桂皮醛通過mTOR和STAT3調(diào)控記憶性T細(xì)胞促進(jìn)心臟移植物長期存活的作用及機(jī)制研究

李師亮 方明 周彥

〔摘要〕 目的 探索桂皮醛誘導(dǎo)記憶性心臟移植耐受的作用及潛在分子機(jī)制。方法 將60只小鼠隨機(jī)分為正常對照組（假手術(shù)，n=10）、手術(shù)組（心臟移植，n=10）、模型組（注射T細(xì)胞+心臟移植，n=10）、桂皮醛低濃度組（注射T細(xì)胞+心臟移植+10 mg/kg桂皮醛，n=10）、桂皮醛中濃度組（注射T細(xì)胞+心臟移植+20 mg/kg桂皮醛，n=10）和桂皮醛高濃度組（注射T細(xì)胞+心臟移植+40 mg/kg桂皮醛，n=10）。觀察各組移植物平均存活時(shí)間、移植物排斥程度，檢測脾細(xì)胞增殖情況、移植物中相關(guān)基因白細(xì)胞介素-2（interleukin-2， IL-2）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10， IL-10）、γ-干擾素（interferon-γ， IFN-γ）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）的相對表達(dá)量，以及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription3， STAT3）蛋白磷酸化的表達(dá)情況。結(jié)果 （1）與正常對照組相比，手術(shù)組存活時(shí)間明顯縮短（P<0.05）；與手術(shù)組相比，模型組存活時(shí)間明顯縮短（P<0.05）；與模型組相比，桂皮醛高濃度組的平均存活時(shí)間顯著延長（P＜0.05）。（2）對各組移植物排斥程度進(jìn)行評估，模型組為Ⅳ級，桂皮醛治療組的移植物排斥程度顯著降低，且具有劑量依賴性。（3）與正常對照組相比，手術(shù)組及模型組脾細(xì)胞OD值升高（P<0.05）；與模型組及桂皮醛低濃度組相比，桂皮醛中、高濃度組脾細(xì)胞OD值降低（P<0.05）。（4）與正常對照組相比，手術(shù)組IL-2、IFN-γ mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）；與手術(shù)組相比，模型組IL-2、IFN-γ mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，桂皮醛中、高濃度組移植物中IL-2、IFN-γ mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），桂皮醛中、高濃度組IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）。（5）與正常對照組相比，手術(shù)組p-mTOR、p-STAT3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）；與手術(shù)組相比，模型組p-mTOR、p-STAT3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，桂皮醛中、高濃度組移植物中p-mTOR、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 對于記憶性心臟移植模型，高濃度桂皮醛可以獲得移植物長期耐受，其機(jī)制可能是通過抑制mTOR和STAT3的表達(dá)，降低移植物記憶性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答水平。

〔關(guān)鍵詞〕 桂皮醛；記憶性T細(xì)胞；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3；心臟移植

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.008

Mechanism of cinnamaldehyde in regulating long-term survival of cardiac grafts

induced by memory T cells through mTOR and STAT3

LI Shiliang1， FANG Ming2， ZHOU Yan2*

1. Department of Cardiology and Vascular Surgery， Tongji Hospital of Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan， Hubei 430030， China; 2. Department of Otolaryngology， Head and Neck Surgery， Union Hospital of Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan， Hubei 430022， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the role of cinnamaldehyde in tolerance of memory heart transplantation as well as its potential molecular mechanism. Methods A total of 60 mice were randomly divided into normal control group （sham operation）， operation group （heart transplantation）， model group （T cells injection+heart transplantation）， low-dose cinnamaldehyde group （T cells injection+heart transplantation+10 mg/kg cinnamaldehyde）， medium-dose cinnamaldehyde group （T cells injection+heart transplantation+20 mg/kg cinnamaldehyde） and high-dose cinnamaldehyde group （T cells injection+heart transplantation+40 mg/kg cinnamaldehyde）， with 10 mice in each group. The average graft survival time and graft rejection degree of each group were observed to detect the proliferation of spleen cells， the relative expression amount of interleukin-2 （IL-2）， interleukin-10 （IL-10）， interferon-γ （IFN-γ） and transforming growth factor-β （TGF-β）， and the expression of protein phosphorylation of mammalian target of rapamycin （mTOR） and signal transduction and activator of transcription3 （STAT3） in the related genes. Results （1） Compared with normal control group， the survival time of operation group was significantly shorter （P<0.05）; compared with the operation group， the survival time of the model group was also significantly shorter （P<0.05）; compared with the model group， the average survival time of high-dose cinnamaldehyde group was significantly prolonged （P<0.05）. （2） The degree of graft rejection in each group was scored according to the HE staining results. The score showed that the model group was grade Ⅳ， and the degree of graft rejection in cinnamaldehyde treatment group was significantly reduced in a dose-dependent manner. （3） Compared with the normal control group， the proliferation of splenocytes in operation group and model group was significantly higher （P<0.05）; compared with the model and low-dose cinnamaldehyde groups， the proliferation of splenocytes in the medium- and high-dose groups was reduced （P<0.05）. （4） Compared with the normal control group， the mRNA expression of IL-2 and IFN-γ in operation group was significantly up-regulated （P<0.05）， while that of IL-10 and TGF-β was significantly down-regulated （P<0.05）; compared with the operation group， the mRNA expression of IL-2 and IFN-γ in model group was significantly up-regulated （P<0.05）， while that of IL-10 and TGF-β were significantly down-regulated （P<0.05）; compared with the model group， the mRNA expression of IL-2 and IFN-γ in the medium- and high-dose groups was significantly down-regulated （P<0.05）， but that of IL-10 and TGF-β genes were significantly up-regulated （P<0.05）. （5） Compared with normal control group， the expression of p-mTOR and p-STAT3 proteins in operation group was significantly up-regulated （P<0.05）; compared with operation group， the expression of p-mTOR and p-STAT3 protein in model group was significantly up-regulated （P<0.05）; compared with model group， the expression of p-mTOR and p-STAT3 proteins in the medium- and high-dose groups was significantly down-regulated （P<0.05）. Conclusion In the memory heart transplantation model， high concentration of cinnamaldehyde can achieve long-term graft tolerance， which may decrease the immune response level of graft memory T cells by inhibiting the expression of mTOR and STAT3.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 cinnamaldehyde; memory T cells; mammalian target of rapamycin; signal transduction and activator of transcription3; heart transplantation

器官移植是終末期器官衰竭患者的一項(xiàng)挽救生命的手術(shù)，但長期移植生存受到免疫排斥和免疫抑制藥物不良反應(yīng)的限制[1]。記憶性T細(xì)胞對移植排斥和耐受有重要影響[2]。異體記憶性T細(xì)胞不僅在異體抗原致敏后產(chǎn)生，如輸血和先前的移植，而且也可以通過內(nèi)穩(wěn)態(tài)細(xì)胞增殖和異體免疫產(chǎn)生[3-4]。誘導(dǎo)移植耐受的方法在富含異體記憶性T細(xì)胞的動(dòng)物中常常失敗，例如，雖然共刺激阻斷能有效誘導(dǎo)小鼠移植耐受，但不能防止供體同種異體抗原預(yù)致敏小鼠的排斥反應(yīng)[5-6]。因此，為了更有效地預(yù)防移植排斥反應(yīng)，有必要確定驅(qū)動(dòng)記憶性T細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

桂皮醛是中藥肉桂的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗血栓、降壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制前體脂肪細(xì)胞的分化與脂質(zhì)堆積、抗腫瘤以及心臟保護(hù)等，顯現(xiàn)出廣泛的臨床應(yīng)用和開發(fā)前景[7]。但桂皮醛對心臟移植物長期存活的作用和分子機(jī)制尚待探明。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）控制T細(xì)胞反應(yīng)的多個(gè)方面[8]。例如，mTOR促進(jìn)多個(gè)Th細(xì)胞亞群的分化和功能，如Th1、Th2、Th17和Tfh細(xì)胞[9]。相反，在病毒感染和接種后，mTOR抑制記憶性CD8+T細(xì)胞的分化[10]。目前，尚不清楚mTOR是否也對移植環(huán)境中的Th和記憶性細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生這些相反的作用。mTOR在異體T細(xì)胞應(yīng)答中的生物學(xué)作用仍需進(jìn)一步的探索。研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription3， STAT3）具有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，在生理和發(fā)育中發(fā)揮作用[11]。在免疫調(diào)節(jié)方面，STAT3對于特定CD4+T細(xì)胞亞群的分化至關(guān)重要[12]。而STAT3在T細(xì)胞存活中的關(guān)鍵作用最初是通過條件敲除T細(xì)胞譜系中的STAT3基因來證明的[13]，在這一系統(tǒng)中，已證實(shí)IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對T細(xì)胞具有抗凋亡作用[14]。但STAT3在移植環(huán)境中如何調(diào)控記憶性T細(xì)胞，還有待進(jìn)一步研究。

因此，本研究探討桂皮醛能否在移植環(huán)境中通過mTOR和STAT3調(diào)控記憶T細(xì)胞，使得心臟移植物存活期延長。

1 材料

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級健康C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）小鼠各60只，雌性，8～12周齡，體質(zhì)量（20±2） g，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。經(jīng)檢疫后飼養(yǎng)在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級環(huán)境內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（鄂）2020-0018，單籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 ?藥品和主要試劑

桂皮醛（北京西林布克網(wǎng)絡(luò)科技有限公司，批號：104-55-2）；p-mTOR、mTOR、p-STAT3、STAT3、GAPDH（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：AP0115、A11354、AP0705、A1192、A19056）；HE染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：KGA224）；尼龍毛柱[安諾倫（北京）生物科技有限公司，批號：PS-18369-50]；蘇木素染液、中性樹膠（廣州市潔利生物醫(yī)學(xué)有限公司，批號：JLM-111、JLM-4901）；絲裂霉素[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，批號：M4287-2MG]；Trizol試劑（美國英杰生命技術(shù)有限公司，批號：15596026）；諾唯贊HiScipt Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：R323-01）。

1.3 ?主要儀器

Cyflow Space型流式細(xì)胞儀（德國Partec公司）；Tanon3500型全自動(dòng)凝膠成像儀化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能公司）；K3PLUS型酶標(biāo)儀[寶予德（中國）有限公司]；Axiovert200型顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）。

2 方法

2.1 ?動(dòng)物模型及分組

SPF級健康C57BL/6小鼠60只，隨機(jī)均分為6組：正常對照組（假手術(shù)，n=10）、手術(shù)組（心臟移植，n=10）、模型組（注射T細(xì)胞+心臟移植，n=10）、桂皮醛低濃度組（注射T細(xì)胞+心臟移植+10 mg/kg桂皮醛，n=10）、桂皮醛中濃度組（注射T細(xì)胞+心臟移植+20 mg/kg桂皮醛，n=10）和桂皮醛高濃度組（注射T細(xì)胞+心臟移植+40 mg/kg桂皮醛，n=10）。模型組、桂皮醛低濃度組、桂皮醛中濃度組和桂皮醛高濃度組小鼠稱重后，尾靜脈注射BALB/c小鼠脾臟T細(xì)胞，第2天以BALB/c小鼠為供體，移植心臟取下后，用10 mL保存液以1 mL/min的速度沖洗心內(nèi)血液。心臟移植物采用4 ℃常規(guī)威斯康星大學(xué)保存液（University of Wisconsin solution， UW）保存。移植前，用10 mL生理鹽水沖洗高鉀UW溶液，用10 mL過冷灌注液沖洗高滲過冷保存液，兩種沖洗速率均為1 mL/min。植入時(shí)，缺血時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)化為20 min。造模術(shù)后將小鼠單籠飼養(yǎng)，37 ℃保溫，小鼠能恢復(fù)至造模前狀態(tài)表示造模成功；復(fù)搏時(shí)間為主動(dòng)脈停跳至正常周期心室跳動(dòng)自動(dòng)恢復(fù)的時(shí)間，定義為復(fù)蘇[15]。然后灌胃給予桂皮醛，連續(xù)給藥21 d，且每天通過視診和觸診小鼠頸部皮下檢查移植心臟側(cè)波動(dòng)情況。取各組小鼠的心臟組織和血標(biāo)本。術(shù)后通過每天腹部捫診心臟脈沖來判斷心臟移植物存活情況，隨著存活時(shí)間增加，波動(dòng)逐漸減弱，直至停止，直接采用剖腹探查證實(shí)心跳完全停止[16]。

2.2 ?皮膚預(yù)致敏模型及脾臟T細(xì)胞提取[17]

以BALB/c小鼠為供體，C57BL/6小鼠為受體進(jìn)行背部全層皮膚移植（皮片為圓形，直徑>1.2 cm），用手術(shù)線固定移植物并包扎。排斥反應(yīng)被定義為完全喪失活性的表皮移植物組織[6]。皮膚移植4周后，取受體鼠脾臟，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，過尼龍毛柱，分離出T細(xì)胞。

2.3 ?心臟組織HE染色

石蠟切片65 ℃烘干2 h，二甲苯脫蠟3次，每次10 min，然后置于100%、95%、70%的乙醇溶液各5 min，自來水流水沖洗10 min，滴加1滴（50～100 μL）蘇木素染液染色5～10 min，蒸餾水沖掉染液，滴加1滴（50～100 μL）伊紅染液染色2 min，自來水沖洗，放入烘箱（50～60 ℃）烘干。中性樹膠封片，鏡下觀察。

2.4 ?移植心臟病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)國際心肺移植協(xié)會(huì)（International Society for Heart and Lung Transplantation， ISHLT）標(biāo)準(zhǔn)，通過檢查白細(xì)胞浸潤程度和心肌細(xì)胞的解剖破壞程度對心臟排斥評分（0～6分）進(jìn)行分級，具體分為0級、ⅠA級、ⅠB級、Ⅱ級、ⅢA級、ⅢB級、Ⅳ級。

2.5 ?細(xì)胞增殖能力測定

取受體鼠T細(xì)胞與供體鼠脾細(xì)胞（絲裂霉素處理）進(jìn)行混合淋巴反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction，MLR），采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)5-溴脫氧尿嘧啶（5-bromodeoxyuridinc， BrdU）法測定各組OD值。

2.6 ?實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

運(yùn)用Trizol法提取細(xì)胞或組織的總RNA，測量RNA濃度后，用無RNase的DEPC水將RNA稀釋成500 ng/μL。按照如下方案配制逆轉(zhuǎn)錄體系：總RNA（1 μL）、5×PrimeScript RT Master Mix（2 μL）、DEPC水（7 μL），混合均勻后，放入PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?2 °C，30 min；85 °C，5 min，逆轉(zhuǎn)錄后每個(gè)樣品中加入90 μL DEPC水，將DNA模板稀釋10倍。

然后用SYBR GREEN法行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：SYBR Green（5 μL）、PCR正向引物（0.5 μL）、PCR反向引物（0.5 μL）、DNA模板（4 μL）。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C，3 min；95 °C，15 s；60 °C，30 s；72 °C，30 s；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，以18S為內(nèi)參，目的基因引物序列見表1。

2.7 ?Western blot法

用蛋白裂解液提取心臟組織中的總蛋白，使用蛋白定量儀定量總蛋白，通過電泳分離等量（100 μg）蛋白質(zhì)，然后在300 mA下電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，在室溫（25 ℃）下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，孵育p-mTOR（1∶1000）、mTOR（1∶500）、p-STAT3（1∶500）、STAT3（1∶1000）和GAPDH（1∶1000）一抗，在4 ℃過夜，然后加入二抗，在室溫下孵育2 h后，使用化學(xué)發(fā)光顯影液試劑盒對蛋白條帶進(jìn)行可視化，凝膠成像系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以定量蛋白水平。

2.8 ?流式細(xì)胞術(shù)

取受體鼠脾臟，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，孵育一抗，未處理組和預(yù)致敏組分別加入5～20 μL同型抗體和靶標(biāo)抗體（PE-anti-CD44和FITC-anti-CD62L），充分混勻，至4 ℃孵育30 min，孵育期間每隔10 min晃動(dòng)一下反應(yīng)管，使細(xì)胞和抗體充分反應(yīng)；加入適量細(xì)胞洗液，1000 r/min離心5 min，離心半徑為5 cm，棄上清，洗滌2次；使用100 μL細(xì)胞洗液重懸細(xì)胞；過尼龍毛柱，流式細(xì)胞術(shù)分析重懸細(xì)胞液中記憶性T細(xì)胞（memory T cell， Tm）（CD62L-CD44）的變化。

2.9 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，數(shù)據(jù)使用“ｘ±s”表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組及以上比較采用單因素方差分析。生存分析使用Kaplan Meier法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?皮膚預(yù)致敏模型中Tm含量檢測

本研究為檢測同種異體皮膚預(yù)致敏誘導(dǎo)產(chǎn)生Tm的能力，分離皮膚移植4周的C57BL/6小鼠脾臟T細(xì)胞，用PE-anti-CD44和FITC-anti-CD62L單抗標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)未處理的小鼠脾臟中Tm占4.1%（圖1A），而預(yù)致敏小鼠為18.6%（圖1B），表明皮膚預(yù)致敏可以誘導(dǎo)受體鼠體內(nèi)分化出大量具有記憶性表型的T細(xì)胞。

3.2 ?各組移植物存活率比較

與正常對照組相比，手術(shù)組平均存活時(shí)間縮短（P<0.05）；與手術(shù)組相比，模型組平均存活時(shí)間縮短（P<0.05）；與模型組相比，桂皮醛高濃度組平均存活率顯著延長（P<0.05），與桂皮醛低濃度組相比，桂皮醛高濃度組平均存活時(shí)間顯著延長（P<0.05）。詳見圖2。

3.3 ?各組移植物排斥反應(yīng)情況比較

正常對照組心肌纖維呈梭形排列，纖維間排列緊密，各纖維以分支相連，纖維中部有橢圓形或桿狀的細(xì)胞核，規(guī)則排列，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，均質(zhì)分布；手術(shù)組見梭形排列的心肌纖維結(jié)構(gòu)消失，纖維內(nèi)出現(xiàn)空泡，心肌纖維之間排列疏松，空隙中淋巴細(xì)胞浸潤；模型組見梭形排列的心肌纖維結(jié)構(gòu)廣泛消失，纖維內(nèi)出現(xiàn)空泡，心肌纖維間出現(xiàn)較大的空隙，空隙中淋巴細(xì)胞廣泛浸潤；桂皮醛低、中濃度組見彌漫性心肌細(xì)胞壞死，心肌纖維斷裂，中性粒細(xì)胞浸潤，大量淋巴細(xì)胞灶融合呈片狀；桂皮醛高濃度組心肌細(xì)胞排列整齊、緊密，血管結(jié)構(gòu)完整，部分淋巴細(xì)胞浸潤。模型組為Ⅳ級，桂皮醛低濃度組為ⅢB級，桂皮醛中濃度組為Ⅱ級，桂皮醛高濃度組為Ⅱ級；與正常對照組比較，手術(shù)組及模型組等級升高（P＜0.05）；與手術(shù)組及模型組比較，桂皮醛各濃度組等級降低（P＜0.05）。詳見圖3。

3.4 ?各組OD值比較

與正常對照組比較，手術(shù)組及模型組脾細(xì)胞OD值顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，桂皮醛中、高濃度組的脾細(xì)胞OD值降低（P<0.05）。與桂皮醛低濃度組相比，桂皮醛中、高濃度組的脾細(xì)胞OD值降低（P<0.05）。詳見圖4。

3.5 ?各組移植物中排斥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

與正常對照組比較，手術(shù)組IL-2、IFN-γ mRNA的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05），IL-10、TGF-β mRNA的相對表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05）；與手術(shù)組相比，模型組IL-2、IFN-γ mRNA的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05），IL-10、TGF-β mRNA的相對表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05）。與模型組相比，桂皮醛中、高濃度組的IL-2、IFN-γ mRNA的相對表達(dá)量降低（P<0.05），IL-10、TGF-β mRNA相對表達(dá)量增加（P<0.05）。與桂皮醛低濃度組比較，桂皮醛高濃度組IL-2、IFN-γ mRNA的相對表達(dá)量降低（P<0.05）。詳見圖5。

3.6 ?各組移植物中mTOR和STAT3蛋白磷酸化表達(dá)水平比較

與正常對照組比較，手術(shù)組及模型組p-mTOR和p-STAT3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）；與手術(shù)組相比，模型組p-mTOR和p-STAT3的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與模型組及桂皮醛低濃度組比較，桂皮醛中、高濃度組的p-mTOR和p-STAT3的相對表達(dá)量降低（P<0.05）。詳見圖6。

4 討論

桂皮醛是中藥肉桂的主要有效成分，具有良好的抗氧化、抗炎和心臟保護(hù)等作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)在高濃度桂皮醛治療下，所有移植心臟在小鼠體內(nèi)存活超過100 d。近期有研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞中的mTOR促進(jìn)CD4+和CD8+效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增，是心臟移植反應(yīng)中Tfh和GCB細(xì)胞生成所必需的[19]。因此，T細(xì)胞中缺失mTOR和STAT3可誘導(dǎo)移植心臟長期生存。mTOR和STAT3是決定移植中初級和記憶性T細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[19]。在移植環(huán)境中，除非使用TCR轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，否則很難追蹤同種異體抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞[20]。然而，本研究在同種異體皮膚預(yù)致敏中檢測到CD62L-CD44效應(yīng)T細(xì)胞顯著增加。盡管這些細(xì)胞的抗原特異性尚不清楚，但它們在心臟移植后的反應(yīng)有所增加。

本研究以BALB/c小鼠為供體，C57BL/6小鼠為受體進(jìn)行背部全層皮膚移植，將所得到的小鼠脾臟T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至同系小鼠體內(nèi)后進(jìn)行心臟移植，以此構(gòu)建記憶性同種異體排斥模型。在這個(gè)模型中，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，模型組的脾臟中記憶性T細(xì)胞的數(shù)目明顯增加，這說明移植后，記憶性T細(xì)胞會(huì)首先歸巢到脾臟，并有一定程度的自體增殖[21]。而與模型組相比，加入桂皮醛的小鼠脾臟中Tm數(shù)目明顯下降，考慮是由于受到桂皮醛的作用后，過繼轉(zhuǎn)移的記憶性T細(xì)胞無法被激活或激活后效應(yīng)受到抑制所致。

本研究表明，與模型組相比，加入桂皮醛的小鼠的生存時(shí)間明顯延長，且桂皮醛濃度越高，造模小鼠生存時(shí)間也逐漸延長。另外，在鏡下發(fā)現(xiàn)，模型組和桂皮醛低、中濃度組小鼠心臟組織出現(xiàn)了嚴(yán)重的移植排斥反應(yīng)，而桂皮醛高濃度組小鼠心臟組織仍保持較好的狀態(tài)，這提示高濃度的桂皮醛可阻止移植物的淋巴細(xì)胞浸潤，說明高濃度桂皮醛可明顯對抗記憶性移植排斥。近年來的研究表明，高濃度桂皮醛可誘導(dǎo)初次移植心臟和胰島等耐受，且對記憶性移植排斥模型有治療效果[22]。另外，桂皮醛能阻斷免疫細(xì)胞中NF-κB活化的能力，在原代和永生化免疫細(xì)胞中以劑量依賴性的方式抑制細(xì)胞活力、增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。桂皮醛可以抑制同種反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞激活并增殖，還可以通過阻斷樹突狀細(xì)胞與Tm間的OX40L/OX40途徑，抑制CD4+Tm的激活[24]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，桂皮醛中、高濃度組的IL-2、IFN-γ mRNA的相對表達(dá)量降低，而IL-10、TGF-β mRNA的相對表達(dá)量增加，且這些炎癥因子在桂皮醛高濃度組變化更明顯，說明高濃度桂皮醛可以獲得移植物的長期耐受。由此，得知高濃度的桂皮醛可通過抑制記憶性T細(xì)胞的反應(yīng)來減少促炎因子的表達(dá)。加入桂皮醛后脾臟的記憶性T細(xì)胞明顯減少，考慮是因?yàn)橛洃浶訲細(xì)胞只需要TCR信號即可被激活，且IL-2和IFN-γ表達(dá)水平增高也得以驗(yàn)證，這充分說明桂皮醛能抑制同種反應(yīng)性記憶性T細(xì)胞，使Tm在體內(nèi)處于克隆無能或活化誘導(dǎo)性細(xì)胞死亡狀態(tài)[25]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)相較于模型組和桂皮醛低、中濃度組，桂皮醛高濃度組可顯著降低mTOR和STAT3的磷酸化表達(dá)，從而降低對移植物的記憶反應(yīng)，延長心臟移植物的存活時(shí)間。而在以往的報(bào)道中，mTOR促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的分化[26]，T細(xì)胞中mTOR的缺失顯著抑制了這種效應(yīng)T細(xì)胞的擴(kuò)張[27]。雷帕霉素通過抑制mTORC1促進(jìn)記憶性CD8+T細(xì)胞的生成[28]。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，在生長因子和細(xì)胞因子的作用下調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)[29]。研究表明，在記憶性T細(xì)胞生成的背景下，STAT3可反向促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染后記憶性CD8+T細(xì)胞的發(fā)育[30]。STAT3缺失的CD8+T細(xì)胞發(fā)育為中樞記憶性T細(xì)胞的能力受損[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)桂皮醛可通過抑制mTOR和STAT3抑制記憶性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，降低對心臟移植物的記憶反應(yīng)，從而促進(jìn)移植物的長期存活，因此皮桂醛有望成為臨床上延長心臟移植存活時(shí)間的潛在治療藥物。

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〔收稿日期〕2022-06-27

〔基金項(xiàng)目〕湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022030241）。

〔第一作者〕李師亮，男，主治醫(yī)師，博士，研究方向：心臟移植后心肌存活的機(jī)制研究。

〔通信作者〕*周 ?彥，女，博士，副主任醫(yī)師，E-mail：bluekeigo@163.com。