加味丹參飲預(yù)防心肌缺血再灌注損傷作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究

胡旭東 彭木子 陳銘 廖菁 陳聰

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)加味丹參飲預(yù)防心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）的活性成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究。方法 通過(guò)TCMSP、UniProt等數(shù)據(jù)庫(kù)搜集加味丹參飲相關(guān)成分及靶點(diǎn)；通過(guò)GeneCards、OMIM以及DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)獲取MIRI疾病相關(guān)靶點(diǎn)；利用STRING平臺(tái)分析構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型；通過(guò)Metascape平臺(tái)分析“藥物-成分-靶點(diǎn)”及其參與的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路，而后采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“加味丹參飲成分-MIRI靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。加味丹參飲預(yù)防性給藥灌胃1周后，采用結(jié)扎大鼠左前降支的方法，建立實(shí)驗(yàn)性MIRI大鼠模型。通過(guò)ELISA觀察MIRI大鼠血清丙二醛（malonic dialdehyde， MDA）、肌酸激酶同工酶MB（creatinekinase-MB， CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）水平，HE染色觀測(cè)心肌病理改變，qRT-PCR、Western blot檢測(cè)大鼠血清心肌組織環(huán)氧合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2， PTGS2）、蛋白激酶B1（akt serine/threonine kinase 1， Akt1）表達(dá)水平。結(jié)果 初步篩選獲得加味丹參飲中的活性成分102個(gè)，藥物疾病交集基因140個(gè)，核心靶點(diǎn)54個(gè)；其中，Akt1、原癌基因JUN（Jun proto-oncogene， JUN）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）、PTGS2等靶點(diǎn)可能與MIRI密切相關(guān)，富集分析預(yù)測(cè)加味丹參飲預(yù)防MIRI主要涉及調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)通路等20條通路，并且其中5條通路中Akt1處于PTGS2上游。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加味丹參飲能夠顯著提高M(jìn)IRI大鼠血清MDA、CK-MB、LDH水平（P<0.05），同時(shí)降低SOD水平（P<0.05），抑制心肌組織中Akt1、PTGS2表達(dá)水平（P<0.05），減輕心肌組織壞死。結(jié)論 加味丹參飲可能同時(shí)抑制Akt1、PTGS2兩個(gè)靶點(diǎn)，緩解過(guò)度心肌損傷，發(fā)揮預(yù)防MIRI作用。

〔關(guān)鍵詞〕 心肌缺血再灌注損傷；加味丹參飲；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；MIRI大鼠模型；作用機(jī)制；蛋白激酶B1；環(huán)氧合酶2

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.016

Network pharmacology analysis and experimental verification of mechanism of Jiawei Danshen Decoction in preventing myocardial ischemia-reperfusion injury

HU Xudong1， PENG Muzi2， CHEN Ming1， LIAO Jing1， CHEN Cong1*

1. College of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Institute of Innovation and Applied Research in Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To predict active constituents， drug targets， and signaling pathways of Jiawei Danshen Decoction （JWDSD） in the prevention of myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） based on network pharmacology and to perform experimental validation. Methods The related constituents and targets of JWDSD were obtained from the Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） and UniProt; the MIRI-related targets were obtained from GeneCards， OMIM and DrugBank databases; the protein-protein interaction （PPI） network model was analyzed and constructed by String platform; the “drug-component-target” and the involved biological processes and signaling pathways were analyzed by the Metascape platform， and then the “JWDSD component-MIRI target-pathway” network was constructed by Cytoscape 3.7.1 software. The MIRI rat model was established by ligating the left anterior descending artery of rats one week after preventive gavage administration of JWDSD. The serum malonic dialdehyde （MDA）， creatinekinase-MB （CK-MB）， lactate dehydrogenase （LDH） and superoxide dismutase （SOD） level of MIRI rats were observed with ELISA， the pathological change of myocardium of the rats was observed by HE staining， and the serum prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （PTGS2） of rats myocardium and the expression level of akt serine/threonine kinase 1 （Akt1） were detected by qRT-PCR and Western blot. Results The total of 102 active constituents in JWDSD， 140 drug-disease intersection genes and 54 core targets were obtained by preliminary screening. Akt1， Jun proto-oncogene （JUN）， signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3）， PTGS2 and other targets may be closely related to MIRI. KEGG enrichment analysis predicted that the prevention of MIRI by JWDSD mainly by the regulation of 20 pathways， including cancer-related pathways， and Akt1 is upstream of PTGS2 in 5 pathways. Animal experiment showed： JWDSD could significantly increase the serum levels of malondialdehyde （MDA）， creatine kinase isoenzyme MB （CK-MB）， and lactate dehydrogenase （LDH）; meanwhile， it could decrease the level of superoxide dismutase （SOD） （P<0.05）， inhibit the expression levels of Akt1 and PTGS2 in myocardial tissue and reduce myocardial tissue necrosis in MIRI rats （P<0.05）. Conclusion JWDSD may inhibit Akt1 and PTGS2 targets at the same time， thereby alleviating excessive myocardial damage and preventing MIRI.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 myocardial ischemia-reperfusion injury; Jiawei Danshen Decoction; network pharmacology; MIRI rat model; mechanism of action; akt serine/threonine kinase 1; prostaglandin-endoperoxide synthase 2

在心血管疾病中，急性心肌梗死致死率一直居高不下，目前，雖然可以通過(guò)擴(kuò)張冠脈和溶栓等手段進(jìn)行有效治療，但血液重新灌注后進(jìn)一步加劇心肌損傷，導(dǎo)致梗死面積擴(kuò)大并引發(fā)嚴(yán)重的心律失常，這種梗死后再灌注引起不可逆嚴(yán)重?fù)p傷的現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI），是臨床上常見(jiàn)且亟須解決的問(wèn)題[1-4]。

中藥復(fù)方調(diào)治冠心病的優(yōu)勢(shì)日漸突出，加味丹參飲化裁于陳修園所著《時(shí)方歌括》中的丹參飲，由丹參、黃芪、檀香、赤芍、川芎、當(dāng)歸、紅花和生地黃組成，具有益氣健脾、活血化瘀的功效，臨床應(yīng)用療效顯著[5-7]。研究證實(shí)，該方通過(guò)多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多層次調(diào)控細(xì)胞凋亡、抗炎等途徑減輕MIRI，尤其是在改善癥狀方面潛力巨大，但其多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)作用的確切機(jī)制尚未清晰[5-8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、信息學(xué)等多學(xué)科理論與研究手段整合的結(jié)果，能夠系統(tǒng)綜合地反映藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)機(jī)制[9-10]。這與中醫(yī)藥論治的整體動(dòng)態(tài)性原則及復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑互相作用的特點(diǎn)有很強(qiáng)的趨同性。為此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為研究中藥復(fù)方作用機(jī)制嶄新而有效的技術(shù)支持，進(jìn)一步幫助揭示中藥復(fù)方科學(xué)內(nèi)涵，傳承、發(fā)展和完善中醫(yī)藥理論[11-12]。

故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)方法，探究加味丹參飲預(yù)防MIRI的分子機(jī)制，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為后續(xù)更進(jìn)一步研究提供必要的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 ?加味丹參飲成分靶點(diǎn)搜集及藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索加味丹參飲復(fù)方組成藥物的活性成分。根據(jù)中藥成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)篩選活性成分，以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18為限定條件。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集該藥對(duì)的潛在作用靶點(diǎn)，通過(guò)SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.gpmaw.com/html/swissprot.html）篩選P≥0.6的靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充，并通過(guò)文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充，全面搜集，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/uniprot/）將靶點(diǎn)蛋白英文名統(tǒng)一規(guī)范為基因名稱。

運(yùn)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建加味丹參飲組成藥物-藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape 3.7.1內(nèi)置分析工具計(jì)算有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，獲取包括連接度、介度及緊密度等數(shù)據(jù)，最終篩選獲取重要靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.2 ?MIRI相關(guān)靶點(diǎn)獲取

以“myocardial ischemia reperfusion injury”和“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞，挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.omim.org）中調(diào)治MIRI的潛在靶點(diǎn)，進(jìn)入DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca）尋找調(diào)治MIRI的臨床一線西藥作用靶點(diǎn)予以補(bǔ)充。合并3個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到MIRI相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

為明確加味丹參飲藥物與MIRI兩者靶點(diǎn)之間的交互作用，取兩者交集并繪制韋恩圖。進(jìn)而將交集靶點(diǎn)輸入至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，并通過(guò)Cytoscape 3.7.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化與數(shù)據(jù)分析，篩選核心靶點(diǎn)。

1.4 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點(diǎn)功能與通路的富集

Metascape平臺(tái)（http：//metascape.org/gp/index.html）具有注釋功能且能夠及時(shí)更新基因數(shù)據(jù)資料。將加味丹參飲調(diào)治MIRI的靶點(diǎn)輸入Metascape平臺(tái)，設(shè)置P<0.01，富集分析獲取與其相關(guān)的主要信號(hào)通路與生物學(xué)過(guò)程，采用微生信對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建加味丹參飲成分-MIRI靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape 3.7.1內(nèi)置分析工具計(jì)算有效成分及靶點(diǎn)參數(shù)，并根據(jù)結(jié)果獲取核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 ?實(shí)驗(yàn)藥物

加味丹參飲：黃芪20 g（廣州工業(yè)制藥有限公司，批號(hào)：2106211）；丹參20 g、川芎6 g、紅花6 g、當(dāng)歸6 g（安徽普仁中藥飲片有限公司，批號(hào)：21072031B、2108221、2111253、2107122）；檀香6 g（湖南仁上正元中藥飲片有限公司，批號(hào)：2021092702）；赤芍10 g（長(zhǎng)沙新林制藥有限公司，批號(hào)：220101）；生地黃12 g（江蘇龍鳳堂中藥有限公司，批號(hào)：21121441C），飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室龔力民主任鑒定均為正品。煎煮后去渣，濃縮至藥液濃度為2 g/mL（含生藥），于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)進(jìn)36只雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（150±20） g，動(dòng)物合格證號(hào)430727211102830068，許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物房（相對(duì)濕度50%～70%，溫度23～25 ℃，晝夜交替），普通飼料，自由飲水。本實(shí)驗(yàn)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理編號(hào)LLBH202108250004。

2.3 ?試劑及儀器

PTGS2抗體、Akt1抗體、GAPDH抗體、β-actin（肌動(dòng)蛋白）（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)分別為A00084、BM1612、BM0627、BM1623）；三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)分別為10006818、80109218、10009218）；大鼠肌酸激酶同工酶MB、乳酸脫氫酶、丙二醛、超氧化物歧化酶ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)分別為FY3500、FY3480、FY8503、FY3262）。

352型酶標(biāo)儀、AC8型洗板機(jī)（Thermo Labsystems）；TGL-16型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；TC-XP型基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；VE-180型電泳槽（上海天能科技有限公司）；SH01D型高速離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SCIENTZ-24型組織勻漿器、SCIENTZ-1500F型超聲破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

2.4 ?動(dòng)物分組、模型制備及給藥

將所購(gòu)SPF級(jí)雄性SD大鼠，于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)籠內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、加味丹參飲組，每組9只大鼠?？瞻捉M動(dòng)物術(shù)前連續(xù)7日給予生理鹽水灌胃，每天1次；假手術(shù)組動(dòng)物術(shù)前同空白組，術(shù)中繞冠狀動(dòng)脈左前降支穿線，但不結(jié)扎；模型組動(dòng)物術(shù)前同空白組，術(shù)中繞冠狀動(dòng)脈左前降支穿線，結(jié)扎30 min后進(jìn)行再灌注90 min；加味丹參飲組動(dòng)物術(shù)前連續(xù)7日給予加味丹參飲6.19 g/kg生藥量灌胃，缺血再灌注時(shí)間同模型組。參照本課題組前期造模方案[6]制備MIRI實(shí)驗(yàn)大鼠模型，手術(shù)造模前，禁食12 h，禁水4 h，進(jìn)行稱重，3%濃度的戊巴比妥鈉按照0.04 g/kg體質(zhì)量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定，氣管切開(kāi)，于切口處接小動(dòng)物呼吸機(jī)，暴露胸腔，在左心耳根部1～2 mm處進(jìn)針，結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支。心電圖顯示ST段弓背向上抬高，QRS波群改變，J點(diǎn)偏移超過(guò)0.1 mV，缺血區(qū)心肌組織顏色變白為結(jié)扎成功標(biāo)志。結(jié)扎一段時(shí)間后松開(kāi)扎線實(shí)現(xiàn)再灌注，ST段出現(xiàn)回落，可見(jiàn)梗死區(qū)心肌充血，表明再灌注成功，再灌注90 min后，腹主動(dòng)脈取血，離心機(jī)分離上清用于指標(biāo)檢測(cè)；完成腹主動(dòng)脈取血后，立即取心，沖洗凈血液后，每組6只切取左半心，放入凍存管中后快速放置于液氮罐內(nèi)，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存用于qRT-PCR、Western blot檢測(cè)，再將每組剩余3只大鼠取全心，用4%的多聚甲醛液進(jìn)行固定，用于病理染色觀察。

2.5 ?指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 ?ELISA檢測(cè)大鼠血清MDA、SOD、CK-MB、LDH水平 ?采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中MDA、SOD、CK-MB、LDH表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒方法進(jìn)行操作。

2.5.2 ?HE染色觀察大鼠心肌病理變化 ?沿左心室冠狀面中部切取環(huán)狀心肌組織塊，使用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水后進(jìn)行石蠟包埋，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下拍照。

2.5.3 ?qRT-PCR檢測(cè)心肌組織PTGS2、Akt1基因表達(dá) ?收集各組心肌組織，取適量?jī)龃娲笫笞笮氖倚募〗M織，采用Trizol法提取心肌組織中總RNA。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，觀察擴(kuò)增曲線、溶解曲線及CT值，以2-ΔΔCt數(shù)據(jù)分析法對(duì)各基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算，再將結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)分析。引物序列為PTGS2正向5'-CTGATGACTGCCCAACTCCC-3'，反向5'-CTGGGCAAAGAATGCGAACA-3'，長(zhǎng)度143 bp；Akt1正向5'-CGACGTAGCCATTGTGAAGGAG-3'，反向5'-ATTGTGCCACTGAGAAGTTGTTG-3'，長(zhǎng)度173 bp；GAPDH正向5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，反向5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'，長(zhǎng)度138 bp。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s循環(huán)40次。

2.5.4 ?Western blot檢測(cè)心肌組織PTGS2、Akt1蛋白表達(dá) ?大鼠心肌組織約100 mg，剪碎后置入盛有2.0 mL RIPA蛋白裂解液（含磷酸酶抑制劑）的勻漿器中充分勻漿；于冰上靜置60 min，使其充分裂解。將裂解后的組織勻漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，以4 ℃、12 000 r/min離心15 min（離心半徑6 cm）；取上清，采用BCA法測(cè)定各樣本蛋白濃度，并調(diào)整至一致；加入等體積蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min使其變性。取10 μL蛋白樣品上樣，依次進(jìn)行SDS凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、抗原封閉、加入一抗PTGS2（1∶500）、Akt1（1∶500）、GAPDH（1∶1000）孵育過(guò)夜、加入羊抗兔二抗（1∶2000）室溫孵育2 h等步驟。最后，采用ECL顯色液顯色，于凝膠成像儀下顯影、拍照；以GAPDH蛋白條帶灰度值為內(nèi)參，采用Quantity One軟件分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Graphpad Prism 7軟件進(jìn)行分析。結(jié)果以“ｘ±s”表示，組間比較以one-way ANOVA單因素方差分析及q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?加味丹參飲成分靶點(diǎn)篩選及藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索加味丹參飲復(fù)方組成藥物的活性成分，根據(jù)中藥成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)篩選活性成分，獲得活性成分102種。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)收集該藥對(duì)的潛在作用靶點(diǎn)，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白英文名統(tǒng)一規(guī)范為基因名稱，獲得對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)279個(gè)。

運(yùn)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建加味丹參飲藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。網(wǎng)絡(luò)分析表明，槲皮素Degree為306，介度為0.429 0，緊密度為0.509 0，預(yù)測(cè)槲皮素為復(fù)方的主要活性成分，其次為木犀草素（連接度為174，介度為0.097 9，緊密度為0.404 7）、山柰酚（連接度為124，介度為0.079 2，緊密度為0.409 7）、β-谷甾醇（連接度為79，介度為0.042 3，緊密度為0.388 0）。PTGS2在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為89，介度為0.118 9，緊密度為0.519 7，預(yù)測(cè)PTGS2為加味丹參飲復(fù)方的最主要靶點(diǎn)，PTGS1與NOCA2亦為相對(duì)重要的靶點(diǎn)。

3.2 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得MIRI靶點(diǎn)1454個(gè)，從OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)與DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)分別補(bǔ)充獲得靶點(diǎn)226個(gè)和97個(gè)，合并后刪除重復(fù)值，最終得到1591個(gè)MIRI疾病靶點(diǎn)。

將篩選的加味丹參飲靶點(diǎn)與MIRI疾病靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)140個(gè)，見(jiàn)圖2。隨后將交集靶點(diǎn)輸入至STRING 11.0平臺(tái)，得到加味丹參飲-MIRI靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)圖包括128個(gè)節(jié)點(diǎn)，635條邊。為進(jìn)一步篩選獲取核心靶點(diǎn)，將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1中的內(nèi)置分析工具，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選條件按degree排列，degree中位數(shù)為9.9，篩選大于中位數(shù)的靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖3，其中Akt1、JUN、STAT3、MAPK1、TNF等在網(wǎng)絡(luò)中連接程度較高，說(shuō)明這些靶點(diǎn)屬于核心靶點(diǎn)。

3.3 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點(diǎn)功能與通路的富集

通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)加味丹參飲調(diào)治MIRI核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，借助微生信平臺(tái)對(duì)結(jié)果可視化。結(jié)果表明，加味丹參飲主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括生物對(duì)創(chuàng)傷反應(yīng)（response to wounding）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)（response to inorganic substance）等；相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)治冠心病的功能主要富集于蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白同源二聚體化活性（protien homodimerization activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）等，見(jiàn)圖4。相關(guān)通路主要有pathways in cancer信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、proteoglycans in cancer信號(hào)通路以及PI3K-AKT通路等。詳見(jiàn)圖5。

3.4 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建加味丹參飲成分-MIRI靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖6。通過(guò)Cytoscape 3.7.1內(nèi)置的NetworkAnalyzer分析加味丹參飲預(yù)防MIRI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分及作用靶點(diǎn)。Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析表明，PTGS2在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為86，介度為0.267 8，緊密度為0.550 1，預(yù)測(cè)PTGS2為加味丹參飲調(diào)治MIRI的重要靶點(diǎn)。與此同時(shí)，結(jié)果顯示PTGS2與Akt1同時(shí)在排名20條通路網(wǎng)絡(luò)中的pathways in cancer等5條通路中同時(shí)出現(xiàn)，Akt1均處于PTGS2上游。

3.5 ?動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.5.1 ?大鼠血清MDA、SOD、CK-MB、LDH表達(dá)水平

與空白組相比，模型組大鼠血清中MDA、CK-MB、LDH含量明顯升高，SOD含量明顯降低（P<0.01）；與模型組相比，加味丹參飲組大鼠血清中MDA、CK-MA、LDH明顯含量下降（P<0.01），其中加味丹參飲組表達(dá)高于假手術(shù)組；與模型組相比，加味丹參飲組與假手術(shù)組大鼠血清中SOD含量明顯升高（P<0.01）。詳見(jiàn)表1。

3.5.2 ?HE染色觀察大鼠心肌病理變化 ?HE染色結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠心肌組織局部壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，心肌細(xì)胞走形紊亂。與模型組相比，加味丹參飲組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)明顯改善，細(xì)胞走形規(guī)律，輪廓完整，壞死減少。詳見(jiàn)圖7。

3.5.3 ?心肌組織PTGS2、Akt1基因表達(dá) ?與空白組大鼠相比，模型組大鼠PTGS2 、Akt1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)（P<0.01）；與模型組大鼠相比，加味丹參飲組與假手術(shù)組大鼠Akt1、PTGS2 mRNA表達(dá)顯著減弱（P<0.01）。詳見(jiàn)表2。

3.5.4 ?心肌組織PTGS2、Akt1蛋白表達(dá) ?與空白組大鼠比較，模型組大鼠PTGS2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Akt1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）；與模型組大鼠比較，加味丹參飲組大鼠PTGS2蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.01），其中加味丹參飲組蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組；與模型組大鼠比較，加味丹參飲組大鼠Akt1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），其中加味丹參飲組蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組。詳見(jiàn)圖8和表3。

4 討論

急性心肌梗死是危害廣大人民群眾生命健康的主要疾病之一，再灌注治療是標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而，在強(qiáng)化內(nèi)科治療基礎(chǔ)上，無(wú)論采用介入治療還是外科血運(yùn)重建策略，仍然有相當(dāng)一部分患者無(wú)法從中完全獲益，中醫(yī)藥的介入為臨床診治MIRI提供了廣闊空間[13-14]。陳欣等[15]使用丹參通絡(luò)解毒湯干預(yù)MIRI模型大鼠，證明該方可通過(guò)抑制自噬減輕損傷，其作用機(jī)制可能與下調(diào)肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）基因表達(dá)和抑制Toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子-κ（BTLR4/NF-κB）信號(hào)通路有關(guān)。李澤華等[16]發(fā)現(xiàn)黃芪的主要成分黃芪甲苷，可通過(guò)上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1（NRF2/HO-1）信號(hào)通路緩解心肌損傷和抑制細(xì)胞凋亡。蕭閔等[17]觀察金香丹預(yù)處理對(duì)MIRI大鼠模型的影響，結(jié)果表明NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NLRP3）表達(dá)受到抑制，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）表達(dá)降低，從而保護(hù)心肌細(xì)胞，緩解MIRI。

MIRI與冠心病同屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”的范疇[18]，而近年來(lái)我國(guó)冠心病患病人群中，中醫(yī)辨證以氣虛血瘀型最常見(jiàn)[19]，其病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)，以氣虛為本，以血瘀為標(biāo)。益氣活血法在胸痹治療上即補(bǔ)已虛之心氣，化停滯之瘀血，是針對(duì)氣虛血瘀病因病機(jī)特有的治療法則。加味丹參飲全方由丹參、黃芪、檀香、赤芍、川芎、當(dāng)歸、紅花、生地黃組成，具有益氣活血、通絡(luò)止痛的功效。丹參、黃芪為君藥，益氣活血；臣以赤芍、紅花活血祛瘀；佐以當(dāng)歸、生地黃養(yǎng)血活血通經(jīng)；川芎活血行氣止痛，檀香能理氣止痛，兼散寒共為佐使。加味丹參飲預(yù)處理可通過(guò)抑制P38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路，降低其下游基因環(huán)氧合酶-2（COX-2）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)，減輕心肌損傷[7]。亦有研究顯示其減輕心肌損傷的機(jī)制與其促進(jìn)內(nèi)源性硫化氫生成，上調(diào)心肌組織胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)[6]。亦或通過(guò)下調(diào)Beclin1、LC3A/B、p62和ATG5等基因的表達(dá)，抑制自噬信號(hào)通路，發(fā)揮緩解MIRI的作用[8]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步篩選出加味丹參飲調(diào)治MIRI的主要靶點(diǎn)為Akt1、PTGS2等，Akt1是影響心肌細(xì)胞活性與功能的主要決定因素之一，激活A(yù)kt1可以調(diào)控下游的因子影響細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬等過(guò)程[20-21]。研究表明[22]，治療高膽固醇血癥的藥物阿托伐他汀可以保護(hù)高糖環(huán)境下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和凋亡，這種保護(hù)作用部分可能與Akt1相關(guān)。轉(zhuǎn)染Akt1基因能夠減輕心肌I/R損傷，其作用機(jī)制可能與Akt1抑制心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換，從而具有保護(hù)線粒體的功能相關(guān)[23]。COX-2由基因PTGS2表達(dá)而產(chǎn)生，在正常生理?xiàng)l件下表達(dá)量極低，而在心血管疾病過(guò)程中，其過(guò)度表達(dá)與炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[24]；鄭嫵媚等[25]研究表明，COX-2的高表達(dá)可引發(fā)過(guò)度炎癥反應(yīng)，在誘導(dǎo)心肌損傷的過(guò)程中起到重要作用。本研究證明，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的PTGS2、Akt1確實(shí)為加味丹參飲調(diào)節(jié)MIRI的作用靶點(diǎn)，KEGG分析顯示在相關(guān)性靠前的pathways in cancer等5條通路中，Akt1均處于PTGS2上游。

本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)Akt1與PTGS2為加味丹參飲預(yù)防MIRI重要靶點(diǎn)，且Akt1作用于PTGS2上游。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加味丹參飲干預(yù)MIRI大鼠與模型組大鼠相比，血清中MDA、CK-MB、LDH含量明顯升高，SOD含量明顯降低，Akt1和PTGS2 mRNA表達(dá)下降，Akt1蛋白表達(dá)提升，并且心肌細(xì)胞壞死和纖維化程度較低。以上結(jié)果證實(shí)，加味丹參飲可能同時(shí)抑制Akt1、PTGS2兩個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)而緩解過(guò)度心肌損傷，發(fā)揮預(yù)防MIRI作用。

參考文獻(xiàn)

[1] LI L， WANG Y， GUO R， et al. Ginsenoside Rg3-loaded， reactive oxygen species-responsive polymeric nanoparticles for alleviating myocardial ischemia-reperfusion injury[J]. Journal of Controlled Release， 2020， 317： 259-272.

[2] GUO X， HU S， LIU J J， et al. Piperine protects against pyroptosis in myocardial ischaemia/reperfusion injury by regulating the miR-383/RP105/AKT signalling pathway[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2021， 25（1）： 244-258.

[3] ZHU N， LI J， LI Y L， et al. Berberine protects against simulated ischemia/reperfusion injury-induced H9C2 cardiomyocytes apoptosis in vitro and myocardial ischemia/reperfusion-induced apoptosis in vivo by regulating the mitophagy-mediated HIF-1α/BNIP3 pathway[J]. Frontiers in Pharmacology， 2020， 11： 367.

[4] YUAN X X， JUAN Z D， ZHANG R， et al. Clemastine fumarate protects against myocardial ischemia reperfusion injury by activating the TLR4/PI3K/Akt signaling pathway[J]. Frontiers in Pharmacology， 2020， 11： 28.

[5] 陳 ?聰，黃政德，廖 ?菁，等.加味丹參飲不同組方對(duì)心肌缺血再灌注損傷COX-2、ICAM-2、P38 MAPK蛋白表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2016，43（12）：2636-2638，2703.

[6] 陳 ?聰，成細(xì)華，任 ?婷，等.加味丹參飲作用內(nèi)源性H2S合成途徑保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（10）：1183-1188.

[7] 陳 ?聰，任 ?婷，胡 ?華，等.加味丹參飲預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（6）：11-15.

[8] 陳 ?聰，劉 ?洋，童巧珍，等.加味丹參飲通過(guò)抑制H2S介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路對(duì)心肌缺血再灌注損傷的治療作用[J].數(shù)字中醫(yī)藥，2021，4（3）：241-250.

[9] 但文超，何慶勇，曲 ?藝，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常的分子機(jī)制研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2019，21（11）：2396-2405.

[10] 張圓圓，靳培培，顧 ?悅，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討加味升降散治療IgA腎病的作用機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2022，28（7）：162-171.

[11] 張豐榮，祝 ?娜，李志勇，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討清瘟敗毒飲對(duì)細(xì)胞因子風(fēng)暴的干預(yù)機(jī)制[J].中國(guó)中藥雜志，2020，45（7）：1499-1508.

[12] 邵 ?珺，朱思思，黃 ?瑤，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討血府逐瘀湯治療失眠的作用機(jī)制[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2021，23（9）：3326-3336.

[13] ZHENG S， HUANG H， LI Y， et al.Yin-Xing-Tong-Mai Decoction attenuates atherosclerosis via activating PPARγ-LXRα-ABCA1/ABCG1 pathway[J]. Pharmacological Research， 2021， 169： 105639.

[14] SHEN Y C， SHEN Y J， LEE W S， et al. Two benzene rings with a boron atom comprise the core structure of 2-APB responsible for the anti-oxidative and protective effect on the ischemia/reperfusion-induced rat heart injury[J]. Antioxidants， 2021， 10（11）： 1667.

[15] 陳 ?欣，李鑫輝，王靜雯，等.丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)IRI模型大鼠心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2020，35（6）：1252-1257.

[16] 李澤華，關(guān)賢頌，蔣路平.黃芪甲苷通過(guò)NRF2/HO-1信號(hào)通路減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷[J].中國(guó)病理生理雜志，2021，37（12）：2147-2153.

[17] 蕭 ?閔，向晶晶，王 ?威，等.金香丹抑制NLRP3/IL-1β/Caspase-1信號(hào)通路緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2021，27（20）：87-94.

[18] 王士超，吳 ?偉，劉 ?芳，等.國(guó)醫(yī)大師鄧鐵濤教授治療心血管病學(xué)術(shù)思想和冠心病治療經(jīng)驗(yàn)初探[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14（10）：1167-1170.

[19] 陳貴珺，王恒和.近5年我國(guó)冠心病中醫(yī)證型地域分布規(guī)律研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2018，45（6）：1142-1146.

[20] 王興紅，鄭亞萍，李海霞.槲皮素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（4）：266-270.

[21] 徐啟麗，鄒常超，莫麗莉，等.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證銀丹心腦通保護(hù)MIRI的作用機(jī)制[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，57（1）：131-138.

[22] 葛廣豪，候月梅.阿托伐他汀保護(hù)高糖環(huán)境下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制研究[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2018，37（9）：1026-1030.

[23] 王 ?靜，李東野，夏 ?勇，等.轉(zhuǎn)染Akt1基因?qū)θ毖俟嘧⒋笫笮募【€粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26（1）：80-85.

[24] 李 ?楊，周 ?嵐，汪 ?典，等.不同劑量活血、破血中藥對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈PTGS2、PADI4、ITGAM基因表達(dá)的影響[J].疑難病雜志，2016，15（11）：1182-1186.

[25] 鄭嫵媚，初海平，王 ?燕，等.力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌p-p38MAPK、NF-kB、COX-2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016，32（1）：88-91.

〔收稿日期〕2022-09-02

〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81704065）；寧夏自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2020BFH02003）；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（20C1392、20C1416、

19B415）；湖南省衛(wèi)生健康委科研計(jì)劃項(xiàng)目（202202084742）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2021XJJJ003）；黃政德全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室資助項(xiàng)目。

〔第一作者〕胡旭東，男，碩士研究生，研究方向：藏象理論與心血管。

〔通信作者〕*陳 ?聰，女，碩士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：50634383@qq.com。