蘿卜種質(zhì)親緣關(guān)系的分子標(biāo)記分析

劉辰　付衛(wèi)民　劉賢嫻　徐文玲　郭棟　王淑芬

關(guān)鍵詞：蘿卜：親緣關(guān)系：分子標(biāo)記；遺傳多樣性：聚類分析

中圖分類號(hào)：S631.101 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2023） 03-0022-08

蘿卜（Raphanus sativus L.）屬十字花科蘿卜屬，是一種非常重要的蔬菜作物，不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，且具有廣泛的用途，其肉質(zhì)根可作為蔬菜鮮食和制干食用，葉和種子皆可入藥，食用、藥用和保健價(jià)值較高。大、中型蘿卜主要分布在亞洲地區(qū)，尤其是中國(guó)、日本和韓國(guó)等。我國(guó)作為蘿卜的起源地之一，產(chǎn)區(qū)分布很廣，幾乎每個(gè)地區(qū)都有種植，而且擁有世界上最為豐富的種質(zhì)資源。蘿卜的類型十分多樣，可以根據(jù)葉形、根形、皮色肉質(zhì)色、栽培季節(jié)、用途等進(jìn)行分類，目前我國(guó)國(guó)家蔬菜種質(zhì)資源庫(kù)中保存的蘿卜種質(zhì)資源已超過2000份。

種質(zhì)資源是開展育種工作的基礎(chǔ)，只有充分了解蘿卜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，才能更有效地純化和利用種質(zhì)開展品種選育工作。早期對(duì)蘿卜種質(zhì)遺傳多樣性的分析方法是建立在形態(tài)水平上的，一般根據(jù)葉型、根形、根皮色、肉質(zhì)色、抗逆性、抗病性、風(fēng)味等可以測(cè)量、易于觀察的特征進(jìn)行分類。這類方法雖然相對(duì)簡(jiǎn)單、易于操作，但存在形態(tài)標(biāo)記數(shù)量較少且容易受環(huán)境條件、觀察者主觀因素等影響。之后，國(guó)內(nèi)學(xué)者采用生理生化水平的技術(shù)方法對(duì)蘿卜種質(zhì)資源進(jìn)行分析，如用同工酶、硫代葡萄糖苷等指標(biāo)作為標(biāo)記對(duì)來源于國(guó)內(nèi)外的種質(zhì)進(jìn)行分類。這類方法具有標(biāo)記指標(biāo)數(shù)量多、不易受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用到很多物種的遺傳多樣性研究中。

近年來，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，大量的分子標(biāo)記被開發(fā)出來，由于具有成本低、重復(fù)性好、標(biāo)記數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的種質(zhì)遺傳多樣性分析開始采用分子標(biāo)記。在蘿卜的相關(guān)研究中，較早應(yīng)用的是RAPD、AFLP等類型的標(biāo)記，但隨著標(biāo)記數(shù)量的增多和種類的豐富，SSR、ISSR等更易于操作的標(biāo)記已成為目前采用較多的標(biāo)記類型。國(guó)內(nèi)外已有利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蘿卜種質(zhì)資源親緣關(guān)系進(jìn)行分析的報(bào)道，但多是對(duì)不同種質(zhì)進(jìn)行分類或是對(duì)某一特定類型種質(zhì)進(jìn)行的分析，而且選用的種質(zhì)類型各不相同，材料數(shù)量也從幾份到幾十份不等，因此得到的結(jié)果并不完全一致。本研究用來源于國(guó)內(nèi)外不同國(guó)家和地區(qū)的108份蘿卜種質(zhì)為試材，對(duì)分布在整個(gè)基因組上的118個(gè)標(biāo)記進(jìn)行了篩選，獲得56個(gè)多態(tài)性好的標(biāo)記并用于分析蘿卜種質(zhì)的親緣關(guān)系，以期為更好地評(píng)價(jià)種質(zhì)資源、了解其遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)而指導(dǎo)品種選育工作提供數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及引物

1.1.1試驗(yàn)材料 本研究選用的108份不同類型蘿卜種質(zhì)（表1），包括綠皮綠肉類型30份、綠皮淡綠肉類型6份、綠皮白肉類型3份、心里美類型6份、紅皮白肉類型19份（其中2份為穿心紅類型）、淺紅皮白肉類型1份、黑皮白肉類型1份、白皮白肉類型34份、紅皮白肉類型櫻桃蘿卜6份、白皮白肉類型櫻桃蘿卜2份，均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所蘿卜課題組提供。所有種質(zhì)的種子經(jīng)催芽后，在鋪有濾紙的小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)（23℃，光周期為16 h光照/8h黑暗），待子葉完全展開時(shí)取樣，每份材料隨機(jī)從5個(gè)單株上摘取嫩葉，保存于-20℃冰箱備用。

1.1.2試驗(yàn)所用引物 本研究所用引物全部來源于蘿卜的參考基因組網(wǎng)站（http：//radish-ge-nome.org/），其中SSR引物27對(duì)，InDel引物80對(duì)，IBP引物11對(duì)。引物用無菌水稀釋到10μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取DNA，DNA提取質(zhì)量通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，DNA濃度利用紫外吸收法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)的濃度情況用ddH，0稀釋至10ng/μL，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

本研究所用PCR反應(yīng)體系總體積為10μL：2×Taq PCR Mix 5μL，正反向引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH20 3μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min;94。C變性30 s，55。C退火30 s，72℃延伸1min，25個(gè)循環(huán)：72℃充分延伸5 min;4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測(cè)。選擇條帶清晰、多態(tài)性好的標(biāo)記進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及后續(xù)分析。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果，選擇清晰且容易分辨的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶記為1，沒有條帶記為0，缺失條帶記為9，在Microsoft Excel 2013中記錄統(tǒng)計(jì)結(jié)果，建立所有材料的數(shù)據(jù)矩陣。使用DataFor-mater 2.7軟件對(duì)所建矩陣進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，利用POPGENE 1.31軟件計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)（N_a）、有效等位基因數(shù)（N_e）、Shannon多態(tài)性指數(shù)（I）和Nei遺傳多樣性指數(shù)（H），采用PIC_CALC 0.6軟件計(jì)算各標(biāo)記的多態(tài)信息量（ PlC）。

根據(jù)NTSYSpc 2.10軟件要求的格式將原始矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，并通過該軟件計(jì)算出所有種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)，利用SHAN程序中的Tree plot繪制關(guān)于材料遺傳距離的UPGMA（算術(shù)平均非加權(quán)配組法）聚類樹狀圖。利用Origin2019b程序進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2結(jié)果與分析

2.1分子標(biāo)記篩選分析

將所有標(biāo)記在108份蘿卜種質(zhì)中進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果挑選出帶型清晰、多態(tài)性好的分子標(biāo)記56個(gè)。這56個(gè)標(biāo)記在蘿卜基因組的每條染色體上都有分布，其中，8號(hào)染色體上的標(biāo)記數(shù)最少，只有3個(gè)；5號(hào)染色體上最多，有11個(gè)標(biāo)記（圖1）。

56個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出的條帶總數(shù)為130條，平均每個(gè)標(biāo)記2.3條：PIC值在0.29～0.55之間，高于0.50的標(biāo)記有3個(gè)，分別為RsIBP18、RsSSR109和RsIBP17：擴(kuò)增出條帶最多的標(biāo)記為RsSSR109，擴(kuò)增出5條帶；43個(gè)標(biāo)記（76.8%）只擴(kuò)增出2條多態(tài)性條帶，分別有9個(gè)和3個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出3條和4條多態(tài)性條帶，只有1個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出5條多態(tài)性條帶（表2）。

通過POPGENE 1.31軟件分析，108份蘿卜材料的觀測(cè)等位基因數(shù)平均值為2.3214，有效等位基因數(shù)平均值為1.8643，有效等位基因的比例為80.31%，Nei遺傳多樣性指數(shù)平均值為0.4573，Shannon多態(tài)性指數(shù)平均值為0.6766（表3）。

2.2遺傳多樣性分析

基于上述篩選得到的56個(gè)標(biāo)記，計(jì)算出108份蘿卜種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，遺傳距離的變化范圍為0.54～0.99，利用SHAN程序和UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖2）顯示，在相似系數(shù)為0.61處，可將108份蘿卜種質(zhì)分為4大類，第1類主要包括大、中型的綠蘿卜、白蘿卜和紅皮白肉的蘿卜材料，共94份；第2類包括6份綠皮紅肉的心里美類型種質(zhì)材料：第3類僅為1份黑皮白肉的黑蘿卜；第4類則是小型的櫻桃蘿卜類型，包含7份材料。

進(jìn)一步分析，在相似系數(shù)為0.677處可將第1類的94份材料分為8個(gè)亞類。A亞類包含材料最多，共有42份，約占供試材料總數(shù)的45%。在相似系數(shù)為0.71處，可進(jìn)一步將A亞類分為2個(gè)組，第1組包括27份材料，均為綠蘿卜類型（ 21份為綠皮綠肉、5份為綠皮淡綠肉、1份為綠皮白肉），除來源于烏茲別克斯坦的1份材料根形為圓形外，其余材料肉質(zhì)根均為長(zhǎng)圓柱、圓柱或短圓柱形，均來源于國(guó)內(nèi)，以山東為主：第2組的組成較為復(fù)雜，15份材料中有9份為紅皮白肉、5份為白蘿卜、1份為綠蘿卜，根形以圓柱和長(zhǎng)圓柱形為主，來源地也比較分散。B亞類共9份材料，除1份白蘿卜來源于日本，其余均為國(guó)內(nèi)的綠蘿卜種質(zhì)，根形包括圓形、短圓柱、圓柱和長(zhǎng)圓柱。C亞類的3份材料均為國(guó)內(nèi)的綠蘿卜，根形圓柱或長(zhǎng)圓柱形。D亞類為國(guó)內(nèi)的紅皮白肉蘿卜，全部是圓形。E亞類是2份山東的紅皮白肉的圓蘿卜材料。F亞類的2份材料是國(guó)內(nèi)的白蘿卜，肉質(zhì)根圓柱形。G亞類除了1份淺紅皮白肉的國(guó)內(nèi)種質(zhì)，其余均為白蘿卜，來源于國(guó)內(nèi)、韓國(guó)、日本和巴基斯坦，根形包括短圓柱、圓柱、長(zhǎng)圓柱和細(xì)長(zhǎng)圓柱形。H亞類是4份來自日本的細(xì)長(zhǎng)圓柱形的白蘿卜材料。

利用Origin 2019b對(duì)108份種質(zhì)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果（圖3）與UPGMA聚類分析結(jié)果基本一致，PC1、PC2和PC3所能解釋的遺傳變異分別為11.0%、9.3%和6.0%。值得注意的是，第1類中紅皮白肉的圓形種質(zhì)昆紅19與其他種質(zhì)距離較遠(yuǎn)，第2類中QY-3和QX-123這兩份圓柱形的心里美種質(zhì)與同類群的圓形心里美種質(zhì)距離較遠(yuǎn)。

3討論

了解種質(zhì)的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系有利于更好地對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)鑒定，并可為育種研究提供數(shù)據(jù)支持。相較于形態(tài)標(biāo)記和同工酶標(biāo)記等分析方法，分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、周期短、準(zhǔn)確度更高等優(yōu)點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的分子標(biāo)記在分析種質(zhì)遺傳距離時(shí)存在一定差異，采用多種標(biāo)記綜合分析可以使結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。本研究以分布在9條染色體上的118個(gè)分子標(biāo)記在108份蘿卜種質(zhì)中進(jìn)行篩選，得到56個(gè)多態(tài)性好的標(biāo)記，包括39個(gè)InDel標(biāo)記、11個(gè)SSR標(biāo)記和6個(gè)IBP標(biāo)記，PIC值在0.29～0.55之間，屬于中高度多態(tài)性標(biāo)記，符合篩選高質(zhì)量分子標(biāo)記的條件。這些標(biāo)記在每條染色體上都有分布，以5號(hào)染色體上最多（11個(gè)），8號(hào)染色體上最少（3個(gè)），這與每條染色體上開發(fā)出的標(biāo)記數(shù)量有很大關(guān)系。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，這些標(biāo)記的觀測(cè)等位基因數(shù)平均為2.3214，有效等位基因數(shù)平均為1. 8643，有效等位基因的比例為80.31%，與之前報(bào)道的利用ISSR和SSR標(biāo)記分析的結(jié)果相似：Nei基因多樣性指數(shù)的平均值為0.4573，Shannon多態(tài)性指數(shù)的平均值為0.6766，反映出本研究供試蘿卜種質(zhì)材料具有較高的遺傳多樣性。

在種質(zhì)分類方面，形態(tài)標(biāo)記與分子標(biāo)記具有一定的一致性。本研究供試的108份蘿卜種質(zhì)被分為4類，第1類主要是綠蘿卜、白蘿卜、紅皮蘿卜，第2類是心里美蘿卜，第3類是黑蘿卜，第4類是紅皮和白皮的櫻桃蘿卜。心里美材料、黑蘿卜材料和櫻桃蘿卜材料各自聚為一類，說明這三種類型材料間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。孔秋生等利用RAPD標(biāo)記對(duì)56份種質(zhì)的聚類分析結(jié)果也將1份心里美材料、1份黑蘿卜材料、8份櫻桃蘿卜材料各自聚為一類，與本研究結(jié)果一致。另外，本研究選用的108份材料中有6對(duì)雄性不育系及其保持系，聚類分析結(jié)果顯示，這6對(duì)材料中的01-11A/B、ZH-230A/B、TH-24A/B和KR-125A/B都與相同皮色、肉質(zhì)色的材料聚類在一起，并且雄性不育系及其對(duì)應(yīng)的保持系親緣關(guān)系最近；14青A/B和64A/B雖然沒有與大多皮色、肉質(zhì)色相同的材料聚在一起，但其不育系及保持系之間的親緣關(guān)系也是最近的。這也證明了本研究結(jié)果的可靠性。

關(guān)于決定蘿卜種質(zhì)親緣關(guān)系的關(guān)鍵因素，已有研究得到的結(jié)論并不完全一致，如Pradhan等利用RAPD標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，與按照地理起源進(jìn)行分類相比，按照表型對(duì)蘿卜進(jìn)行分類更可靠：孔秋生等通過AFLP標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，蘿卜肉質(zhì)根的根皮色是我國(guó)國(guó)內(nèi)種質(zhì)資源分類的重要參考因素；周娜等的研究則表明，與種質(zhì)資源親緣關(guān)系最密切的不是表型指標(biāo)，而是材料的來源地，其次才是根肉色。在本研究中，前3類是大中型蘿卜種質(zhì)，其分類與肉質(zhì)根皮色、肉質(zhì)色關(guān)系密切，第1類中的8個(gè)亞類也主要是皮色、肉質(zhì)色相同的種質(zhì)聚類較近：進(jìn)一步分析第1類的8個(gè)亞類可以發(fā)現(xiàn)，在確定皮色、肉質(zhì)色的前提下，種質(zhì)聚類也與根形有一定的聯(lián)系。A亞類和C亞類的綠皮綠肉種質(zhì)主要是長(zhǎng)圓柱和圓柱形，B亞類主要是圓柱、短圓柱和圓形；A亞類中的紅皮白肉種質(zhì)主要是長(zhǎng)圓柱、圓柱和短圓柱形，在D和E亞類中的則全部是圓形；F亞類中的2份白皮白肉蘿卜是圓柱形，G亞類中的白籮卜主要是長(zhǎng)圓柱形，H亞類中的是4份細(xì)長(zhǎng)圓柱形種質(zhì)。此外，第2類的6份心里美種質(zhì)也是按圓柱形和圓形分別聚在了一起。前人研究中也有類似報(bào)道，即扁圓形和長(zhǎng)圓柱形的白皮白肉種質(zhì)分別聚類。但將本研究所用種質(zhì)的來源地與聚類結(jié)果進(jìn)行聯(lián)系，并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律。對(duì)中、日、韓三個(gè)白蘿卜主產(chǎn)國(guó)的種質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，韓國(guó)種質(zhì)全部聚在第1類的G亞類，日本種質(zhì)全部在G亞類和H亞類，而中國(guó)的白蘿卜種質(zhì)在A、B、F、G四個(gè)亞類中都有分布，這在一定程度上反映了我國(guó)的種質(zhì)資源更為豐富。Kobayashi等的研究表明，韓國(guó)種質(zhì)均與中國(guó)種質(zhì)聚在一起，日本種質(zhì)雖與中、韓種質(zhì)有所重疊，但差異較大，這與本研究結(jié)果有一定的一致性。

4結(jié)論

綜合本研究結(jié)果，蘿卜種質(zhì)親緣關(guān)系與肉質(zhì)根皮色、肉質(zhì)色的聯(lián)系較密切，其次為根形。基于形態(tài)標(biāo)記的分類雖與分子標(biāo)記分類具有較高的關(guān)聯(lián)性，但由于受主觀判斷、生長(zhǎng)環(huán)境等因素影響，分類結(jié)果并不完全一致。因此，在實(shí)際育種工作中，育種者要想快速、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)種質(zhì)材料以充分利用雜種優(yōu)勢(shì)配置組合，應(yīng)當(dāng)在豐富的育種經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上適當(dāng)采用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助分析。