廣西酸筍微生物多樣性分析及其乳酸菌的特性研究

鐘源 張雅雯 呂健曼 陳美霖 馬華威 郭愛(ài)玲 唐丹萍

摘要：為開(kāi)發(fā)廣西酸筍的純種發(fā)酵工藝，需要篩選出具有較強(qiáng)亞硝酸鹽降解能力以及高產(chǎn)GABA（γ-氨基丁酸）能力的乳酸菌。該研究首先對(duì)廣西柳州不同廠家的酸筍進(jìn)行微生物多樣性分析，結(jié)果表明乳桿菌屬（Lactobacillus sp.）為廣西酸筍中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬。對(duì)篩選出的乳酸菌特性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示菌株R9和R25降解亞硝酸鹽的能力最強(qiáng)，降解率分別可達(dá)到（99.92±0.13）%和（99.03±0.66）%；菌株R22產(chǎn)生的GABA含量最高，為（71.77±3.35） μg/mL。對(duì)菌株L29、R9、R19、R22、R25進(jìn)行耐受性研究，結(jié)果表明菌株R9、R19、R25對(duì)NaCl濃度≤7%、膽鹽濃度≤0.7%、pH 3.5和pH 4有較強(qiáng)的耐受性，因此選擇乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）R9、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）R19和R25作為后續(xù)酸筍純種發(fā)酵試驗(yàn)菌株。

關(guān)鍵詞：酸筍；乳酸菌；微生物多樣性；亞硝酸鹽；GABA

中圖分類(lèi)號(hào)：TS255.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）05-0001-09

Abstract： In order to develop the pure breed fermentation process of Guangxi sour bamboo shoots， it is necessary to screen lactic acid bacteria with strong nitrite degradation ability and high GABA （γ-aminobutyric acid） production ability. In this study， the microbial diversity of sour bamboo shoots from different factories in Liuzhou， Guangxi is analyzed firstly， and the results show that Lactobacillus sp. is the main dominant genus of Guangxi sour bamboo shoots. The characteristics of the selected lactic acid bacteria are studied， the results show that strains R9 and R25 have the strongest ability to degrade nitrite， and the degradation rates could reach （99.92±0.13）% and （99.03±0.66）% respectively. Strain R22 produces the highest content of GABA， which is （71.77±3.35） μg/mL. The tolerance of strains L29， R9， R19， R22 and R25 is studied， and the results show that strains R9， R19 and R25 have strong torlerance to NaCl concentration≤7%， bile salt concentration≤0.7%， pH 3.5 and pH 4. Therefore， Pediococcus acidilactici R9， Lactobacillus plantarum R19 and R25 are selected as the subsequent pure breed fermentation experimental strains of sour bamboo shoots.

Key words： sour bamboo shoot; lactic acid bacteria; microbial diversity; nitrite; GABA

收稿日期：2022-11-20

基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（2262019PY067）

作者簡(jiǎn)介：鐘源（1996－），男，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：唐丹萍（1977－），女，高級(jí)畜牧師，研究方向：畜牧水產(chǎn)品加工。

新鮮竹筍中水分含量高[1]，氨基酸含量豐富[2]，但保藏期短，易腐爛，因此將其制成發(fā)酵酸筍，既能延長(zhǎng)保藏期，又能使其風(fēng)味更加獨(dú)特?，F(xiàn)行的廣西酸筍傳統(tǒng)發(fā)酵方法多是以麻竹筍或甜筍為原料，將其切成絲狀或片狀后，加入井水或山泉水，在密封厭氧條件下利用原料自身的微生物發(fā)酵而成[3-4]。然而酸筍自然發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群復(fù)雜多變，發(fā)酵周期長(zhǎng)[5]，且存在亞硝酸鹽超標(biāo)等問(wèn)題[6]，因此將酸筍發(fā)酵方式由自然發(fā)酵向純種發(fā)酵轉(zhuǎn)變成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

研究人工純種發(fā)酵方法，需要對(duì)自然發(fā)酵酸筍中的微生物菌群進(jìn)行分析，并從中篩選出具有特定功能的菌株來(lái)進(jìn)行發(fā)酵研究。利用Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，能夠較為全面地對(duì)樣品中的微生物菌群進(jìn)行分析，谷曉東等[7]對(duì)6種黃酒酒曲進(jìn)行微生物多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在黃酒酒曲中有多種真菌及細(xì)菌共同作用；劉麗宅等[8]對(duì)延邊傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果表明泡菜中有3種細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬和4種真菌優(yōu)勢(shì)菌屬。因此，本研究同樣選擇高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)自然發(fā)酵酸筍進(jìn)行菌群多樣性研究。

本研究的目的是篩選出可用于純種發(fā)酵的菌株，從而降低酸筍在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽，增加益生物質(zhì)GABA，提高酸筍的食用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，本文將同時(shí)選取具有較強(qiáng)亞硝酸鹽降解能力和高產(chǎn)GABA能力的乳酸菌菌株，并對(duì)其耐受性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

酸筍：選自廣西省柳州市3家不同工廠生產(chǎn)的自然發(fā)酵酸筍。

1.2 試劑

MRS瓊脂/肉湯培養(yǎng)基、MC瓊脂培養(yǎng)基、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂/肉湯培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖：基因科技（上海）股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker Ⅲ、6×Loading Buffer：北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；GoldenView核酸染料：北京艾德萊生物科技有限公司；引物27f、引物1492r：生工生物工程（上海）股份有限公司；FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、γ-氨基丁酸標(biāo)品：上海源葉生物科技有限公司；重蒸酚、革蘭氏染色試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；碳酸鈣、過(guò)氧化氫、氯化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、四硼酸鈉、次氯酸鈉、正丁醇、無(wú)水乙醇、冰醋酸、鹽酸、豬膽鹽、乳酸：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

D247LE-32超凈工作臺(tái) 利安捷CHNT公司；JE502電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；QL-901渦旋振蕩器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；13395H2X光學(xué)顯微鏡 徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司；5415-R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；HH-2恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；超微量分光光度計(jì) 聯(lián)想生物科技有限公司；XP基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；藍(lán)光切膠儀 莫納生物科技有限公司；隔膜真空泵 天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；721G可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 酸筍微生物多樣性分析

將3種酸筍樣品分別混勻，每種酸筍取兩個(gè)樣品，分別編號(hào)為SS11、SS12、SS21、SS22、SS31、SS32，按照固液比1∶1的比例將樣品裝入無(wú)菌帶蓋離心管中，在－80 ℃冰箱中冷凍后破碎離心。將樣品進(jìn)行DNA提取及高通量測(cè)序。

1.4.2 乳酸菌的分離純化

將酸筍發(fā)酵液用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)『线m稀釋度的樣品液分別涂布于MC瓊脂培養(yǎng)基和含有1.5% CaCO2的MRS瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。挑選在兩種培養(yǎng)基上有溶鈣圈的單菌落在MRS平板上進(jìn)行劃線，直至分離純化。純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，將菌株在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液保存在40%的甘油管中，置于－80 ℃冰箱中保藏備用。

1.4.3 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

挑選1.4.2中呈革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶呈陰性且在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的菌株，用FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit試劑盒提取各個(gè)菌株DNA，用Nanophotometer N60微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。以提取的DNA為模板，選取細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物27f、1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492r（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)32次；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。

1.4.4 乳酸菌的溶血性研究

將1.4.2中初篩的菌株接種到10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，將菌液在血瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

1.4.5 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力研究

取凍存菌液100 μL活化兩代，活化后的菌液按照2%（體積比）接種量接種到含100 mg/L NaNO2的MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)24 h后測(cè)定培養(yǎng)液中NaNO2的含量，以同體積蒸餾水代替離心上清液作零管調(diào)零。NaNO2測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法參照GB 5009.33－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的鹽酸萘乙二胺法。亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為亞硝酸鹽含量，縱坐標(biāo)為538 nm處的吸光度值，回歸方程為y=0.015x+0.001 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，擬合度較高，可用于后續(xù)測(cè)定。亞硝酸鹽降解率計(jì)算公式為：

M=C1-C2C1×100%。

式中：M為亞硝酸鹽降解率（%）；C1為MRS肉湯培養(yǎng)基中初始NaNO2的質(zhì)量濃度（mg/L）；C2為MRS肉湯培養(yǎng)基中殘余NaNO2的質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.4.6 乳酸菌產(chǎn)GABA能力研究

1.4.6.1 乳酸菌產(chǎn)GABA的定性分析

取凍存菌液100 μL活化兩代，將活化后的菌液按2%（體積比）接種到含有10 g/L MSG的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液置于高速冷凍離心機(jī)中，在4 ℃，9 800×g下離心10 min，取上清液，用薄層色譜層析法（TLC）初篩。采用正丁醇∶冰醋酸∶超純水（4∶1∶1）作為展開(kāi)劑[9]，待展開(kāi)結(jié)束后使用三角噴瓶在層析板上覆蓋0.5%茚三酮-乙醇溶液，在85 ℃下烘干15 min直至溶劑完全揮發(fā)，條帶顯現(xiàn)。以GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照，觀察樣品條帶是否有與標(biāo)準(zhǔn)溶液比移動(dòng)值（Rf）相同的斑點(diǎn)。

1.4.6.2 乳酸菌產(chǎn)GABA的定量分析

根據(jù)肖君榮[10]的方法，稍作修改。取培養(yǎng)24 h的菌液離心上清液600 μL，加入0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖液2 mL和800 μL 6%（體積比）的重蒸酚溶液混勻，再加入10%次氯酸鈉溶液900 μL，振蕩混勻，將溶液置于沸水中水浴10 min，然后冰浴20 min至溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色，加入4 mL 60%乙醇溶液振蕩均勻。靜置后于645 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以同體積蒸餾水代替離心上清液作零管調(diào)零。

GABA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線以 GABA 濃度為橫坐標(biāo)，645 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)，得線性方程 y=0.345 1x－0.006 1，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 7，適用于GABA含量的測(cè)定。

1.4.7 菌株耐受性研究

1.4.7.1 菌株耐受NaCl研究

將待測(cè)菌株活化后重懸，按照梯度稀釋?zhuān){(diào)整菌液濃度至1×109 CFU/mL。將上述菌懸液按照2%接種量分別加入到含有0%、1%、3%、5%、7%、9%、11% NaCl的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，分別于0 h和24 h取樣測(cè)定OD600nm值。

1.4.7.2 菌株耐酸研究

將待測(cè)菌株菌懸液按照2%接種量分別加入到pH 為 4，3.5，3，2.5的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)20 h，分別于0，2，4，6，8 h取樣測(cè)定OD600nm值，并于20 h取樣，涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長(zhǎng)狀況。

1.4.7.3 菌株耐受膽鹽研究

將待測(cè)菌株菌懸液按照2%接種量分別加入到含有0.1%、0.3%、0.5%、0.7%豬膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)20 h，分別于0，2，4，6，8 h取樣測(cè)定OD600nm值，并于20 h取樣，涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長(zhǎng)狀況。

1.4.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究使用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸筍中微生物多樣性分析

2.1.1 OTU聚類(lèi)和稀釋曲線分析

OTU即分類(lèi)操作單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元（品系、種、屬、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。通過(guò)對(duì)6組酸筍樣品的16S rDNA進(jìn)行高通量測(cè)序，將得到的原始序列進(jìn)行高質(zhì)量序列拼接、過(guò)濾長(zhǎng)度和嵌合體后，共獲得471 920條有效序列，使用Usearch軟件[11]對(duì)Reads在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)，獲得OTU。各組樣品OTU個(gè)數(shù)見(jiàn)表1，其中SS2組酸筍樣品的OTU數(shù)目多于SS1組和SS3組，為353和357。

樣品稀釋曲線見(jiàn)圖1。

由圖1可知，當(dāng)樣本序列在0～10 000之間時(shí)，除SS11組樣品外，其余組OTU數(shù)目均呈指數(shù)性增長(zhǎng)，在樣本序列為10 000～70 000之間時(shí)，OTU數(shù)目增長(zhǎng)趨勢(shì)平穩(wěn)，表明測(cè)序已趨于飽和，當(dāng)前測(cè)序結(jié)果足以反映樣本中的微生物多樣性。

2.1.2 不同酸筍微生物的Alpha多樣性分析

ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)反映細(xì)菌群落豐度，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)則用于比較群落多樣性。不同樣品微生物多樣性指數(shù)見(jiàn)表2。

由表2可知，樣品的ACE指數(shù)在286.56～365.99之間，Chao1指數(shù)在273.46～380.27之間，Simpson指數(shù)在0.46～0.83之間，Shannon指數(shù)在2.00～4.23之間，覆蓋率范圍為99.92%～99.98%。其中SS21和SS22的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)相對(duì)較高，表明該組細(xì)菌群落豐度更高，SS12的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)更高，表明該組群落結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。試驗(yàn)樣品的覆蓋率較高，表明此次測(cè)序結(jié)果基本可以代表樣品的實(shí)際情況。

隨著測(cè)序量的增加，發(fā)現(xiàn)的物種增多，但是Shannon曲線卻趨于平穩(wěn)，說(shuō)明直到物種飽和后，增加抽樣條數(shù)也并不能發(fā)現(xiàn)新的特征，見(jiàn)圖2。

2.1.3 不同酸筍微生物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

酸筍樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

由圖3中A可知，在門(mén)水平上共檢測(cè)出10種豐度較高的細(xì)菌門(mén)類(lèi)，分別為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria），其中SS1組和SS2組的厚壁菌門(mén)含量最多，分別為84.05%和48.42%，其次為藍(lán)細(xì)菌門(mén)，占樣品序列的25.31%；SS3組的藍(lán)細(xì)菌門(mén)含量最多，占68.59%，其次為厚壁菌門(mén)，占比25.31%。由此可初步判斷不同酸筍之間微生物群落在門(mén)水平上也各不相同，但主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為厚壁菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)。

由圖3中B可知，在屬水平上，SS1組的第一優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus sp.），占樣品序列的77.09%，第二優(yōu)勢(shì)菌屬為未培養(yǎng)葉綠體細(xì)菌屬（Uncultured_Bacterium_o_Chloroplast sp.），占比為10.49%；SS2組和SS3組的第一優(yōu)勢(shì)菌屬均為未培養(yǎng)葉綠體細(xì)菌屬，占比分別為45.86%和68.59%，第二優(yōu)勢(shì)菌屬則為乳桿菌屬，占比分別為41.88%和18.61%。據(jù)報(bào)道，發(fā)酵蔬菜中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬、乳球菌屬（Lactococcus sp.）、魏斯氏菌屬（Weissella sp.）[12-13]和明串珠菌屬（Leuconostoc sp.），此次測(cè)序發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌屬與報(bào)道有重合部分。

2.2 乳酸菌的分離純化

從廣西柳州市3種不同的自然發(fā)酵酸筍中分離得到40株菌，將部分篩選出的菌株在MRS及MC平板上劃線，菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢形態(tài)見(jiàn)圖4。

由圖4中A和B可知，菌株為呈白色半透明的圓形菌落，表面光滑微凸。

由表3可知，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步培養(yǎng)，初步鑒定40株菌株為乳酸菌，均為革蘭氏陽(yáng)性菌，其中R9為球菌，其余均為桿菌，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)均為陰性。

2.3 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)分離初篩得到的40株菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，部分菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，菌株在約1 500 bp處均有明亮清晰條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 乳酸菌的溶血試驗(yàn)

為了后續(xù)研究的進(jìn)行，需要對(duì)菌株進(jìn)行生物安全性評(píng)估。菌株在血平板上的溶血性見(jiàn)圖6。

由圖6可知，試驗(yàn)菌株在血平板上菌落周?chē)闯霈F(xiàn)透明圈和綠色溶血圈，說(shuō)明沒(méi)有引起溶血現(xiàn)象，即均為γ-溶血，可以進(jìn)行下一步的研究以及在后續(xù)酸筍發(fā)酵試驗(yàn)中應(yīng)用。

2.5 菌株降解亞硝酸鹽能力研究

亞硝酸鹽是一種潛在致癌物質(zhì)，當(dāng)人體攝入過(guò)量時(shí)，在酸性條件下，亞硝酸鹽與生物胺結(jié)合生成亞硝胺，亞硝胺具有強(qiáng)致癌性[14-15]，會(huì)誘發(fā)人體各個(gè)器官部位的癌變，如胃癌、腸癌、肝癌等[16-17]。亞硝酸鹽在發(fā)酵蔬菜中的檢出屢有報(bào)道，因此本文對(duì)篩選出的乳酸菌24 h降解亞硝酸鹽能力進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，菌株R9的降解率最高，達(dá)到了（99.92±0.13）%，其次為R25，達(dá)到了（99.03±0.66）%。所以選取R9和R25菌株進(jìn)行后續(xù)的耐受性試驗(yàn)。

2.6 菌株產(chǎn)GABA能力研究

GABA（γ-氨基丁酸）是一種由谷氨酸脫羧酶（GAD）產(chǎn)生的四碳自由氨基酸，廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物中，是目前食品領(lǐng)域重點(diǎn)研究的生物活性成分[18-19]。研究表明，GABA具有改善糖尿病[20]、降血壓[21]、改善腎功能[22]及提高免疫力[23]等功效。利用乳酸菌增加酸筍中GABA的含量，提高酸筍營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可以使酸筍產(chǎn)品更受大眾喜愛(ài)，從而提高酸筍產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。首先對(duì)菌株產(chǎn)GABA能力進(jìn)行定性分析，經(jīng)過(guò)薄層色譜法篩選后，有10株出現(xiàn)符合GABA標(biāo)準(zhǔn)品的紅點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖7中A。通過(guò)比色法對(duì)乳酸菌產(chǎn)生的GABA進(jìn)行定量分析，結(jié)果見(jiàn)圖7中B。由圖7中B可知，菌株R22產(chǎn)生的GABA含量最高，為（71.77±3.35） μg/mL，其次為R25、R19和L29，分別為（61.14±2.90），（54.38±3.35），（49.55±2.90） μg/mL。因此選取L29、R19、R22、R25以及亞硝酸鹽降解能力較強(qiáng)的R9 5株菌株進(jìn)行后續(xù)的耐受性試驗(yàn)。

2.7 菌株耐受性研究

2.7.1 菌株耐NaCl研究

現(xiàn)今的廣西酸筍以無(wú)鹽發(fā)酵為主，為了后續(xù)調(diào)味型酸筍的研究，滿足更多人群的需求，需要對(duì)所篩選菌株進(jìn)行NaCl耐受性研究。5株菌株在含不同濃度NaCl的MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖8。

由圖8可知，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度在3%以下時(shí)，所有菌株均可以生長(zhǎng)；當(dāng)濃度達(dá)到5%時(shí)，菌株R9、R19和R25的耐受性較好，菌株L29和R22的生長(zhǎng)受到抑制；當(dāng)濃度達(dá)到7%時(shí)，菌株L29和R22已基本不生長(zhǎng)；當(dāng)濃度為9%時(shí)，菌株R9的OD600 nm仍有0.347，說(shuō)明此時(shí)菌株R9仍具有一定的耐受性；而當(dāng)濃度達(dá)到11%時(shí)，所有菌株幾乎都不生長(zhǎng)。由此可知，菌株R19和R25對(duì)NaCl濃度在7%以下，菌株R9對(duì)NaCl濃度在9%以下時(shí)均具有一定的耐受性。

2.7.2 菌株的耐膽鹽研究

膽鹽（bile salt）是由肝細(xì)胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合而成的鈉鹽或鉀鹽，在小腸中的濃度約為0.3%。膽鹽對(duì)細(xì)菌有一定的抑制作用，會(huì)降低乳酸菌在腸道中的存活力[24]，因此需要對(duì)篩選出的5株菌株進(jìn)行膽鹽耐受性研究。5株菌株對(duì)不同濃度膽鹽的耐受性見(jiàn)圖9。

由圖9中A可知，5株菌株培養(yǎng)4 h后生長(zhǎng)曲線均有上升，說(shuō)明在0.1%膽鹽濃度下各菌株均有一定的耐受性，L29稍差；由圖9中B～D可知，膽鹽濃度越大，菌株的8 h存活率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)下降的趨勢(shì)越明顯。由圖9中E可知，5株菌株在0.1%膽鹽濃度下培養(yǎng)20 h后涂布于平板上均可生長(zhǎng)，L29的生長(zhǎng)狀況較差，說(shuō)明其膽鹽耐受性較弱；當(dāng)膽鹽濃度在0.3%～0.7%時(shí)，L29在平板上已不生長(zhǎng)，其余4株菌株仍可以長(zhǎng)滿平板；而膽鹽濃度大于0.5%時(shí)，R9、R19和R25 3株菌的耐受性略有下降，但仍可存活生長(zhǎng)。由此可知，菌株R9、R19、R22和R25在膽鹽濃度為0.7%以下時(shí)均具有一定的耐受性。

2.7.3 菌株的耐酸研究

酸筍在發(fā)酵過(guò)程中，由于微生物的作用，pH值會(huì)逐漸降低，酸性環(huán)境對(duì)細(xì)菌也有一定的抑制作用，因此需要對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行耐酸研究。

由圖10中A～D可知，5株菌株在2 h內(nèi)的生長(zhǎng)曲線下降緩慢，并且部分菌株有升高的現(xiàn)象，說(shuō)明菌株在2 h內(nèi)對(duì)酸性環(huán)境的耐受性較好；隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，由于乳酸菌的產(chǎn)酸特性，培養(yǎng)基的pH值可能進(jìn)一步降低，所以菌株在2 h后的生長(zhǎng)曲線呈下降趨勢(shì)。結(jié)合圖10中E可知，當(dāng)pH為4時(shí)，5株菌株在平板上均可生長(zhǎng)；當(dāng)pH為3.5時(shí)，R22已不再生長(zhǎng)，L29生長(zhǎng)受到抑制但仍具有一定耐受性，R9、R19和R25仍可長(zhǎng)滿平板，說(shuō)明這3株菌的耐受性較好；當(dāng)pH值在3.5以下時(shí)，所有菌株均不生長(zhǎng)。由此可知，菌株L29、R9、R19和R25對(duì)pH 3.5和pH 4均具有一定的耐受性。

綜上，根據(jù)菌株耐受性研究結(jié)果可知，菌株L29雖然可以耐受一定程度的酸性環(huán)境，但在較低濃度的NaCl和膽鹽中的生長(zhǎng)均受到抑制；菌株R22雖然可以耐受較高濃度的膽鹽，但是對(duì)低濃度NaCl和pH≤3.5的酸性環(huán)境耐受性較差；菌株R9、R19和R25在較高濃度的NaCl和膽鹽中仍具有較強(qiáng)的耐受性，并且在pH為3.5的酸性環(huán)境中仍可存活生長(zhǎng)，因此選取R9、R19、R25 3株菌進(jìn)行后續(xù)的純種發(fā)酵研究。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)廣西柳州不同廠家的酸筍進(jìn)行微生物多樣性分析，發(fā)現(xiàn)3家酸筍的菌群結(jié)構(gòu)雖各不相同，但主要優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus sp.）。對(duì)酸筍中的乳酸菌進(jìn)行分離純化，共篩選出40株具有乳酸菌特征的菌株，經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)鑒定，進(jìn)一步確定其所屬菌種。接著對(duì)初篩的40株乳酸菌的亞硝酸鹽降解能力及產(chǎn)GABA能力進(jìn)行研究，結(jié)果顯示菌株R9和R25降解亞硝酸鹽的能力最好，降解率分別可達(dá)到（99.92±0.13）%和（99.03±0.66）%；菌株R22產(chǎn)生的GABA含量最高，為（71.77±3.35） μg/mL，其次為R25、R19和L29，分別為（61.14±2.90），（54.38±3.35），（49.55±2.90） μg/mL。對(duì)上述5株菌株L29、R9、R19、R22、R25進(jìn)行耐受性研究，結(jié)果表明菌株R9、R19、R25對(duì)NaCl濃度≤7%、膽鹽濃度≤0.7%、pH 3.5和pH 4有較強(qiáng)的耐受性。選擇乳酸片球菌R9、植物乳桿菌R19和R25作為酸筍純種發(fā)酵菌株，在保留酸筍獨(dú)特風(fēng)味的基礎(chǔ)上，研究出低亞硝酸鹽且富含益生物質(zhì)GABA的產(chǎn)品，既可以提高酸筍的食用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又符合當(dāng)前大健康的時(shí)代理念。

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