麗江百合組織培養(yǎng)及再生體系建立

劉晶榮 代思奇 劉才磊 向元芬 李意峰 潘遠智 賈茵

摘要 為我國特有易危種麗江百合（Lilium lijiangense）的種質(zhì)資源保護、快速繁殖及園林應用奠定基礎，以野生麗江百合鱗片為外植體，探究其最佳滅菌方法，鱗莖不同部位誘導不定芽的能力，以及不同植物生長調(diào)節(jié)劑對麗江百合愈傷組織及不定芽誘導、不定芽增殖、生根結(jié)鱗莖的影響。結(jié)果表明，麗江百合鱗片最佳滅菌方案為5% NaClO 8 min+75%乙醇30 s；鱗片分化能力為基部>中部>上部；愈傷組織和不定芽誘導最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最佳生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.01 mg/L IBA。該研究成功建立了一套適宜麗江百合的組織培養(yǎng)和再生體系。

關(guān)鍵詞 麗江百合；組織培養(yǎng)；再生體系；鱗片；快速繁殖

中圖分類號 S682.2+65 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2023）09-0038-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.010

Abstract In order to lay a foundation for the germplasm protection，rapid propagation and garden application of Lilium lijiangense，an endemic vulnerable species in China，this paper took the scales of wild L.lijiangense as explants，the best sterilization method，the ability of inducing adventitious buds in different scale parts，and the effects of different plant growth regulators on callus and adventitious bud induction，bud proliferation，rooting and buld proliferation of L.lijiangense were studied.The results were as follows：The best sterilization scheme was 5% NaClO 8 min+75% alcohol 30 s;The differentiation ability of scales was base>middle>upper; The best medium for callus and adventitious bud induction was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA; The best medium for adventitious bud proliferation was MS +1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA;The best rooting and bulb proliferation medium was 1/2MS+0.1mg/L NAA+0.01 mg/L IBA.Overall，a set of tissue culture and regeneration system suitable for L.lijiangense is successfully established.

Key words Lilium lijiangense;Tissue culture;Regeneration system;Scale;Rapid propagation

基金項目 大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（2121998000）；國家自然科學基金（32001356）。

作者簡介 劉晶榮（1999—），女，四川自貢人，從事園林植物資源與應用研究。*通信作者，副教授，博士，從事園林植物資源與應用研究。

百合（Lilium spp.）即百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物的統(tǒng)稱。百合花大姿麗，有色有香，具有很高的觀賞價值，適宜作切花、盆花、花壇、花境等，還具有食用和藥用價值［1］。百合屬原產(chǎn)于中國，主要分布在北半球的溫帶地區(qū)，如東亞、歐洲和北美。該屬植物約109種，中國有55種。麗江百合（L.lijiangense）為多年生球根花卉，分布于我國四川西部及云南西北部海拔3 300～3 400 m林下。其花序總狀，花漏斗形，花被片反卷，黃色，有紫色斑點，先端紅色，有極高的觀賞價值［2］。由于自然災害和人為破壞的影響，麗江百合自然條件下更新困難，野生資源十分稀少，已被列入《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》（IUCN）中［3］，屬易危種。因此對麗江百合資源開展保護和繁育研究迫在眉睫。

百合傳統(tǒng)的繁殖方法有分球繁殖、鱗片扦插和珠芽繁殖等［4］，存在繁殖系數(shù)較低、時間長、耗費勞動力、受限于當?shù)氐臍夂驐l件和地理位置等缺點［5］，這在一定程度上限制了麗江百合資源的保護和利用。植物組織培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相比具有繁殖系數(shù)高、周期短、不受季節(jié)和自然條件限制、便于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點被廣泛運用于百合的離體快速繁殖中［6］。目前，尚未見麗江百合離體再生和快繁體系構(gòu)建的報道。

筆者以野生麗江百合鱗片不同部位為外植體，選用不同的培養(yǎng)基，采用不同滅菌時間，通過培養(yǎng)基中加入不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，探究麗江百合鱗片最佳的滅菌時間組合；外植體最佳部位；培養(yǎng)基中6-BA、2，4-D、NAA等激素不同配比方式以及不同濃度對麗江百合不定芽和愈傷組織的影響；無菌苗繼代擴繁的最佳激素配比；麗江百合最佳生根培養(yǎng)基。最終利用組培快繁技術(shù)獲得麗江百合組培苗，建立完善的麗江百合再生體系，為該種質(zhì)的資源保護、育種及開發(fā)提供了有利的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和培養(yǎng)環(huán)境

以原產(chǎn)于四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣的野生麗江百合種球為材料，存放在濕潤的木屑中，放置于（4±1）℃冰箱中低溫保存。選取種球鱗片為外植體。

試驗于2020年10月至2021年10月在四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)（103°51′E，30°42′N）組織培養(yǎng)室進行。光照條件為2 000 lx，光照10 h/d，溫度控制在（25±1）℃，空氣相對濕度70%～80%。

1.2 培養(yǎng)基配方

啟動培養(yǎng)基為MS及1/2MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中均添加30 g/L 蔗糖和6.5 g/L 瓊脂，pH 5.8～6.0。預培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA。愈傷組織和不定芽誘導培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加1～2 mg/L 6-BA、0.1～0.5 mg/L NAA和1～2 mg/L 2，4-D。不定芽繼代增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加1～3 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA。生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加0.1 mg/L 6-BA和0～0.05 mg/L IBA。在121 ℃下高壓滅菌20 min。試驗設置3次生物學重復。

1.3 外植體消毒及接種

選取生長情況良好、健康、無病的鱗片，用洗潔精洗去表面污漬后置于燒杯中，用紗布封口，流水下沖洗3 h。在超凈工作臺上將鱗片用75%乙醇浸泡30 s，再用5% NaClO溶液處理6～10 min（表1），無菌水沖洗3～5次。消毒完畢后，將鱗片分割為0.5 cm×0.5cm小塊，接種于預培養(yǎng)基上。20 d后統(tǒng)計污染率。

1.4 鱗片不同部位外植體再生能力比較

取種球接近中心部位的鱗片按照約0.5 cm×0.5 cm的規(guī)格分割為上部、中部、基部3部分，分別接種在預培養(yǎng)基上（表2），進行鱗片不同部位不定芽誘導率的對比。25 d后統(tǒng)計鱗片再生情況。

1.5 愈傷組織和不定芽的誘導

將上述試驗所得最佳外植體部位接種在誘導培養(yǎng)基中。共設置9個處理（表3），30 d后統(tǒng)計誘導率。

1.6 不定芽的繼代增殖

將誘導得到的不定芽切割成單芽，接種于增殖培養(yǎng)基中（表4）。觀察30 d記錄生長情況。

1.7 生根結(jié)鱗莖培養(yǎng) 將株高3～4 cm生長健壯的麗江百合不定芽幼芽單個切下，接種于生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)基中（表5）。30 d后對組培苗的生根結(jié)鱗莖情況進行統(tǒng)計。

1.8 煉苗與移栽

當苗高5～6 cm、根長2～3 cm、根為乳白色至黃綠色時，將培養(yǎng)瓶置于室溫下，逐漸將封口膜打開，煉苗4～5 d。然后將苗小心取出，用自來水將根上培養(yǎng)基沖洗干凈，擦干。移栽到經(jīng)過50%赴美雙可濕性粉劑1∶500噴霧消毒的基質(zhì)中，基質(zhì)成分配比為珍珠巖∶營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1∶1 （V/V/V）。移栽60盆，每盆1株。移栽后澆透水，置于有散射光的陰涼處。7 d后進行正常光照和常規(guī)水肥管理，觀察40 d其生長情況。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)與繪圖；SPSS 22.0軟件進行One-Way ANOVA統(tǒng)計分析，采用Duncan方法進行多重比較及差異顯著性檢驗。

污染率=染菌數(shù)/接種總數(shù)×100%

成活率=成活數(shù)/接種總數(shù)×100%

繁殖系數(shù)=叢生芽數(shù)/接種總數(shù)

誘導率=出芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

增殖倍數(shù)=增殖芽數(shù)/接種總芽數(shù)

生根率=生根組培苗數(shù)/接種組培苗數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時間對外植體成活率及污染率的影響

由表1可知，使用5% NaClO不同滅菌時間處理下的外植體污染率和成活率有顯著差異。隨著滅菌時間的增加，外植體污染率逐漸下降，成活率則呈先增加后下降的趨勢。滅菌時間最短為6 min時，污染率最高，達76.67%；滅菌時間最長為10 min時，污染率最低，但成活率僅為10.00%；滅菌時間為8 min時，成活率最高，達63.33%，此時污染率為20.00%。因此，綜合外植體污染率與成活率，滅菌時間8 min最宜，在相對較少的染菌情況下，保證外植體最大的成活率和分化可能性。

2.2 鱗片不同部位外植體再生能力比較 由表2可知，麗江百合的同一種球鱗片上、中、基部分化能力不同，差異顯著。分化能力從上到下依次增強，基部的分化能力最強，其繁殖系數(shù)為3.67；上部的分化能力最弱，繁殖系數(shù)為1.20。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，鱗片基部和中部所分化不定芽較上部更為粗壯、硬挺，鱗片上部分化不定芽植株矮小纖細、脆而易碎。

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對麗江百合誘導愈傷組織和不定芽的影響

麗江百合種球鱗片接種后4 d，鱗片漸漸由白色轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙▓D1A）。19 d后，鱗片邊緣出現(xiàn)嫩綠色小凸起或黃白色愈傷組織。24 d后，原有凸起和愈傷組織的小凸起逐漸形成不定芽。由表3可知，處理④（2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）不定芽誘導率最高，為64.43%（圖1B），顯著高于其他處理；處理⑦（0.2 mg/L 6-BA+1 mg/L 2，4-D）不定芽誘導率最低，僅為2.23%（圖1C）。當NAA濃度不變時，改變6-BA（1～2 mg/L）濃度，誘導率隨著6-BA濃度的增加而上升。但當6-BA濃度為2 mg/L時，誘導率反而隨著NAA濃度的增加而下降。在進行麗江百合的組培時，可以適當增加6-BA濃度，相對減少2，4-D濃度，這樣更有利于愈傷組織和不定芽的誘導。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對麗江百合不定芽增殖的影響

單芽移栽到增殖培養(yǎng)基一段時間后，叢生芽增殖逐漸趨于平穩(wěn)（圖1D）。由表4可知，不同處理之間差異顯著，處理②（2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）增殖倍數(shù)最大（圖1E），為4.62；處理③（3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）增殖倍數(shù)最?。▓D1F），為1.84。由此可見，6-BA濃度變化對不定芽增殖影響很大，當6BA濃度為2.0 mg/L時不定芽增殖效果最佳。另外，過高的6-BA濃度（3.0 mg/L）會造成不定芽的干枯，長勢減弱。

2.5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對麗江百合組培苗生根結(jié)鱗莖的影響

不定芽接種10 d左右逐漸形成小鱗莖，15 d后開始生根并伴有鱗莖增殖。由表5可知，處理②（0.10 mg/L 6-BA+0.01 mg/L IBA）生根率（88.67%）和鱗莖增殖倍數(shù)（2.78）顯著高于其他處理，且鱗莖根部長勢也最佳，根莖粗壯，呈黃綠色（圖1G）；處理③（0.10 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA）鱗莖增殖倍數(shù)和生根情況最差，鱗莖增值倍數(shù)僅為處理②的0.44倍，生根率僅為處理②的0.35倍。表明麗江百合小鱗莖生根結(jié)鱗莖對IBA敏感，在一定范圍增加IBA濃度能夠促進生根數(shù)量和長勢，過量則會起到抑制作用。

2.6 試管苗移栽

將生根苗進行移栽，7 d后植株抽發(fā)新葉（圖1I），成活率可達95%。

3 結(jié)論與討論

研究表明，外植體生理狀態(tài)對組織培養(yǎng)起著關(guān)鍵作用，即便是同一百合種球的鱗片分化能力也存在差異，其鱗片產(chǎn)生愈傷組織或不定芽的能力從高到低依次為內(nèi)層、中層、外層［7］。該研究采用麗江百合內(nèi)層鱗片為外植體，避免了外層鱗片因衰老或損傷帶來的影響，有效地增加麗江百合分化可能性。該研究發(fā)現(xiàn)，麗江百合的鱗片上部、中部、基部分化能力也有差異，其中基部分化能力最強。外植體的部位與小鱗莖的發(fā)生之間有某種聯(lián)系，即肥厚的基部鱗片容易分化出小鱗莖，且繁殖系數(shù)顯著高于其他部位，這與王愛勤等［8］關(guān)于百合鱗片的研究結(jié)果一致。

在消毒過程中，NaClO的使用時間是關(guān)鍵。該研究采用5個不同消毒時間進行對比，當消毒時間為6 min時，污染率達76.67%，而當消毒時間為10 min時，污染率僅為3.33%。在污染率高的處理中，麗江百合鱗片幾乎不能存活。這說明微生物在培養(yǎng)基中繁殖生長會嚴重影響離體培養(yǎng)材料的生長甚至存活，這與柯義強等［5］在蘭州百合（L.davidii var.willmottiae）中的研究結(jié)果一致。當消毒時間超過8 min時（8～10 min），雖然污染率大大下降，但同時鱗片成活率以及產(chǎn)生不定芽的能力也隨之而降低。這證明NaClO在一定時間范圍對麗江百合的消毒有效，當超過時間限度時，便會對鱗片和不定芽產(chǎn)生毒害作用，這與Luis等［9］在洋蔥（Allium cepa）組培中的研究結(jié)果一致。

在進行不定芽誘導時，通常將生長素類（NAA和2，4-D）與細胞分裂素類（6-BA）搭配使用［10］。但進行不同的百合組培時，濃度比例有較大差別［11-14］。當6-BA濃度為2 mg/L時，誘導率隨著NAA濃度的增加而下降，從64.43%（0.1 mg/L NAA）下降到37.77%（0.5 mg/L NAA）。即在6-BA處于較高濃度時，低濃度NAA有利于不定芽誘導。這可能是過量生長素會引起乙烯生成，從而抑制了不定芽的誘導［15］。該研究中6-BA與2，4-D搭配也具有誘導效果，但沒有前者顯著，所以不予考慮。麗江百合的鱗片誘導過程中，鱗片易直接生長不定芽，較少部分先產(chǎn)生愈傷組織，再由愈傷組織進一步分化得到不定芽和小鱗莖，這與張文婷等［16］在金黃花滇百合（L.bakerianum var.aureum）組培中結(jié)果相反。這可能是鱗片周圍的愈傷組織導致輸導組織運輸不暢，影響組培苗生長［17］。由此可知，麗江百合的再生可直接采用鱗片進行不定芽分化，此途徑較使用愈傷組織進行分化更為方便快捷。

在生根和鱗莖增殖階段，一定濃度范圍內(nèi)的IBA對鱗莖生根具有促進作用，但當濃度超過一定限度時，IBA會加快百合根部老化，根的生長便受到了抑制，這與張彥妮等［18］研究結(jié)果一致。此外，與韋海忠等［19］關(guān)于不同生根培養(yǎng)基對野生百合生根影響的研究有所不同的是，在麗江百合生根培養(yǎng)基中未添加活性炭。該研究的預試驗發(fā)現(xiàn)，添加活性炭的試管苗皆出現(xiàn)葉片發(fā)白及植株枯萎的現(xiàn)象。活性炭不僅不能促進生根，反而明顯地抑制生根，分析原因可能是活性炭吸附了培養(yǎng)基中的生長素［20］。

該研究以麗江百合鱗片為外植體，120 d可完成不定芽及愈傷組織誘導、增殖、生根、煉苗、移栽等過程，最終成功實現(xiàn)麗江百合組織培養(yǎng)以及再生體系的建立，獲得大量健康的組培苗。與自然繁殖相比，該研究大大提高了其繁殖系數(shù)，為麗江百合種質(zhì)資源保護、遺傳育種及園林應用奠定基礎。

參考文獻

［1］ AZERI F N，ZTRK G.Microbulb and plantlet formation of a native bulbous flower，Lilium monodelphum M.Bieb，var.Armenum，through tissue culture propagation［J/OL］.Biotechnology reports，2021，32［2022-02-15］.https：//doi.org/10.1016/j.btre.2021.e00665.

［2］ 彭隆金.云南百合一新種［J］.云南植物研究，1984，6（2）：189-191.

［3］ 中國珍稀瀕危植物信息系統(tǒng)（ISCREP）［DB/OL］.［2022-02-15］.http：//www.iplant.cn/rep/prot/Lilium%20lijiangense.

［4］ 朱立，儲蓉，周艷，等.貴陽地區(qū)幾種百合引種栽培試驗研究［J］.種子，2010，29（8）：120-121.

［5］ 柯義強，郭鵬輝，馬洪鑫，等.蘭州百合組培快繁體系的構(gòu)建［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2020，32（6）：1000-1008.

［6］ BAKHSHAIE M，KHOSRAVI S，AZADI P，et al.Biotechnological advances in Lilium［J］.Plant cell reports，2016，35（9）：1799-1826.

［7］ 王剛，杜捷，李桂英，等.蘭州百合和野百合組織培養(yǎng)及快速繁殖研究［J］.西北師范大學學報（自然科學版），2002，38（1）：69-71.

［8］ 王愛勤，何龍飛，溫慶蘭，等.百合組培中鱗片處理及其顏色變化與鱗莖形成的關(guān)系［J］.園藝學報，2004，31（1）：117-119.

［9］ LUIS A C V，JOS L C G，LUIS F V M，et al.Cytotoxic effect of sodium hypochlorite （NaClO） in apical cells of onion roots （Allium cepa L.）［J］.Revista colombiana de ciencias hortícolas，2017，11（1）：97-104.

［10］ 張旭紅，王頔，梁振旭，等.歐洲百合愈傷組織誘導及植株再生體系的建立［J］.植物學報，2018，53（6）：840-847.

［11］ 孫君社，方曉華.植物激素對百合鱗片愈傷組織生長的影響［J］.中國農(nóng)業(yè)大學學報，2001，6（2）：58-61.

［12］ 李鶯，李星，李生玲，等.‘黃天霸’百合花器官愈傷組織誘導及植株再生［J］.熱帶作物學報，2013，34（8）：1507-1512.

［13］ 田山君，裴蕓，牛力立，等.卷丹百合脫毒與快繁技術(shù)研究［J］.種子，2020，39（5）：157-162.

［14］ 潘理云，張海洋.宜興百合組培快繁技術(shù)的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（10）：5748-5750.

［15］ VAN AARTRIJK J，BLOMBARNHOORN G J，BRUINSMA J.Adventitious bud formation from bulbscale explants of Lilium speciosum Thunb.in vitro effects of aminoethoxyvinyl-glycine，1aminocyclopropane1carboxylic acid，and ethylene［J］.Journal of plant physiology，1985，117（5）：401-410.

［16］ 張文婷，何燕紅，舒寧，等.金黃花滇百合植株再生與離體快繁技術(shù)體系的建立［J］.植物學報，2019，54（6）：773-778.

［17］ 崔祺，賈桂霞.3種百合組培快繁體系的優(yōu)化［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2014，40（6）：621-626.

［18］ 張彥妮，李文英.百合屬‘普瑞頭’的組織培養(yǎng)和快速繁殖［J］.草業(yè)科學，2012，29（7）：1077-1083.

［19］ 韋海忠，潘麗芹，任歡，等.不同生根培養(yǎng)基對野生百合生根影響的研究［J］.分子植物育種，2017，15（12）：5148-5154.

［20］ 王喬春.影響梨砧木BP10030試管苗生根的因素［J］.國外農(nóng)學（果樹），1991（4）：7-8.