甘蔗鐮孢菌插入突變體庫的構(gòu)建、致病變異突變體篩選及突變基因定位

蒙姣榮　黃海娟　楊惠貞　曾泉　李珅雨　陳保善

關(guān)鍵詞：甘蔗鐮孢菌；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；遺傳轉(zhuǎn)化；致病力相關(guān)基因；側(cè)翼序列；甘蔗梢腐病

中圖分類號(hào)：S435.661 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

甘蔗梢腐?。╬okkah boeng disease， PBD）是甘蔗重要的真菌性病害之一，在我國主要甘蔗產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，且有逐年上升的趨勢(shì)[1]。通常年份甘蔗梢腐病可使甘蔗減產(chǎn)5%～20%，發(fā)病嚴(yán)重的年份可減產(chǎn)30.2%～48.5%，糖分降低2.63%～5.21%，造成甘蔗產(chǎn)量及糖分巨大損失[1-2]。有效防治甘蔗梢腐病已成為目前確保甘蔗糖產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展急需解決的主要問題之一。

甘蔗鐮孢菌（Fusarium sacchari）最早從甘蔗上分離出來，其有性階段為甘蔗赤霉菌（Gibberellasacchari），是甘蔗梢腐病優(yōu)勢(shì)病原菌[3-6]；此外，甘蔗鐮孢菌還是甘蔗枯萎?。╯ugarcane wilt）的病原菌，該病害對(duì)甘蔗產(chǎn)量及其糖含量的影響比甘蔗梢腐病的更為嚴(yán)重，是一種毀滅性病害[7-8]。在我國，有從小麥赤霉病樣品上分離到甘蔗鐮孢菌的報(bào)道[9]，在香蕉果實(shí)和葉片上也經(jīng)常分離到甘蔗鐮孢菌[10-11]。目前，針對(duì)甘蔗鐮孢菌的致病分子機(jī)理研究十分有限，已有的文獻(xiàn)涉及鐵紅素合成酶基因功能鑒定、產(chǎn)生毒素種類鑒定和攜帶真菌病毒種類鑒定等[5， 12-13]。最近的文獻(xiàn)報(bào)道，在甘蔗鐮孢菌與甘蔗互作的研究中鑒定獲得一批甘蔗鐮孢菌的效應(yīng)蛋白[14-16]。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation， ATMT）是獲得隨機(jī)插入突變體的主要遺傳手段之一，其轉(zhuǎn)化起始材料通常不需經(jīng)過去除細(xì)胞壁，如分生孢子、菌絲體均可用于轉(zhuǎn)化，操作簡(jiǎn)便；同時(shí)具有轉(zhuǎn)化率高及多為單拷貝插入等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于真菌功能基因的研究[17-19]，在包括鐮孢菌在內(nèi)的多種植物病原菌致病基因功能及其致病機(jī)制的研究中已有較多成功應(yīng)用的報(bào)道[20-22]。王鑫等[23]采用ATMT 技術(shù)構(gòu)建了的甘蔗梢腐病菌CNO-1 菌株的突變體庫，并針對(duì)生長速度減慢突變體的插入位點(diǎn)序列進(jìn)行分析。本課題組于2016—2018 年對(duì)廣西甘蔗梢腐病發(fā)生情況進(jìn)行全面調(diào)查，并對(duì)其病原菌進(jìn)行鑒定，明確甘蔗鐮孢菌是廣西甘蔗梢腐病菌的優(yōu)勢(shì)病原菌種類[6]，并對(duì)分離獲得的強(qiáng)致病力代表性菌株FF001 進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定（尚未發(fā)表）。本研究采用ATMT 技術(shù)構(gòu)建菌株FF001 的突變體庫，篩選致病力差異較大的突變體，并對(duì)突變基因進(jìn)行定位分析，以期為克隆致病相關(guān)基因提供研究材料，為甘蔗鐮孢菌的致病分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種、質(zhì)粒與甘蔗品種 甘蔗鐮孢菌FF001 菌株為本課題組從具有典型梢腐病癥狀的甘蔗病株上分離純化并保存[6] ； 大腸桿菌（Escherichia coli）Trans1-T1 感受態(tài)和pEASY-T1Clonging Kit 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株AGL-1 ， 攜帶潮霉素B 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的pTHR1-AH 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并保存。甘蔗品種‘中蔗9 號(hào)為甘蔗梢腐病感病品種，用于致病力測(cè)定。

1.1.2 主要試劑 抗生素利福平（rifampicin，Rif）、氨芐青霉素（ampicillin， Amp）、壯觀霉素（spectinomycin， Spe）、頭孢霉素（cefalosporiner，Cef）、潮霉素 B（hygromycin B， Hyg B）、乙酰丁香酮（acetosyringone， AS）和2-（N-馬啉）乙基磺酸[2-（N-morpholino） ethane-sulfonic acid，MES]均購自北京索萊寶科技有限公司。瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DIG Wash and Block BufferSet 試劑盒和DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II 試劑盒購自羅氏公司。2×EsTaq Master Mix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）購自美國BD 公司（Becton， Dickinson and Company），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗鐮孢菌遺傳轉(zhuǎn)化

參照文獻(xiàn)[23]的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并稍作修改。具體步驟： 將攜帶pTHR1-AH 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL-1 菌株在LBA 培養(yǎng)基（Rif、Amp 和Spec終濃度均為50 μg/mL）上劃線，28℃培養(yǎng)2 d 后挑取單菌落接種到MM 液體培養(yǎng)基中（Rif、Amp和Spec 終濃度均為50 μg/mL），28℃條件下振蕩培養(yǎng)（200 r/min）2 d，4500 r/min 室溫離心5 min，用1 mL IM 培養(yǎng)基重懸菌體，并稀釋至濃度OD600為0.1，加入AS（終濃度為200 μmol/L），28℃，振蕩培養(yǎng)48 h（200 r/min）；配制濃度為1×10⁴個(gè)/mL 的新鮮甘蔗鐮孢菌分生孢子懸浮液，與上述步驟獲得的農(nóng)桿菌菌液按1∶1 比例混合，涂布于IM 固體培養(yǎng)基表面的0.45 μm 孔徑微孔濾膜上，25℃條件下共培養(yǎng)2 d；將微孔濾膜轉(zhuǎn)移至篩選PDA 培養(yǎng)基上（含400 μg/mL Cef 和50 μg/mL HygB），并在微孔濾膜上加一層篩選PDA 培養(yǎng)基（含400 μg/mL Cef 和100 μg/mL Hyg B），25℃培養(yǎng)2～3 d 即有可見轉(zhuǎn)化子長出，將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到新的篩選PDA 培養(yǎng)基上（Cef 400 μg/mL，Hyg B100 μg/mL），25℃培養(yǎng)2～3 d，再次轉(zhuǎn)移到另一新的篩選PDA 培養(yǎng)基上（含Cef 400 μg/mL，Hyg B50 μg/mL），25℃培養(yǎng)4～5 d。經(jīng)過3 次篩選可在含50 μg/mL Hyg B PDA 培養(yǎng)基上正常生長的轉(zhuǎn)化子即認(rèn)定為穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化子，即可保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 突變株總DNA 的提取及分子鑒定 用CTAB 法提取野生型菌株和突變株的基因組DNA。突變株的PCR 鑒定：以野生型菌株FF001和突變株的基因組DNA 作為模板，使用特異性引物AMP F/HPH-1 R（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積25 μL：2×Ex Taq Master Mix 12.5 μL；10.0 μmol/L 引物AMP F 1.0 μL；10.0 μmol/L 引物HPH-1 R 1.0 μL；DNA 模板（20～50 ng/μL）1.0 μL，ddH₂O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，運(yùn)行30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。Southern 雜交分析：大量提取野生型菌株和突變的基因組DNA（50 μg），分別用快速限制性內(nèi)切酶Xba I 進(jìn)行單酶切，在37℃恒溫條件下反應(yīng)過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)氯仿抽提2 次后取上清加入2 倍體積的無水乙醇和3 mol/L 醋酸鈉溶液，充分混勻，–80℃超低溫冰箱放置30 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清液；再加入500 μL 75%的乙醇溶液洗滌沉淀2 次，自然晾干，加入35 μLddH₂O 溶解，取25 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜。以質(zhì)粒pTHR1-AH 為模板，用引物AMPF/HPH-1 R 進(jìn)行擴(kuò)增獲得的DNA 片段作為探針，參照羅氏公司地高辛試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記，雜交。按照DIG Wash and Block Buffer Set 試劑盒說明書進(jìn)行洗膜等。用LAS500 超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀成像分析雜交結(jié)果。

1.2.3 突變體致病力的測(cè)定 參照WANG 等[24]接種葉片的方法進(jìn)行突變株的致病力測(cè)定。突變體及野生型菌株分別接種于PDA 平板上，28℃培養(yǎng)4～5 d，在菌落邊緣取直徑0.6 cm 的菌絲圓片；選取生長4～8 個(gè)月，健康甘蔗植株（‘中蔗9 號(hào)）完全展開的+1 或+2 位葉片，棄其基部約10 cm，依次剪取約6 cm 葉片（一張葉片約8 個(gè)葉片節(jié)段），從葉片邊緣垂直中脈方向剪一切口（切口大約為1.0 cm），將菌絲圓片覆蓋在切口上，保濕，28℃條件下培養(yǎng)3～4 d，記錄病斑出現(xiàn)時(shí)間，測(cè)量病斑直徑，每個(gè)突變株接種3 張葉片。經(jīng)過3 次致病力測(cè)定獲得遺傳穩(wěn)定的致病變異突變株：第一次初篩使用突變庫所有突變株進(jìn)行致病力測(cè)定，第二次復(fù)篩使用第一次初篩致病力有明顯變化（增強(qiáng)或減弱）的突變株，第二次復(fù)篩獲得的致病力有明顯變化的突變株經(jīng)過單孢分離后進(jìn)行第三次致病力測(cè)定，當(dāng)1 個(gè)突變株的3 個(gè)以上的單孢分離株均表現(xiàn)為致病力有明顯變化且表現(xiàn)一致時(shí)（即所有單孢分離株致病力全部變?nèi)趸蛉吭鰪?qiáng)）確定為致病變異突變株，并用于插入位點(diǎn)序列擴(kuò)增與基因定位分析。

1.2.4 致病變異突變體T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的擴(kuò)增與突變基因定位 使用AD5 隨機(jī)引物和右邊界（right border， RB）及左邊界（left border，LB）序列的特異引物，參照文獻(xiàn)[25-26]采用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）方法對(duì)突變體的T-DNA 側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪反應(yīng)以突變株總DNA 作為模板，簡(jiǎn)并引物AD5 與特異引物RSP4（RB 側(cè)翼序列）或M13-47（LB 側(cè)翼序列）為引物；以第一輪反應(yīng)的PCR 產(chǎn)物（稀釋50 倍）作為模板進(jìn)行第二輪反應(yīng)，引物為AD5 與RSP3 或LSP3；以第二輪反應(yīng)的PCR 產(chǎn)物（稀釋50 倍）作為模板進(jìn)行第三輪反應(yīng)，引物為AD5 與RSP2 或LSP2。TAILPCR 結(jié)束后取5.0 μL 第二輪和第三輪PCR 的擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5 %瓊脂糖糖凝膠進(jìn)行電泳分析，使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒對(duì)第二輪或第三輪PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，與pEASY-T1 載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)，質(zhì)粒小量提取試劑盒提取陽性克隆并測(cè)序。利用SNAP.GENE 軟件上查找所獲得序列的特異引物（RSP3 或RSP2、LSP3 或LSP2）及T-DNA 的RB 和LB 側(cè)翼序列，并與甘蔗鐮孢菌FF001 的基因組序列（尚未發(fā)表數(shù)據(jù)）比對(duì)，結(jié)合NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）比對(duì)結(jié)果，確定插入位點(diǎn)基因及其功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗鐮孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化

使用攜帶潮霉素抗性基因pTHR1-AH 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL-1 菌株介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘蔗鐮孢菌分生孢子，在含Hyg B的篩選PDA 培養(yǎng)基依次進(jìn)行3次篩選（前2 次Hyg B 濃度為100 μg/mL，第三次為50 μg/mL），獲得3018 個(gè)穩(wěn)定遺傳的Hyg B抗性轉(zhuǎn)化子，依次命名FsAT0001～FsAT3018。隨機(jī)提取50 個(gè)轉(zhuǎn)化子接種于不含Hyg B 的PDA 上，28℃條件下培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行培養(yǎng)性狀觀察。結(jié)果顯示，大部分轉(zhuǎn)化子的在PDA 上的生長速率和菌落形態(tài)與野生型菌株FF001 的未有明顯區(qū)別，少數(shù)轉(zhuǎn)化子表型與野生型相比表現(xiàn)很大的差異，表現(xiàn)為生長速率減慢、生長衰減和產(chǎn)生色素等（圖1）。

2.2 轉(zhuǎn)化子分子鑒定

為確定獲得的轉(zhuǎn)化子是否攜帶潮霉素抗性基因及其插入拷貝數(shù)，依據(jù)pTHR1-AH 雙元表達(dá)載體的序列（圖2A）設(shè)計(jì)引物AMP F/HPH-1 R，隨機(jī)挑選12 個(gè)轉(zhuǎn)化子提取總DNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示，所有檢測(cè)轉(zhuǎn)化子和pTHR1-AH 陽性對(duì)照均能擴(kuò)增出約1900 bp 特異性目標(biāo)條帶，而野生型菌株FF001 沒有擴(kuò)增任何可見條帶（圖2B）；同樣地，以AMP F/HPH-1 R 為引物，擴(kuò)增pTHR1-AH 獲得的DNA 作為探針進(jìn)行Southern雜交，測(cè)試的4 個(gè)轉(zhuǎn)化子均出現(xiàn)雜交條帶，野生型菌株FF001 沒有雜交條帶（圖2C），說明T-DNA片段已經(jīng)整合在FF001 菌株基因組上。統(tǒng)計(jì)12個(gè)轉(zhuǎn)化子的Southern 雜交結(jié)果，有9 個(gè)突變株的T-DNA 為單拷貝插入，3 個(gè)突變株為雙拷貝插入，未觀察到3 個(gè)及以上拷貝插入。

2.3 致病變異突變體的篩選

為獲得甘蔗鐮孢菌致病相關(guān)基因，采用葉片離體接種法進(jìn)行3 次篩選，測(cè)定了所有3018 個(gè)轉(zhuǎn)化子的致病力。接種野生型菌株FF001 3～4ｄ后，甘蔗葉片表現(xiàn)出黃色的壞死斑，病斑長度在2.0～3.0 cm 之間；有21 個(gè)突變株表現(xiàn)為致病力下降（如圖3 中FsAT1336、FsAT2953 和FsAT3001 菌株），接種3～4ｄ后，病斑長度在1.0～2.5 cm 之間；此外，有9 個(gè)突變株表現(xiàn)為致病力增強(qiáng)（如圖3 的FsAT0444 和FsAT1899 菌株），接種3 d 后即可產(chǎn)生明顯的病斑，病斑長度超過3.5 cm；其余的大部分轉(zhuǎn)化子致病力未有明顯變化（圖3 的FsAT0126菌株），病斑產(chǎn)生的時(shí)間其大小與野生型菌株相比無明顯差異（圖3）。

2.4 致病變異突變體插入位點(diǎn)側(cè)翼序列擴(kuò)增

為明確致病變異突變體T-DNA 插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，提取所有30 個(gè)致病變異突變體總DNA，采用TAIL-PCR 的方法分別插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行3 輪PCR 擴(kuò)增。分別取第二輪或第三輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，共有27 個(gè)突變株在第二輪或者第三輪PCR 后獲得清晰的特異條帶，其中有12 個(gè)突變體的左右邊界側(cè)翼序列均能有效擴(kuò)增，其余突變株只能單一的側(cè)翼序列；3 個(gè)突變株（FsAT0007、FsAT0017和FsAT1019）未能有效擴(kuò)增出側(cè)翼序列片段；部分突變株第三輪TAIL-PCR 后仍有2～3 條清晰條帶。圖4 為部分突變株第二輪或第三輪反應(yīng)后的PCR 產(chǎn)物的電泳凝膠圖。

2.5 致病變異突變體插入位點(diǎn)T-DNA邊界序列特點(diǎn)

將TAIL-PCR 產(chǎn)物回收純化后測(cè)序，對(duì)擴(kuò)增出2 條及以上條帶的轉(zhuǎn)化子，剔除片段較短或T-DNA 邊界序列不完整的序列，最終獲得39條有效序列，其中RB 側(cè)翼序列24 條，LB 側(cè)翼序列15 條。為確定T-DNA 整合到甘蔗鐮孢菌基因組中的方式，將側(cè)翼序列分別與載體pTHPR1-AH的T-DNA 序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在24 條RB 側(cè)翼序列中，RB 邊界序列完整的有20 條，占比83.3%（未顯示）。相反，在15 條LB 側(cè)翼序列中，LB 邊界序列完整的僅有5個(gè)，占比33.3%，其余序列的LB 邊界均有不同程度的截短，其中FsAT0372 突變株LB 邊界序列缺失片段最長，為64 bp（圖5）。

2.6 致病變異突變體突變基因的定位及其功能

將側(cè)翼序列與甘蔗鐮孢菌FF001 菌株基因組序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合NCBI 比對(duì)結(jié)果，獲得突變及其對(duì)應(yīng)基因的功能注釋。與FF001 基因組序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)果顯示，F(xiàn)sAT2418 突變株RB 和LB側(cè)翼序列分別與2 條不同contig（contig00006 和contig00011）上的序列對(duì)應(yīng)，其余突變株的側(cè)翼序列均對(duì)應(yīng)于FF001 基因組的單一序列，分布在9 條contig 上；對(duì)同時(shí)獲得RB 和LB 側(cè)翼序列的12 個(gè)突變體的插入位點(diǎn)進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在突變體FsAT3008 中，T-DNA 插入為直接插入；在FsAT1780 和FsAT2324 中，T-DNA 插入造成22～23 bp 的小片段基因組缺失，而其余突變株中，TDNA插入均可造成基因組較大片段的缺失，其大小在2202～6129 bp 之間。此外，突變株FsAT0213 和FsAT1666 的RB 插入位點(diǎn)相同，F(xiàn)sAT1899 和FsAT2418 RB、FsAT0166 RB 和FsAT1899 LB 分別插入同一基因的不同位點(diǎn)（圖6）。

將獲得的39 條單一側(cè)翼序列，在NCBI 上進(jìn)行同源序列搜索，并進(jìn)行插入位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示有19 個(gè)T-DNA 插入位點(diǎn)位于相應(yīng)基因的編碼區(qū)，16 個(gè)T-DNA 插入位點(diǎn)位于相應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，2 個(gè)T-DNA 插入位點(diǎn)位于終止子區(qū)，另有2 個(gè)T-DNA 插入位點(diǎn)位于基因間隔區(qū)（表2）。甘蔗鐮孢菌基因功能注釋結(jié)果顯示，插入位點(diǎn)的基因分別編碼22 個(gè)已知功能蛋白和16 個(gè)未知功能蛋白，其中致病力減弱突變體的插入位點(diǎn)基因編碼的蛋白功能可以分成6 類，第一類為參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)的蛋白（7 個(gè)），包括 α-甘露糖苷酶（alpha-mannosidase）、中性氨基酸滲透酶（neutral amino acid permease）、寡聚高爾基復(fù)合體成分4（oligomeric golgi complex component 4）、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（oligopeptide transporter， OPT）、?；o酶A 脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase）、乙酰乙酰-CoA 合成酶（acetoacetyl-CoA synthetase）和類驅(qū)動(dòng)蛋白bimC（kinesin-related proteinbimC）；第二類為轉(zhuǎn)錄因子（4 個(gè)），包括鋅指蛋白ASD4（zinc finger protein ASD4）、轉(zhuǎn)錄起始因子TFIID（transcription initiation factor TFIID）、角質(zhì)酶G-box 結(jié)合蛋白（cutinase G-box bindingprote in， CGBP）、吖啶黃素敏感性控制蛋白（acriflavine sensitivity control protein ACR-2）；第三類為分子伴侶（2 個(gè)），NVL 蛋白（nuclearVCP-like protein）和熱激蛋白HSP30（heat shockprotein 30）；第四類為參與RNA 降解的核糖核酸外切酶（exoribonuclease），第五類為參與DNA損傷修復(fù)的DNA 聚合酶η（DNA polymerase eta），第六類為未知功能蛋白（10 個(gè)）（表2）；此外，F(xiàn)sAT0082 缺失片段包含的基因編碼存活因子1（survival factor 1， SVF1），F(xiàn)sAT1832 缺失片段包含 的 基 因 編 碼 乙 醛 脫 氫 酶 （ aldehyde dehydrogenase， ALDH ）， 其余突變株（ FsAT0124 、FsAT0166、FsAT0372 和FsAT3001）缺失片段分別編碼4 個(gè)未知功能蛋白基因。致病力增強(qiáng)突變株的插入位點(diǎn)基因則分別編碼碳酐酸酶（carbonicanhydrase）、Bud 10 蛋白（Bud 10 protein）、硫氧還蛋白（thioredoxin）、硒蛋白（selenoprotein）、2C 型蛋白磷酸酶（type 2C protein phosphatase，PP2C）和2 個(gè)未知功能蛋白。T-DNA 插入基因的編碼區(qū)或者引起基因的缺失，可以直接破壞基因的功能，而插入位點(diǎn)為基因啟動(dòng)子區(qū)和終止子區(qū)的突變體有可能是通過影響目標(biāo)基因的表達(dá)從而影響突變體的致病力。

3 討論

甘蔗鐮孢菌是廣西甘蔗梢腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌[6]，其致病分子機(jī)理研究鮮有報(bào)道。本研究以強(qiáng)致病力菌株FF001 為出發(fā)菌株，采用ATMT 技術(shù)構(gòu)建了庫容量為3018 個(gè)突變株的突變體庫，篩選獲得30 個(gè)致病變異突變體，并對(duì)插入位點(diǎn)基因進(jìn)行的定位與分析，獲得一批可能的致病相關(guān)基因，為甘蔗鐮孢菌致病基因功能研究，闡明其致病分子機(jī)理提供了直接、可靠的試驗(yàn)材料。

在構(gòu)建突變體過程中，曾嘗試完全參照王鑫等[23]描述的方法構(gòu)建突變體庫，甘蔗鐮孢菌分生孢子與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后將微孔濾膜轉(zhuǎn)移到篩選PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，直接挑取轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化多批次均未能獲得真正的轉(zhuǎn)化子。隨后改為在微孔濾膜上加蓋一層含Hyg B（100 μg/mL）的PDA篩選培養(yǎng)基，25℃條件下培養(yǎng)2 d 即有可見單個(gè)轉(zhuǎn)化子長出，經(jīng)過3 次Hyg B 抗性篩選獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 檢測(cè)和Southern 雜交，結(jié)果顯示全部為陽性轉(zhuǎn)化子，說明改進(jìn)后所獲得的文庫質(zhì)量較好。

TAIL-PCR 技術(shù)是擴(kuò)增插入序列T-DNA 未知側(cè)翼序列的常用方法[26-27]。本研究采用TAIL-PCR對(duì)30 個(gè)突變株插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得24 個(gè)RB 側(cè)翼序列和15 個(gè)LB 側(cè)翼序列，絕大多數(shù)RB 側(cè)翼序列保留完整的右邊界序列；相反，在15 個(gè)LB 側(cè)翼序列中，只有5 個(gè)的T-DNA 左邊界被完整保留下來，其余的均存在不同程度的截短，研究結(jié)果與其他真菌的ATMT 轉(zhuǎn)化結(jié)果[28-29]相似。姚姿婷[25]使用特異引物與簡(jiǎn)并引物AD5對(duì)板栗疫病菌突變體的RB 和LB 側(cè)翼序列進(jìn)行TAIL-PCR 擴(kuò)增，均有較好的擴(kuò)增效果；本研究使用AD5 與特異引物對(duì)所有突變體進(jìn)行TAIL-PCR 擴(kuò)增，獲得24 條RB 側(cè)翼序列，成功率80.0%，說明AD5 同樣適用于擴(kuò)增甘蔗鐮孢菌突變體的側(cè)翼序列。

轉(zhuǎn)錄因子在植物病原真菌的生長發(fā)育和致病過程中發(fā)揮重要作用[30]。稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）鋅指蛋白ADS4 屬于GATA 型轉(zhuǎn)錄因子，ADS4 基因的缺失導(dǎo)致突變體孢子萌發(fā)后不能膨大形成附著胞[31] 。稻曲病菌（ Ustilaginoideavirens）角質(zhì)酶G-box 位點(diǎn)結(jié)合蛋白UvCGBP1 則屬于C₂H₂型轉(zhuǎn)錄因子，通過介導(dǎo)MAPK 途徑相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控其致病力[32]。生存因子SVF1最早在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被鑒定，與人類抗凋亡基因Bcl-XL 存在一定功能互補(bǔ)，是釀酒酵母在氧化應(yīng)激下生存所必需[33]。在禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中SVF1 同源基因FgSVF1 缺失會(huì)導(dǎo)致其致病力完全喪失[34]，將核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）SsSVF1 基因沉默也降低其致病力[35]。氨基酸滲透酶也稱氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（amino acid transporter），主要參與生物體的氨基酸進(jìn)行吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氨基酸種類和濃度，在細(xì)胞生長發(fā)育中起到重要調(diào)節(jié)作用[36]。有多種氨基酸滲透酶在新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）致病過程起到重要作用[37]；在稻瘟病菌中，單缺失3 個(gè)普通氨基酸滲透酶MoGAP1～MoGAP3 基因的突變株表現(xiàn)為生長速度減小、致病力下降[38-39]。寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于真菌、植物和細(xì)菌中，主要轉(zhuǎn)運(yùn)3～6 肽或更長的寡肽。已有研究表明， CgOPT1 和CgOPT2 參與膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的生長發(fā)育和致病過程[40-41]。乙醛是多種基本代謝途徑的中間體，其過高的生理濃度會(huì)對(duì)細(xì)胞生長、存活和膜完整性產(chǎn)生負(fù)面影響。乙醛脫氫酶是一類進(jìn)化上保守的依賴酶NADP+多態(tài)性酶，可將乙醛不可逆氧化為乙酸，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)乙醛的濃度。在稻瘟菌中，通過RNAi（RNA interference）方法沉默3 個(gè)乙醛脫氫酶編碼基因，其突變株的產(chǎn)孢量、抗逆性和致病力均明顯降低[42]。本研究部分致病力減弱突變株插入位點(diǎn)基因或缺失基因分別編碼乙醛脫氫酶、鋅指蛋白ASD4、角質(zhì)酶G-BOX 結(jié)合蛋白、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、存活因子1 和氨基酸滲透酶等，推測(cè)可能是T-DNA 插入導(dǎo)致上述基因功能缺失或表達(dá)量降低。PP2C 是一個(gè)多成員蛋白家族，具有獨(dú)特的N 端延伸，以單體酶形式存在，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌及真菌中，參與調(diào)控生物體內(nèi)的多個(gè)生命活動(dòng)過程[43]。在灰葡萄孢菌（Botrytis cinereal）和尖孢鐮孢菌中，PP2C 基因的缺失均可導(dǎo)致致病力減弱[43-44]。不同的PP2C 調(diào)控作用有一定的差異。如在酵母中的PTC1 負(fù)向調(diào)控HOG（high-osmolarity glycerol）信號(hào)途徑，而其同源基因在灰葡萄孢菌中起到正向調(diào)控作用[43]。本研究突變株FsAT1923 T-DNA 的插入造成1 個(gè)PP2C基因的大片段缺失，其致病力增強(qiáng)，推測(cè)該基因在甘蔗鐮孢菌的致病過程起到負(fù)向調(diào)控作用，使得基因缺失后其致病力增強(qiáng)。其他突變株的插入位點(diǎn)基因，如編碼甘露糖苷酶、吖啶黃素敏感性控制蛋白和核類VCP 蛋白等基因在植物病原菌致病過程中的作用研究尚無報(bào)道，而編碼未知功能蛋白的基因可能是甘蔗鐮孢菌新的或特異的致病相關(guān)基因，今后將通過基因敲除、功能回補(bǔ)等遺傳學(xué)試驗(yàn)對(duì)上述基因的功能進(jìn)一步驗(yàn)證與分析。本課題組已經(jīng)構(gòu)建了編碼碳酐酸酶和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的缺失突變株，用菌餅進(jìn)行離體接種，前者表現(xiàn)為致病力增強(qiáng)，后者表現(xiàn)為致病力減弱（數(shù)據(jù)另文發(fā)表），與T-DNA 插入突變株表現(xiàn)結(jié)果一致，說明本研究經(jīng)過3 輪的致病力測(cè)定，獲得的致病突變株遺傳穩(wěn)定，為甘蔗梢腐病的致病相關(guān)基因功能研究提供了切實(shí)可靠的研究材料。

本研究獲得的致病變異突變體中沒有完全喪失致病力的突變體，可能與本研究采用離體葉片接種方法有關(guān)。在田間，甘蔗梢腐病菌主要通過分生孢子進(jìn)行傳播，在適宜環(huán)境條件下萌發(fā)后才實(shí)現(xiàn)其侵染過程[45]，而人工接種過程中，剪葉形成的傷口利于病原菌侵染，難于判斷因分生孢子萌發(fā)不同進(jìn)而影響病原菌侵染的突變體。此外，直接使用帶有病原菌的菌餅接種，接種體包括菌絲體和分生孢子，接種量較大，野生型菌株和突變體接種后癥狀表現(xiàn)差異不明顯，篩選不到致病力變化不顯著的突變體，這結(jié)果與橡膠樹膠孢炭疽菌T-DNA 致病缺陷轉(zhuǎn)化子篩選中遇到的情況[46]相似。還需提到的是，在稻瘟菌中，硫氧還蛋白MoTrx2 與轉(zhuǎn)錄因子MoAP1 互作調(diào)控稻瘟菌在寄主植物細(xì)胞的穿透和侵染型菌絲生長，進(jìn)而影響其致病力[47]；一個(gè)定位于線粒體的β-CA 基因缺失后，其分生孢子萌發(fā)率和致病力均明顯下降[48]。本研究的FsAT2324 突變株中插入位點(diǎn)為一個(gè)編碼硫氧還蛋白基因的編碼區(qū)，其致病力增強(qiáng)；突變株FsAT1899 和FsAT2418 的T-DNA 插入位點(diǎn)屬于同一CA 基因的啟動(dòng)子序列，用菌餅接種也均表現(xiàn)為致病力增強(qiáng)。這是由于硫氧還蛋白和CA基因在不同物種中作用機(jī)制不同？還是因?yàn)槿缜八黾羧~形成傷口更利于菌絲侵染的結(jié)果？需要進(jìn)一步研究證實(shí)。今后研究將改變接種方法，如在離體葉片或者甘蔗幼苗上接種不同濃度的分生孢子，通過病斑出現(xiàn)的時(shí)間及其大小來判斷致病力。已經(jīng)完成的基因組序列測(cè)定結(jié)果顯示，甘蔗鐮孢菌的基因組約50 Mb，可能編碼15 000 余個(gè)基因（數(shù)據(jù)另文發(fā)表），本研究所構(gòu)建的突變株庫容量偏小，今后將應(yīng)用所建立的轉(zhuǎn)化體系繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以期獲得更多的突變體，為甘蔗鐮孢菌的致病分子機(jī)理和生長發(fā)育機(jī)制提供基礎(chǔ)材料。