zhì)的閾值通過已發(fā)表的書籍查詢。

1.3.10 統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3次。使用Origin 2019b繪制圖形，使用SPSS Statistics 26進(jìn)行方差分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 后發(fā)酵過程中丹貝醬的抗氧化活性

丹貝醬后發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化見圖1。

后發(fā)酵72 h丹貝醬樣品水提物的DPPH、ABTS自由基清除能力及Fe3+還原能力分別為1.526，1.609，0.983 mg TE/g DW，為樣品最高含量，隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長，其DPPH、ABTS自由基清除能力和Fe3+還原能力均呈先降低后升高的趨勢。

丹貝中抗氧化物質(zhì)主要是酚酸類、黃酮類、小分子肽、多糖和氨基酸類物質(zhì)[9-12]。在后發(fā)酵過程中，丹貝醬中氨基酸可能與還原糖發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生具有清除自由基能力的蛋白黑素類物質(zhì)[13-14]，而丹貝醬抗氧化能力的變化可能是由于后發(fā)酵過程中丹貝醬中的酶活或蛋白酶水解程度改變，從而改變小分子肽的形成，因而對(duì)不同后發(fā)酵時(shí)間的丹貝醬樣品的抗氧化能力產(chǎn)生影響。

2.2 后發(fā)酵過程中丹貝醬的總黃酮、總酚含量

丹貝醬后發(fā)酵過程中總黃酮和總酚的含量變化見圖2。

后發(fā)酵48 h丹貝醬樣品水提物中總黃酮含量為0.147 mg CE/g DW，但隨著后發(fā)酵過程的進(jìn)行，總黃酮含量略有下降；丹貝醬樣品水提物中總酚含量隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長呈上升趨勢，后發(fā)酵72 h樣品的總酚含量為1.811 mg GAE/g DW，為樣品最高含量。酚類化合物通常以糖苷的形式和糖（主要是葡萄糖）結(jié)合，在后發(fā)酵過程中，β-葡萄糖苷酶、蛋白酶等由微生物分解代謝產(chǎn)生的水解酶物質(zhì)可促進(jìn)酚類游離態(tài)產(chǎn)物的形成，如葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮的糖苷鍵，釋放出游離異黃酮苷元[15－16]，從而增加總黃酮含量，β-葡萄糖苷酶亦可催化丹貝底物釋放可提取的游離酚類化合物[17]，從而使總酚含量上升。

2.3 后發(fā)酵過程中丹貝醬的游離氨基含量

丹貝醬后發(fā)酵過程中游離氨基含量的變化見圖3。

隨著后發(fā)酵過程的繼續(xù)，丹貝醬樣品水提物中的游離氨基含量呈上升趨勢，后發(fā)酵72 h樣品中游離氨基含量最高，為0.231 g/100 g。在后發(fā)酵過程中，少孢根霉繼續(xù)增殖，蛋白酶活升高，其次，食鹽的添加使少孢根霉處于低氧環(huán)境，這為其發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)分泌蛋白酶創(chuàng)造了條件，進(jìn)一步促使蛋白質(zhì)被分解為多肽及小分子氨基酸，使得游離氨基含量逐漸升高[18]。

2.4 后發(fā)酵過程中丹貝醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

2.4.1 主要揮發(fā)性物質(zhì)OPLS-DA和差異物質(zhì)分析

通過正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）后發(fā)酵丹貝醬中的主要揮發(fā)性物質(zhì)，由圖4中a可知，丹貝醬每個(gè)組平行之間沒有較大差異。

由圖4中b可知，丹貝醬中的主要風(fēng)味差異物質(zhì)有11種，分別為1-辛烯-3-酮、正辛醛、乙醇、3-辛酮、2-正戊基呋喃、1-辛烯-3-醇、3-甲基-3-丁烯、1-石竹烯、2-乙基己醇、2，3-丁二醇、壬醛。丹貝醬中戊醛、己醛、正辛醛、2-正戊基呋喃和1-辛烯-3-醇等風(fēng)味物質(zhì)可能由亞油酸降解產(chǎn)生[19-20]；2，3-丁二醇可能與美拉德反應(yīng)或者氨基酸的生物合成有關(guān)[21-22]；2-庚酮、1-辛烯-3-酮可能由微生物脂肪酶和氫過氧化物酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化產(chǎn)生。

2.4.2 OAV分析

通過精確查找所檢測出的風(fēng)味物質(zhì)的閾值，結(jié)合GC-MS的物質(zhì)含量結(jié)果，計(jì)算出各物質(zhì)的氣味活性值。當(dāng)OAV≥1時(shí)，認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)食品的風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)，故對(duì)后發(fā)酵丹貝醬樣品的OAV進(jìn)行進(jìn)一步研究，將有助于挖掘后發(fā)酵丹貝醬中的關(guān)鍵香氣成分。丹貝醬后發(fā)酵過程中氣味活性值熱圖見圖5。

丹貝醬后發(fā)酵過程中，后發(fā)酵24 h時(shí)樣品中OAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)有22種，其中1-辛烯-3-酮、3-辛酮（有果實(shí)香味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇的清香）的OAV較高；后發(fā)酵48 h時(shí)樣品中OAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)有11種，其中1-辛烯-3-酮、正辛醛、1-辛烯-3-醇的OAV較高；后發(fā)酵72 h時(shí)樣品中OAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)有20種，其中1-辛烯-3-酮、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、壬醛（具有玫瑰、柑橘等香氣）的OAV較高，這些香氣成分對(duì)丹貝醬制品的風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

鮮丹貝經(jīng)后發(fā)酵工藝處理后所得丹貝醬呈現(xiàn)良好的抗氧化活性，其中后發(fā)酵72 h時(shí)丹貝醬樣品水提物的DPPH、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力及總酚、游離氨基含量最高，且檢測到OAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)有20種，1-辛烯-3-酮、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、壬醛和2-正戊基呋喃對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味產(chǎn)生有重要影響。后續(xù)研究將進(jìn)一步考察后發(fā)酵過程中含鹽量、溫度等工藝參數(shù)對(duì)樣品功能品質(zhì)、活性物質(zhì)及風(fēng)味成分生成的影響，為深入開發(fā)丹貝衍生品、推動(dòng)大豆發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供更豐富的理論支撐。

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