小麥光溫敏雄性不育系BS237ω-黑麥堿基因克隆及序列分析

侯起嶺　楊衛(wèi)兵　婁紅耀　杜冰　高建剛　趙昌平　張風(fēng)廷　秦志列

關(guān)鍵詞：小麥：光溫敏雄性不育系：ω-黑麥堿：基因克?。盒蛄蟹治觯喝槊訛a

中圖分類號(hào)：S512.1：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2023） 03-0001-08

黑麥（Secale cereale L.）1R染色體短臂（1RS）取代普通小麥1B染色體短臂（1BS）形成的1BL/1RS易位系攜帶了抗葉銹、條銹和白粉病等優(yōu)良基因，具有抗性好、豐產(chǎn)性好、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，在育成的小麥品種中占有30％以上的比例。黑麥種子中的醇溶性儲(chǔ)藏蛋白被稱作黑麥堿（seca-lin），1RS的引入使編碼γ-黑麥堿和ω-黑麥堿的Sec-I位點(diǎn)進(jìn)入小麥基因組中，但同時(shí)也使其喪失了低分子量谷蛋白Clu-B3位點(diǎn)和小麥醇溶蛋白Gfi-B1位點(diǎn)，而黑麥堿不能補(bǔ)償因喪失低分子量谷蛋白亞基引起的谷蛋白聚合體數(shù)量減少，從而導(dǎo)致面團(tuán)吸水性增大、穩(wěn)定性和延伸性降低，小麥面團(tuán)加工品質(zhì)下降。1RS染色體上的ω-黑麥堿基因是導(dǎo)致小麥面團(tuán)加工品質(zhì)下降的重要原因之一。因此，充分了解小麥1BL/1RS易位系的ω-黑麥堿基因和蛋白的序列特征對(duì)改良小麥1BL/1RS易位系的加工品質(zhì)有重要意義。

ω-黑麥堿由1R染色體臂上的Sec-1位點(diǎn)控制，該位點(diǎn)由緊密連鎖的多個(gè)基因組成，ω-黑麥堿基因家族包含大約15個(gè)成員。ω-黑麥堿是與ω-醇溶蛋白相關(guān)的一類小單體蛋白（45～ 50kD），富含谷氨酰胺，幾乎不含有半胱氨酸，無法參與鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的形成。目前，許多ω-黑麥堿基因已經(jīng)陸續(xù)從黑麥、小黑麥和小麥1BL/1RS易位系中克隆出來，這些ω-黑麥堿基因的氨基酸序列均是保守的，由信號(hào)肽、N端區(qū)域、重復(fù)結(jié)構(gòu)域和C端區(qū)域組成。柴建芳等發(fā)現(xiàn)沉默ω-黑麥堿基因可以在不影響產(chǎn)量的前提下提高小麥1B/1R易位系的加工品質(zhì)。張士昌等利用低能N+離子束誘變1BL/1RS易位系小麥種子，篩選出了9個(gè)ω-黑麥堿基因Sec-1位點(diǎn)表達(dá)缺失的新的1BL/1RS易位系種質(zhì)。這些研究為改良小麥1BL/1RS易位系的加工品質(zhì)和創(chuàng)制新的小麥1BL/1RS易位系種質(zhì)提供了很好的思路。

乳糜瀉（celiac disease，CD）是一種由T-細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，是因攝入小麥、大麥或黑麥中的面筋蛋白而引發(fā)的慢性小腸炎癥性疾病，具有基因易感性。目前，已鑒定出的能夠誘發(fā)乳糜瀉疾病的小麥蛋白肽段主要分布在醇溶蛋白中，主要類型是α-、β-和γ-醇溶蛋白，ω-醇溶蛋白中也含有部分肽段。小麥上報(bào)道的與CD相關(guān)的表位有5個(gè)來自α-醇溶蛋白，8個(gè)來自γ-醇溶蛋白，3個(gè)來自ω-醇溶蛋白.還有2個(gè)來自LMW-GS，1個(gè)來自HMW-GS。四肽序列PSQQ、QQPY、SPQQ、QQQP和PQQP與一系列腹腔活性肽共同存在，是潛在的毒性抗原表位，其中PQQP在谷物ω-黑麥堿氨基酸序列的可變重復(fù)區(qū)分布廣泛，PSQQ和QQQP目前在貧硫醇溶蛋白中還沒有被發(fā)現(xiàn)。

BS237是北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所選育的骨干不育系，具有育性徹底、配合力高、抗性好、農(nóng)藝性狀優(yōu)良等特點(diǎn)，但其ω-黑麥堿基因的詳細(xì)信息尚未有研究。鑒于此，本研究以BS237為材料，通過PCR法獲得具有完整開放閱讀框的ω-黑麥堿基因的編碼區(qū)序列，并進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化分析，同時(shí)對(duì)ω-黑麥堿中可能存在的T-細(xì)胞免疫肽段識(shí)別分析，以期為雜交小麥1BL/1RS類型不育系加工品質(zhì)的分子改良和乳糜瀉疾病預(yù)防提供理論依據(jù)和參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用小麥不育系BS237由北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所提供，2022年6月從北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所順義基地（40°08′N，116°39′E）不育系繁殖圃收獲適量的BS237種子，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析使用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 將小麥種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，1周后取適量葉片，用CTAB法提取基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增 利用1RS特異引物Bmac0213-F/Bmac0213-R檢測BS237是否含有1RS片段，根據(jù)已注冊(cè)的ω-黑麥堿基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)可擴(kuò)增完整編碼區(qū)的引物ω-F／ω-R，詳見表1。

PCR反應(yīng)體系：2×Taq Plus Master Mix 10μL，引物（10μmol.L-1）各1μL，模板DNA 2μL，ddH，0補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性30 s;98℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；720C延伸10 min。所有引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。采用諾唯贊生物（Vazyme Biotech）公司的2xTaq Plus Mas-ter Mix高保真酶，按說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化及克隆測序 將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收目的條帶，與pEasy-Blunt Zero載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-Tl感受態(tài)（北京全式金生物技術(shù)有限公司），涂布于含Kan抗生素的LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取一定數(shù)量的單克隆，用M13引物進(jìn)行菌落PCR檢測，將陽性克隆送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.4序列分析與進(jìn)化分析 采用NCBI（ht-tps：//www.ncbi. nlm. nih. gov/）和DNAMAN軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)、拼接及翻譯。利用MegaX軟件（https：//www. megasoftware. net/）構(gòu)建neigh-bor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1 BS237的ω-黑麥堿基因的檢測、克隆及核苷酸序列分析

利用1RS特異引物Bmac0213-F/Bmac0213-R擴(kuò)增BS237的DNA，得到524 bp的特異性條帶（圖1A），說明BS237是1BL/1RS易位系。利用引物ω-F／ω-R對(duì)BS237的ω-黑麥堿基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到單一條帶（圖1B），對(duì)目的條帶進(jìn)行純化和克隆測序，共得到8個(gè)具有完整開放閱讀框的不同基因序列（由TBtools軟件預(yù)測），可編碼333～357個(gè)氨基酸殘基。NCBI BLAST分析表明：克隆獲得的8個(gè)序列與已知的ω-黑麥堿基因序列的相似度在91%～100%之間，推斷其為ω-黑麥堿基因家族。將這8個(gè)序列提交GenBank，獲得的登錄號(hào)分別為OK999982～OK999985和OK999987～OK999990，其中，OK999982的長度為1002 bp，OK999985的長度為1050 bp，其余6個(gè)序列的長度均為1074 bp（表2）。

2.2克隆基因的推導(dǎo)氨基酸序列分析

本研究把克隆出來的8個(gè)ω-黑麥堿蛋白序列與已知的小麥1BL/1RS易位系（AMD09626.1）、六倍體小黑麥（ACQ83629.1）和黑麥（ACQ83628.1）的ω-黑麥堿蛋白序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這8個(gè)蛋白的氨基酸序列結(jié)構(gòu)均具有ω-黑麥堿典型的分子結(jié)構(gòu)特征（圖2），即包含信號(hào)肽區(qū)（19個(gè)氨基酸）、N-端非重復(fù)區(qū)（12個(gè)氨基酸）、可變重復(fù)區(qū)和C-端非重復(fù)區(qū)（6個(gè)氨基酸）。與已知的ω-黑麥堿的核苷酸序列類似，本研究發(fā)現(xiàn)的8個(gè)序列在可變重復(fù)區(qū)富含谷氨酰胺（ glutamine，Q）、脯氨酸（pro-line，P）和苯丙氨酸（phenylalanine，F(xiàn)），但缺乏如半胱氨酸（cysteine，C）和甲硫氨酸（methionine，M）的含硫氨基酸：根據(jù)N-端非重復(fù)區(qū)起始3個(gè)氨基酸殘基的特性，這8個(gè)基因均屬于RQL型的ω-黑麥堿基因（表2）。

8個(gè)序列在N-端非重復(fù)區(qū)和C-端非重復(fù)區(qū)很保守，在信號(hào)肽區(qū)僅OK999984、OK999985和OK999987各存在1個(gè)氨基酸的替換，主要差異體現(xiàn)在可變重復(fù)區(qū)，且表現(xiàn)在氨基酸的替換和插入上（圖2）：OK999982與普通小麥1BL/1RS易位系中的ω-黑麥堿氨基酸序列（AMD0926.1）高度相似，只存在1個(gè)位點(diǎn)的氨基酸插入。其他7個(gè)序列與六倍體小黑麥的ω-黑麥堿氨基酸序列（ACQ83629.1）高度相似，其中，OK999983在1個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的插入，9個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的替換；OK999984在1個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的插入，4個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的替換：OK999985在1個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的插入，4個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的替換；OK999987在5個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的替換，在1個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的插入：OK999988在1個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的插入，在4個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的替換：OK999989在9個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的替換，在1個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的插入：OK999990在10個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的替換，在1個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸的插入。

2.3ω-黑麥堿基因的進(jìn)化分析

將克隆的ω-黑麥堿蛋白序列在NR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast，與GenBank中33個(gè)來自于9個(gè)物種具有完整編碼框的ω-黑麥堿蛋白、ω-醇溶蛋白和C-醇溶蛋白序列（表3）進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建最大似然（maximum likelihood）系統(tǒng)發(fā)生樹（圖3）。根據(jù)ω-醇溶蛋白和ω-黑麥堿蛋白序列的相似程度分成3類：Clade 1、Clade 2和Clade 3（圖3）。Clade 1包含12個(gè)普通小麥及其祖先種的ω-醇溶蛋白，其中5個(gè)為普通小麥（Triticum，aestivum， L.）ω-醇溶蛋白（ATY51568，AAG17702，AG220259，ATY51554，AG220255），1個(gè)為烏拉爾圖小麥（T.urartu）ω-醇溶蛋白（AKB95614），4個(gè)為尾狀山羊草（Aegilops markgrafii）ω-醇溶蛋白（AFV52225，AFV52226，AFV52227，AFV52228），2個(gè)為野生二粒小麥（T.dicoccoides）ω-醇溶蛋白（AKA88516，AKA88509）。Clade 2中除了本研究克隆的8個(gè)小麥ω-黑麥堿蛋白還包含17個(gè)來自小麥、小黑麥和黑麥的ω-黑麥堿蛋白，其中5個(gè)為小麥1BL/1RS易位系ω-黑麥堿蛋白（AMD09626， ACQ83636， ACQ83642， ACQ83637，AMD09620），4個(gè)為六倍體小黑麥（AABBRR）ω-黑麥堿蛋白（ACQ83629，ACQ83630，ACQ83631，ACQ83632），3個(gè)為八倍體小黑麥（AABBDDRR）ω-黑麥堿蛋白（ACQ83633，ACQ83634，ACQ83635），5個(gè)為黑麥（Secale cereale L.）ω-黑麥堿蛋白（ACQ83624，ACQ83625，ACQ83626，ACQ83627，ACQ83628）。Clade 3包含了4個(gè)大麥（Hordeum vulgare L.）C-醇溶蛋白（AAB28161，AFM77749，CAA42642，AAA92333）。

根據(jù)相似度高低，Clade 2可以進(jìn)一步分為4個(gè)亞組：Clade 2-1、Clade 2-2、Clade 2-3和Clade2-4。其中，Clade 2-1包含3個(gè)黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83626，ACQ83627，ACQ83628）和2個(gè)八倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83633，ACQ83635）。Clade 2-2包含3個(gè)本研究中克隆的ω-黑麥堿蛋白（OK999985，OK999988，OK999989），2個(gè)黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83624，ACQ83625）和1個(gè)六倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83630）；OK999985與黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83624，ACQ83625）聚類在一起，OK999988和OK999989與六倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83630）聚類在一起。Clade 2-3包含2個(gè)本研究中克隆的∞-黑麥堿蛋白（OK999983，OK999990），3個(gè)六倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83629，ACQ83631，ACQ83632），1個(gè)八倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83634）和3個(gè)小麥1BL/1RS易位系ω-黑麥堿蛋白（ACQ83636，ACQ83637，AMD09620）。Clade 2-4包含了3個(gè)本研究中克隆的ω-黑麥堿蛋白（OK999982，OK999984，OK999987），2個(gè)小麥1BL/1RS易位系ω-黑麥堿蛋白（AMD09626，ACQ83642）。

本研究克隆的8個(gè)ω-黑麥堿蛋白全部聚類在Clade 2中，與Clade 1中的普通小麥及其祖先種的ω-醇溶蛋白和Clade 3中的大麥C-醇溶蛋白不在同一類中，說明ω-黑麥堿基因與小麥族ω-醇溶蛋白基因和大麥C-醇溶蛋白基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在明顯的進(jìn)化關(guān)系，具有基因組特異性。通過進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)不同物種的ω-黑麥堿基因具有較高的同源性，8個(gè)ω-黑麥堿基因大部分與小麥1BL/1RS易位系、六倍體小黑麥的ω-黑麥堿基因具有較高的同源性，OK999985與黑麥的ω-黑麥堿基因具有較高的同源性。

2.4克隆基因的T-細(xì)胞免疫肽段識(shí)別分析

CD毒性肽的識(shí)別分析結(jié)果（圖2，表4）表明，ω-醇溶蛋白中已知的T-細(xì)胞免疫肽Gli-ωt（PQQPFPQQ）在克隆的8個(gè)ω-黑麥堿蛋白中均有4～6個(gè)拷貝的分布，Gli-ω1（ PFPQPQQPF）在除OK999984和OK999987外的6個(gè)（1）-黑麥堿蛋白中各有1個(gè)拷貝的分布，Gli-ω2（PQPQQPF-PW）在克隆的8個(gè)ω-黑麥堿蛋白中均沒有分布。γ-醇溶蛋白中已知的T-細(xì)胞免疫肽DQ2.5-glia-γ5（QQPFPQQPQ）在8個(gè)ω-黑麥堿蛋白中有2～3個(gè)拷貝的分布；DQ2.5-glia-γ4c（QQPQQPFPQ）除了在OK999990中沒有分布，在其余7個(gè)ω-黑麥堿蛋白中均有1個(gè)拷貝的分布。3個(gè)四肽T-細(xì)胞免疫肽（PQQP，QQPY，SPQQ）在8個(gè)ω-黑麥堿蛋白中均有分布，其中QQPY只有1個(gè)拷貝的分布，SPQQ有1～2個(gè)拷貝的分布，PQQP在8個(gè)ω-黑麥堿蛋白中分布數(shù)量較多，高達(dá)27～34個(gè)拷貝。

3討論與結(jié)論

通過對(duì)克隆的8個(gè)ω-黑麥堿基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)分析得出，8條序列在可變重復(fù)區(qū)富含谷氨酰胺、脯氨酸和苯丙氨酸，且谷氨酰胺：脯氨酸：苯丙氨酸大于5：4：1，這與小麥的ω-醇溶蛋白基因推導(dǎo)的氨基酸序列中的谷氨酰胺、脯氨酸和苯丙氨酸的比例不一樣（4：3：1）。谷氨酰胺的數(shù)量最多（124～133），在不同序列間變化較大；脯氨酸的數(shù)量次之（91～102），除OK999982數(shù)量較少（91）外，其他序列間數(shù)量變化較?。槐奖彼岬臄?shù)量最少（22～24），8個(gè)序列間差異不大，比較穩(wěn)定。8條序列中均不含有含硫氨基酸，沒有半胱氨酸和甲硫氨酸的分布，這與前人的研究結(jié)果一致，這種特有的序列特征表明ω-黑麥堿蛋白不能在自身內(nèi)部和其他蛋白質(zhì)形成鏈間連接，可能具有獨(dú)特的功能。

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)克隆的8個(gè)ω-黑麥堿基因在小麥1BL/1RS易位系、六倍體小黑麥、八倍體小黑麥和黑麥間存在高度同源性，表明該基因家族在黑麥R染色體或整個(gè)黑麥基因組與小麥或小黑麥基因組整合后變異較少，具有基因組特異性。

CD毒性肽的識(shí)別分析表明，有3個(gè)四肽T-細(xì)胞免疫肽（PQQP，QQPY，SPQQ）分布在8個(gè)ω-黑麥堿基因中，其中PQQP在每個(gè)基因的分布數(shù)量高達(dá)27～34個(gè)拷貝，這說明ω-黑麥堿基因可能是導(dǎo)致乳糜瀉癥狀發(fā)生的主要基因之一。在未來小麥育種中研究小麥1BL/1RS易位系的T-細(xì)胞免疫肽段類型、活性特點(diǎn)以及ω-黑麥堿與人類乳糜瀉癥狀之間的關(guān)系對(duì)優(yōu)質(zhì)小麥和優(yōu)質(zhì)雜交小麥選育具有重大意義。

可以通過操縱ω-黑麥堿基因已知的遺傳信息來降低其基因表達(dá)量，進(jìn)一步改善小麥1BL/1RS易位系的品質(zhì)。任燕等認(rèn)為反義RNA雖然可降低黑麥堿的表達(dá)量，但利用反義RNA去除由Sec-1位點(diǎn)產(chǎn)生的所有RNA來降低黑麥堿含量的方法可能難以實(shí)施。研究表明，可以通過降低或沉默ω-黑麥堿基因Sec-1位點(diǎn)的表達(dá)，創(chuàng)制Sec-1位點(diǎn)缺失的突變體或者利用RNA干擾或基因編輯技術(shù)降低甚至沉默∞-黑麥堿基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，在1RS末端導(dǎo)入Glu-B3和Gli-B1位點(diǎn)，可以改善1BL/1RS小麥面團(tuán)的加工品質(zhì)。育種過程中配置雜交組合時(shí)，如果親本有一個(gè)為非1BL/1RS易位系，含有1RS的雜交后代品質(zhì)受到的負(fù)面影響也可被掩蓋，用1BL/1RS易位系含有高分子量谷蛋白亞基5+10的品系制作的面包體積最大，面團(tuán)強(qiáng)度也最大。因此，往小麥1BL/1RS易位系導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)高分子量谷蛋白亞基或者與非1BL/1RS易位系雜交也可以改善小麥1BL/1RS易位系的加工品質(zhì)。

在雜交小麥優(yōu)質(zhì)不育系的選育過程中，應(yīng)該進(jìn)一步明確親本材料的遺傳背景，注重早代材料的鑒定，加強(qiáng)非1BL/1RS小麥易位系種質(zhì)資源的使用，還可以利用骨干不育系與優(yōu)質(zhì)小麥種質(zhì)資源多配置組合，逐步改良雜交小麥不育系的品質(zhì)特性。此外還可以通過創(chuàng)制Sec-1位點(diǎn)缺失的1BL/1RS小麥不育系來改良雜交小麥的加工品質(zhì)。

本研究從BS237中克隆了8個(gè)具有完整開放閱讀框的ω-黑麥堿基因，與前人研究結(jié)果相符。根據(jù)其N-末端序列的前3個(gè)氨基酸殘基的特點(diǎn)，這8個(gè)基因均屬于RQL類型；與已知基因的比對(duì)分析表明，不同ω-黑麥堿基因在N-端非重復(fù)區(qū)和C-端非重復(fù)區(qū)序列相對(duì)保守，在中間可變重復(fù)區(qū)存在氨基酸的替換和插入；進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，這8個(gè)ω-黑麥堿基因很保守，在黑麥R染色體或整個(gè)黑麥基因組與小麥或小黑麥基因組整合后變異較少，與小麥1BL/1RS易位系、六倍體小黑麥、八倍體小黑麥和黑麥間存在高度同源性，與小麥及其祖先種的ω-醇溶蛋白基因和大麥C-醇溶蛋白基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。CD毒性肽的識(shí)別分析表明，已知的分布于ω-醇溶蛋白中的T-細(xì)胞免疫肽Gli-ωt（PQQPFPQQ）、分布于γ-醇溶蛋白中的T-細(xì)胞免疫肽DQ2.5-glia-γ5（QQPF-PQQPQ）、3個(gè)四肽T-細(xì)胞免疫肽（PQQP，QQPY，SPQQ）在8個(gè)基因中均有分布，其中PQQP在每個(gè)基因分布的拷貝數(shù)高達(dá)27及以上，可能導(dǎo)致潛在的人類乳糜瀉毒性。