補陽還五湯聯(lián)合電針療法對脊髓損傷大鼠運動功能恢復的研究

蘇文碩 樊光亞 肖連根 龐哲棟 董黎強 魏浩 安忠誠

[摘要] 目的 探究補陽還五湯聯(lián)合電針治療對脊髓損傷大鼠運動功能恢復的影響。方法 采用隨機數(shù)字表法，將40只SD大鼠分成假手術組（n=8）、模型組（n=8）、實驗1組（n=8）、實驗2組（n=8）和實驗3組（n=8）。造模成功后，實驗1組和實驗3組予補陽還五湯灌胃，1次/d；實驗2組和實驗3組電針治療，1次/d；假手術組和模型組大鼠給予與實驗1組和3組等量的生理鹽水灌胃治療；干預后1d、7d、14d和28d，每組隨機處死2只大鼠，作為4個亞組，采用大鼠脊髓損傷評分（Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale）評估每個亞組大鼠運動功能；采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠脊髓損傷后的脊髓組織形態(tài)。結(jié)果 假手術組大鼠評分無明顯變化，實驗1組、實驗2組、實驗3組7d、14d、28d的BBB評分整體高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 補陽還五湯聯(lián)合電針療法對脊髓損傷大鼠的運動功能恢復有促進作用。

[關鍵詞] 脊髓損傷；補陽還五湯；電針；大鼠

[中圖分類號] R683? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.02.014

[Abstract] Objective To explore the effect of Buyang Huanwu combined with electroacupuncture on motor function recovery in rats with spinal cord injury. Methods Forty SD rats were divided into sham-operated group （n=8）， model group （n=8）， test group 1 （n=8）， test group 2 （n=8） and test group 3 （n=8） using the random number table method. After successful modelling， the rats in test group 1 and test group 3 were treated by gavage with Buyang Huanwu decoction once a day， and the rats in test group 2 and test group 3 by electroacupuncture once a day. The rats in the sham-operated group and model group were treated by gavage with saline in the same amount as in test group 1 and test group 3. On the 1st， 7th， 14th， and 28th days after the intervention， 2 rats in each group were randomly sacrificed as subgroups， and the motor function of hindlimbs of each subgroup was evaluated by Basso， Beattie & Bresnahan locomotor rating （BBB） scale; hematoxylin-eosin staining was used to observe spinal cord tissue morphology after spinal cord injury in rats. Result There was no significant change in the scores of rats in the sham group. The BBB scale of test group 1，test group 2 and test group 3 were generally higher than those of the model group at the 7th， 14th， and 28th， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Buyang Huanwu decoction combined with electroacupuncture in the treatment of spinal cord injury rats can promote the recovery of hindlimb motor function after spinal cord injury in rats.

[Key words] Spinal cord injury; Buyang Huanwu decoction; Electroacupuncture; Rat

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是當今世界最具破壞性的疾病之一。研究顯示，在過去的30年里，SCI全球發(fā)病率增長迅速，全球每年有25萬～50萬人發(fā)生SCI[1]。此外，SCI后神經(jīng)系統(tǒng)的損傷不易恢復，患者需要終身治療且費用高昂，給患者及其家庭造成極大的經(jīng)濟負擔[2]。研究證實中藥補陽還五湯在治療SCI方面療效確切，脊髓硬膜外電刺激也被證實能夠有效促進SCI后運動功能的恢復[3]。因此本研究擬探討補陽還五湯結(jié)合電針治療SCI大鼠的療效以及對其運動功能恢復的影響。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

1.1.1? 實驗動物? 選取清潔級SD大鼠40只，采用隨機數(shù)字表法，分為假手術組（n=8）、模型組（n=8）、實驗1組（n=8）、實驗2組（n=8）、實驗3組（n=8），其中每個組內(nèi)又分為1d、7d、14d和28d共4個亞組，每個亞組2只。大鼠體質(zhì)量約250～300g，雌雄不限，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供，實驗動物合格證號：SYXK（浙）2021-0011。

1.1.2? 藥品與儀器? 補陽還五湯方劑組成：黃芪120g，川芎8g，當歸尾8g，紅花3g，赤芍5g，地龍3g，桃仁3g（購自浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中藥房，水煎至75ml制成相當于含生藥2g/ml的水煎劑）；自制Allens打擊器（1ml注射器和30g克氏針）石蠟包埋機（德國徠卡Arcadia H）；病理切片機（德國萊卡RM2255）；華佗牌電子針療儀（SDZ-ⅡB型）；華佗牌針灸針（0.35mm×13mm）。

1.2? 方法

1.2.1? 造模方法? 在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心適應性飼養(yǎng)1周后，對大鼠進行腹腔注射麻醉，頭部、四肢固定于鼠板上，常規(guī)備皮、消毒，定位T9～T11棘突，做1個3.0～4.0cm的縱形切口，依次切開皮膚、皮下筋膜，血管鉗鈍性剝離棘突兩側(cè)肌肉及棘間韌帶，暴露T9～T11棘突及椎板，小咬骨鉗咬除T10棘突及椎板，充分暴露T10段脊髓，將約1mm厚的塑料墊片放在硬脊膜表面，采用Allens自制打擊器，打擊沖量選擇75g·cm，打擊高度為2.5cm[4]，垂直打擊脊髓表面，撞擊后克氏針在脊髓表面停留5s，造模完畢。假手術組僅切除相同節(jié)段椎體的椎板，保持脊髓完整，模型組和各實驗組切除相同節(jié)段椎體椎板后同時對脊髓進行打擊。脊髓損傷造模成功的表現(xiàn)為打擊瞬間大鼠身體回縮撲動，尾巴痙攣性擺動，脊髓打擊表面水腫、淤血，硬脊膜保持完整。

1.2.3? 術后護理? 大鼠恒溫飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，每天定時換水和飼料；造模后每只SD大鼠肌肉注射青霉素8×104單位，1次/d，連續(xù)3d；人工擠壓膀胱輔助排尿，3次/d，直至大鼠恢復自主排尿功能。

1.2.4? 干預方法? ①實驗1組、實驗3組：將制備的含生藥2g/ml的補陽還五湯水煎劑，根據(jù)大鼠與人的體表面積換算，計算出大鼠的用藥劑量為3.5g/kg，按照1.75ml/kg的劑量灌胃，1次/d，持續(xù)4周。②實驗2組、實驗3組：將大鼠俯臥位固定后，選取T9和T11棘突旁兩對夾脊穴，采用規(guī)格為0.35mm× 13mm的針灸針，直刺兩對夾脊穴，深度4～5mm，針尖觸碰到椎板，電針儀連接同側(cè)的兩根針的尾端，設置刺激頻率為100Hz，電流強度為1mA，以刺激部位肌肉輕微抽動且不發(fā)生劇烈掙扎為適宜，1次/d，每次持續(xù)30min，連續(xù)刺激4周。③假手術組和模型組：予1.75ml/kg的生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)4周。

1.2.5? 標本采集? 各組大鼠分別在造模后1d、7d、14d、28d的時間點，麻醉后以T10節(jié)段為中心取長約2～3cm的目標脊髓，清洗干凈后置于4%多聚甲醛溶液中固定，待后續(xù)作蘇木精-伊紅（hematoxylin- eosin，HE）染色處理。

1.3? 觀察指標

1.3.1? 大鼠脊髓損傷（Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating，BBB）評分? 將大鼠后肢運動分為22個等級，0分為完全癱瘓，21分正常。造模前對每只大鼠進行BBB評分，造模后1d、7d、14d、28d對實驗大鼠進行評分。評分者為兩名熟悉BBB評分的非本課題組人員，觀察時間5min，結(jié)果取平均值。

1.3.2? HE染色? 各組大鼠分別在造模后第1天、7天、14天、28天的時間點，麻醉后以T10節(jié)段為中心取長約2～3cm的目標脊髓，經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗3次后，4%多聚甲醛溶液固定，制成石蠟標本，常規(guī)切片制成約4m厚的切片，HE染色，在顯微鏡下觀察脊髓組織橫斷面的形態(tài)。

1.4? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，各組不同時間點BBB評分采用重復測量方差分析，其余計量資料采用單因素方差分析，兩兩比較時采用方差分析LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1? BBB評分比較

造模后不同干預方法下，各組大鼠1d、7d、14d、28d時間點BBB評分比較，假手術組大鼠評分無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），實驗1組、實驗2組、實驗3組在術后7d、14d、28d的BBB評分整體高于模型組，且隨著術后時間進展評分逐漸上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2? HE染色結(jié)果比較

HE染色結(jié)果顯示，假手術組鏡下脊髓組織結(jié)構清楚完整，神經(jīng)元形態(tài)完整，胞核位于細胞中央，核仁明顯，胞體及樹突中可見大量尼氏體。模型組光鏡下可見脊髓組織被破壞，損傷處有大量紅細胞聚集，炎性細胞浸潤，膠質(zhì)瘢痕形成，有大量空泡出現(xiàn)，尼氏體數(shù)量減少。與模型組相比，實驗組鏡下脊髓組織結(jié)構較清晰，炎性細胞浸潤與紅細胞較模型組減少，神經(jīng)元數(shù)量增加，形態(tài)各異，中尼氏體數(shù)量增多，見圖1。

3? 討論

SCI會導致患者感覺、運動和自主神經(jīng)功能障礙，嚴重者可出現(xiàn)四肢癱瘓，甚至死亡。當前SCI的治療依然是世界難題，由于繼發(fā)性損傷是造成功能障礙的重要原因，所以目前治療SCI的策略主要是針對繼發(fā)性損傷，促進神經(jīng)元的再生，重建中斷的傳導通路，恢復損傷平面上下的傳導功能[5]。但是中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性較差，神經(jīng)元再生能力有限，脊髓損傷后的再生修復極其微弱，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的臨床治療措施可使損傷兩端軸突重新建立突觸聯(lián)系，完全恢復SCI后喪失的神經(jīng)功能，這也是治療SCI的困難所在。當前SCI主要依靠手術治療、藥物治療和康復訓練，對緩解繼發(fā)性脊髓損傷有一定效果，但長期療效并不樂觀。

補陽還五湯是中醫(yī)經(jīng)典方劑，由黃芪、赤芍、川芎、當歸尾、地龍、桃仁、紅花7味藥組成，諸藥合用，共奏補氣活血通絡之功。近年來諸多研究證實，補陽還五湯在治療SCI方面療效確切，其治療SCI的機制可能有以下幾個方面：①改善SCI后脊髓組織缺血狀態(tài)和炎癥反應[6-8]；②減少SCI后神經(jīng)細胞死亡[9-12]；③改善SCI后軸突再生的微環(huán)境[13-16]；④抑制SCI后膠質(zhì)瘢痕的形成[17-18]；⑤抑制SCI后脂質(zhì)過氧化反應[19]。但SCI的具體治療機制尚未研究透徹，有待進一步研究與發(fā)現(xiàn)。此外，隨著中醫(yī)藥事業(yè)的蓬勃發(fā)展，許多中醫(yī)方劑和單味中藥被證實用于治療脊髓損傷具有明顯療效[20-23]，為治療脊髓損傷提供了新的研究思路和方法。脊髓硬膜外電刺激也被證實能夠有效恢復SCI大鼠后肢的運動功能[3]，中醫(yī)夾脊電針在治療SCI方面也確有療效，薛玉滿等[24]通過對SCI大鼠使用夾脊電針干預，發(fā)現(xiàn)夾脊電針治療能夠有效恢復SCI大鼠的后肢運動功能，其機制可能是通過提高血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，促進血管內(nèi)皮生成，改善損傷組織的微環(huán)境。此外，也有研究證實，夾脊電針治療SCI，促進肢體功能恢復的機制可能與增加B淋巴細胞瘤-2蛋白的表達，下調(diào)Bax蛋白的表達有關[25]。

本研究結(jié)果顯示，假手術組大鼠評分無明顯變化，實驗1組，實驗2組，實驗3組在7d、14d、28d的BBB評分整體高于模型組，且隨著術后時間進展評分逐漸上升，差異有統(tǒng)計學意義，說明補陽還五湯和電針療法均可促進SCI后大鼠運動功能的恢復，二者聯(lián)合治療的療效優(yōu)于任何單一方法治療，但其具體治療機制還需進一步研究與探索。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植可修復損傷軸突周圍的髓鞘，促進軸突再生，并協(xié)助新血管的形成，促進功能的恢復[26]。王璐瑤等[27]發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯和MSCs移植聯(lián)合治療SCI的效果遠遠高于MSCs移植和補陽還五湯單獨治療。隨著生物工程和干細胞工程的不斷進步，與醫(yī)學的聯(lián)系進一步加深，生物材料支架與MSCs聯(lián)合移植被證實能夠填補脊髓神經(jīng)細胞液化壞死形成的空腔，抑制膠質(zhì)瘢痕形成，改善軸突再生的微環(huán)境，從而促進軸突再生[28]。在基因?qū)用?，LncRNA是繼微小RNA后研究的熱點基因，有大量文獻和研究表明LncRNA在SCI模型中有差異性表達，這為在分子機制通過干預lncRNA來治療SCI提供了新的思路與可能，有望成為判斷SCI預后與SCI的新治療靶點。

綜上所述，補陽還五湯與電針均對SCI大鼠有治療作用，由于本研究條件有限，下一步研究將對于補陽還五湯與電針治療SCI與Lnc RNA表達之間的關系進行更深入的研究，希望可以為SCI的臨床治療提供新的思路與方法。

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（收稿日期：2022–07–24）

（修回日期：2022–09–07）