維生素B12檢測(cè)方法發(fā)展現(xiàn)狀研究

王玨

摘 要：維生素B12是人體內(nèi)一種重要的微量元素，其在人體新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于維生素B12本身結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，且含量較低，因此針對(duì)維生素B12檢測(cè)方法進(jìn)行分析具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文簡(jiǎn)單介紹了維生素B12的性狀及功能，綜述了維生素B12常用的檢測(cè)方法，比較分析了試劑盒法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定維生素B12的優(yōu)缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：維生素B12；檢測(cè)方法；研究進(jìn)展

Abstract： Vitamin B12 is an important trace element in the human body， which plays an important role in the metabolic process. Since the structure of vitamin B12 itself is complex and its content is low， it is of great practical importance to analyze vitamin B12 detection methods. This paper briefly introduces the properties and functions of vitamin B12， reviews the commonly used detection methods for vitamin B12， and compares and analyzes the advantages and disadvantages of the kit method and the national standard method for the determination ofvitamin B12.

Keywords： vitamin B12; detection method; research progress

維生素B12是B族維生素中的一類，其和人們的健康息息相關(guān)，通常以輔酶的形式參與人體各種代謝活動(dòng)，有促進(jìn)甲基形成、維持巰基還原狀態(tài)和促進(jìn)細(xì)胞成熟等多種功能。如果人體缺乏維生素B12將會(huì)引起神經(jīng)紊亂、心臟病甚至是癌癥等嚴(yán)重疾病，因此維生素B12受到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。但維生素B12在人體內(nèi)的含量很少，體外穩(wěn)定性較差，化合物組成復(fù)雜，對(duì)其進(jìn)行分析存在相當(dāng)?shù)碾y度。因此，選擇精準(zhǔn)且高效的維生素B12檢測(cè)方法也就顯得極為重要。

1 維生素B12性狀及功能

維生素B12（Vitamin B12），又名鈷胺素，是一種含鈷的咕啉類化合物的總稱，同時(shí)其也是人體內(nèi)唯一一種含有金屬元素的水溶性維生素，由Elders等人于1926年在使用肝浸膏治療惡性貧血癥時(shí)首次發(fā)現(xiàn)。維生素B12為紅色結(jié)晶體，其熔點(diǎn)較高（＞320 ℃），沒(méi)有特殊氣味，且易溶于水、乙醇、甲醇等溶液，但不溶于乙醚、丙酮等溶液。維生素B12溶于水后的水溶液呈現(xiàn)中性，且性狀表現(xiàn)穩(wěn)定，但在處于強(qiáng)酸（pH＜2）或者強(qiáng)堿（pH＞9）的環(huán)境中易分解。

維生素B12是一種結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的小分子，其化學(xué)分子式為CoC63H88O14N14P，相對(duì)分子質(zhì)量為1 355.38，呈類八面體結(jié)構(gòu)。一般來(lái)講，動(dòng)植物自身不具有合成維生素B12的能力，因此人類攝入的絕大部分維生素B12來(lái)源于肉類和海產(chǎn)品，而小部分的發(fā)酵食品也會(huì)含有少量的維生素B12。在自然界中，能夠生成維生素B12的主要是放線菌、細(xì)菌、米根霉菌等微生物。對(duì)于動(dòng)物來(lái)講，由于其腸道內(nèi)所共生的細(xì)菌種類較多，其中諸如干酪乳桿菌等具有合成維生素B12的能力，因此在這些細(xì)菌的作用下，動(dòng)物也能夠產(chǎn)生不同水平的維生素B12，以維持身體正常的代謝活動(dòng)。

2 維生素B12檢測(cè)方法

2.1 液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜質(zhì)譜法作為一種新興的分析檢測(cè)方法，它的出現(xiàn)為食品分析檢測(cè)技術(shù)提供了更為多元化的選擇。液相色譜-質(zhì)譜分析法將液相色譜所擁有的高效迅速以及質(zhì)譜所擁有的高靈敏度、強(qiáng)定性力等優(yōu)點(diǎn)有效結(jié)合起來(lái)，可以對(duì)多種不同的樣品開(kāi)展定性以及定量化分析。施煜等[1]采用液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料中維生素B12等維生素進(jìn)行了測(cè)量，樣品用水進(jìn)行超聲提取之后，采用ACQUITY HSS T3液相色譜柱分離，以濃度為0.1%的甲酸甲醇混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，相關(guān)系數(shù)＞0.999，回收率為90%～102.3%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法適用于對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料中所含維生素含量進(jìn)行測(cè)定。顧文等[2]采用UPLC-MS法對(duì)固體飲料中的維生素B12含量進(jìn)行測(cè)定，以醋酸為提取液，采用Strata C18固相萃取柱凈化并富集維生素B12，經(jīng)過(guò)洗脫定容之后再采用Agilent ZORBAXSB-Aq C18高效色譜柱分離，進(jìn)行定量檢測(cè)，研究結(jié)果表明采用該方法對(duì)維生素B12進(jìn)行檢測(cè)具有較高的精準(zhǔn)度和重現(xiàn)性。

2.2 微生物法

微生物法也是一種常見(jiàn)的維生素測(cè)定方法，主要利用維生素的特異性，在特定環(huán)境下對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，并利用微生物的新陳代謝來(lái)對(duì)維生素進(jìn)行測(cè)定。宴濤等[3]采用微生物法對(duì)功能性飲料中的維生素B12含量進(jìn)行了研究，利用萊士曼氏乳酸桿菌生長(zhǎng)速率與B12濃度的線性關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中B12的含量，相關(guān)系數(shù)為0.993，在0～0.1 ng，吸光度值與維生素B12含量呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。韓冀等[4]采用微生物法對(duì)寵物食品中的維生素B12進(jìn)行了測(cè)定，將均質(zhì)樣品加入50 mL無(wú)菌離心管中，然后加入40 mL去離子水，在95 ℃水浴中提取30 min，快速冷卻之后，用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾取濾液，經(jīng)過(guò)處理后采用微生物法進(jìn)行檢測(cè)，回收率為94.0%～106.0%；試驗(yàn)結(jié)果表明，采用微生物法對(duì)寵物食品中維生素B12含量進(jìn)行測(cè)定具有靈敏度高、精準(zhǔn)度較高的優(yōu)點(diǎn)。

2.3 分光光度法

采用分光光度法檢測(cè)維生素B12主要是利用維生素B12具有水溶性的特點(diǎn)，對(duì)紫外線有較強(qiáng)的吸收作用。采用分光光度法測(cè)定維生素B12具有靈敏度較高、操作簡(jiǎn)便以及使用成本較低的優(yōu)點(diǎn)。湯家華等[5]采用分光光度法對(duì)維生素B12中鈷的含量進(jìn)行了測(cè)定，將一定量的樣品溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，再依次向其中加入pH值為9.2的緩沖溶液2.0 mL、50 g·L-1?TritonX-100 2.0 mL、0.4 g·L-1 5-硝基水楊基熒光酮溶液1.0 mL，用超純水定容至刻度后，搖勻，然后在波長(zhǎng)為546 nm處檢測(cè)試樣的吸光度。研究結(jié)果表明，表觀摩爾吸光系數(shù)為3.7×104 L·mol-1·cm-1，RSD為2.2%，回收率為96%，滿足分析要求。

2.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法作為當(dāng)今一種重要的技術(shù)平臺(tái)，其具有高靈敏度、高分辨率以及高通量等優(yōu)點(diǎn)，使其成為檢測(cè)維生素B12時(shí)常用的一種方法。高效液相色譜法通常會(huì)采用C18色譜柱，用流動(dòng)相進(jìn)行洗脫完成對(duì)維生素B12的分離，因此該方法適用于對(duì)血液或者藥品中維生素B12進(jìn)行檢測(cè)。為有效降低高效液相色譜法檢測(cè)維生素B12的檢出限，研究人員開(kāi)發(fā)出了多種新型的前處理方法，提升了檢測(cè)的精準(zhǔn)度。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，液相色譜法被不斷優(yōu)化和改進(jìn)，并被廣泛應(yīng)用在了各種化合物的檢測(cè)中。何文等[6]采用高效液相色譜法對(duì)嬰幼兒乳粉中維生素B12含量進(jìn)行了測(cè)定，乳粉樣品經(jīng)過(guò)水溶解后，經(jīng)免疫親和柱凈化，進(jìn)行超聲提取、高速離心之后過(guò)濾，然后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，采用流動(dòng)相為甲醇溶液，色譜柱溫度為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為361 nm，采用外標(biāo)法對(duì)維生素B12開(kāi)展了定量分析。賀習(xí)文等[7]則采用磷酸鹽和甲醇的混合液作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為361 nm，對(duì)飼料中含有的維生素B12進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限為0.05 μg·mL-1，具有較高的檢測(cè)準(zhǔn)確度。

2.5 原子吸收光譜法

原子吸收光譜法也是一種十分重要的維生素B12檢測(cè)方法，其主要是利用維生素B12中所含有的配位金屬原色鈷，對(duì)鈷含量進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)行相應(yīng)的換算即可得出維生素B12的含量。用該方法來(lái)檢測(cè)維生素B12具有檢出限較低、靈敏度較高、重復(fù)性較強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于各種保健品以及嬰幼兒乳品中維生素B12含量的檢測(cè)。畢雪艷[8]采用火焰原子吸收法對(duì)維生素B12中鈷的含量進(jìn)行了測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為240.7 nm，乙炔流量為2.0 L·min-1。檢測(cè)結(jié)果表明，鈷濃度在一定范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回收率為98.8%，該方法測(cè)定維生素B12鈷含量具有靈敏度高、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)。

2.6 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法的應(yīng)用始于1980年代末期，是一種以高壓電場(chǎng)作為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管作為分離通道，結(jié)合樣品中各個(gè)組分之間淌度和分配行為上的不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的一種液相方法。毛細(xì)管電泳法具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于水溶性維生素的檢測(cè)。

2.7 化學(xué)發(fā)光法

從分類上來(lái)看，化學(xué)發(fā)光法屬于分子發(fā)光光譜分析法的一種，其主要是利用化學(xué)檢測(cè)體系中被測(cè)樣品濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系的原理，使用專業(yè)的儀器來(lái)對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行分析。因此，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)食品中維生素B12是以某些特定試劑能夠與維生素B12產(chǎn)生反應(yīng)發(fā)光為基礎(chǔ)的。朱金坤等[9]建立了一種新型毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)維生素B12，線性范圍為6×10-7～6×10-4 mol·L-1，RSD為2.4%，回收率為97%～106%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用該方法對(duì)維生素B12進(jìn)行檢測(cè)可以得出更為精準(zhǔn)、可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

2.8 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法是一種在免疫酶技術(shù)基礎(chǔ)上研發(fā)出的新型免疫測(cè)定技術(shù)，由瑞典學(xué)者Engvall等人于1971年首次提出，其主要原理是通過(guò)抗體和酶復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。李江等[10]采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)嬰幼兒配方奶粉中維生素B12含量進(jìn)行了檢測(cè)，采用60%的甲醇溶液來(lái)提取奶粉樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒標(biāo)板來(lái)包被有維生素B12的抗原，并讓其保持免疫活性，然后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)顏色變化的深淺來(lái)對(duì)維生素B12進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用該方法測(cè)定維生素B12的相關(guān)系數(shù)為99.7%，檢出限在3～243 μg·kg-1，具有較高的靈敏性和精準(zhǔn)度，且操作方法較為簡(jiǎn)單。

3 試劑盒法與國(guó)標(biāo)法測(cè)定維生素B12的比較

鑒于維生素B12具有不穩(wěn)定性，在對(duì)樣本進(jìn)行采集、轉(zhuǎn)移和存儲(chǔ)過(guò)程中要特別注意環(huán)境溫度和光照環(huán)境，并依據(jù)具體的保存條件在規(guī)定時(shí)間內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)前針對(duì)維生素B12含量進(jìn)行檢測(cè)的方法多種多樣，而在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中較為常見(jiàn)的兩種方法為國(guó)標(biāo)法和試劑盒法。余文[11]采用試劑盒法對(duì)嬰幼兒乳粉以及功能飲料中維生素B12的含量進(jìn)行了快速檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)優(yōu)化的試劑盒法能夠有效縮短實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間，且操作較為簡(jiǎn)單，將其和國(guó)標(biāo)法進(jìn)行比較，其具有精準(zhǔn)可靠、操作方便的特點(diǎn)。陳敏兒等[12]則比對(duì)了國(guó)標(biāo)法和試劑盒法測(cè)定維生素膠囊葉酸含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，國(guó)標(biāo)法和試劑盒法都具有較高的重復(fù)性，且兩種方法的相對(duì)偏差均小于4%。在精密度方面，國(guó)標(biāo)法的回收率保持在100%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2%～4%；試劑盒法的回收率則保持在78.5%左右，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差高于4%。由此可以看出采用試劑盒法檢測(cè)精準(zhǔn)度較低，但相較于國(guó)標(biāo)法，采用試劑盒法進(jìn)行檢測(cè)也有著操作步驟較為簡(jiǎn)單、污染概率較低以及方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。因此，在實(shí)際工作過(guò)程中，應(yīng)結(jié)合具體的檢測(cè)要求來(lái)選擇最為科學(xué)的方法。

4 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)今人們對(duì)于健康的關(guān)注程度越來(lái)越高，而維生素B12作為一種維持人體正常新陳代謝的重要有機(jī)化合物，必將會(huì)引起全社會(huì)的廣泛關(guān)注。雖然現(xiàn)如今針對(duì)維生素B12的檢測(cè)方法多種多樣，但每種方法都具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用領(lǐng)域，因此在實(shí)際使用過(guò)程中，也應(yīng)結(jié)合具體的檢測(cè)需求選擇最為合適的檢測(cè)方法。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，維生素B12的檢測(cè)方法將會(huì)朝著更加精準(zhǔn)、穩(wěn)定、快速、高效的方向發(fā)展。

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