分光光度法測(cè)定三角梅花中黃酮含量

摘 要 以蘆丁為對(duì)照，采用分光光度法對(duì)福建省漳州市三角梅花中黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在510 nm處吸收值最大，其濃度同吸光值間線(xiàn)性關(guān)系良好（R2=0.999 8）；1 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量為2.40%；該法在數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性上有較好表現(xiàn)（RSD=1.10%）。分光光度法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、簡(jiǎn)便可行，可用于三角梅花中黃酮含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 三角梅花；分光光度法；黃酮；福建省漳州市

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.22.013

三角梅屬紫茉莉科葉子花屬木本植物，其花具有花量大、色澤鮮艷、花期長(zhǎng)等特點(diǎn)。2018年，我國(guó)三角梅種植規(guī)模為2.00萬(wàn)hm2左右，其中僅福建省漳州市就有0.13萬(wàn)hm2以上，年產(chǎn)值超過(guò)15億元，成為全國(guó)最大的三角梅產(chǎn)銷(xiāo)中心之一[1]。黃酮類(lèi)化合物大多具有顏色，是植物的主要活性成分之一，其基本結(jié)構(gòu)是C6-C3-C6。黃酮類(lèi)化合物具有很高的藥用價(jià)值，可以防治心腦血管疾病、降低血脂和膽固醇、抗氧化和清除自由基、抗菌、抗腫瘤等[2]。三角梅可入藥，有調(diào)和氣血，治白帶、調(diào)經(jīng)的功效，光照不足，三角梅易落葉衰枯，作為廢棄物丟棄，不僅浪費(fèi)資源，還會(huì)造成環(huán)境污染。因此，充分挖掘三角梅花的應(yīng)用潛力，加大對(duì)三角梅的開(kāi)發(fā)利用，不僅可以增加三角梅的附加值，還可以達(dá)到合理利用資源、減少環(huán)境污染的目的。徐夙俠等人在花粉和花粉透鏡管內(nèi)測(cè)定了黃酮醇的積累，并采用毛細(xì)管電泳分析了3種白花三角梅品種中的類(lèi)黃酮[3-4]。黃瑩等人采用紫外分光光度法測(cè)定了野壩子中的總黃酮，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于野壩子中總黃酮的含量測(cè)定[5]。梁愛(ài)軍提出以5%NaNO2-10%Al（NO3）3-4%NaOH為顯色體系測(cè)定沙棘葉總黃酮的優(yōu)化方法[6]。羅序燕等人研究表明測(cè)定黃酮類(lèi)化合物的方法主要包括分光光度法、熒光光度法、液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等[7]。筆者在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用分光光度法測(cè)定漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)三角梅花中黃酮含量，為福建省漳州市三角梅產(chǎn)業(yè)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料：無(wú)水乙醇（EA）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁[Al（NO3）3]和氫氧化鈉（NaOH）均為國(guó)產(chǎn)分析純，蘆丁對(duì)照品（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號(hào)C10819709）；實(shí)驗(yàn)用水：蒸餾水；實(shí)驗(yàn)用三角梅花：取自漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院。

試驗(yàn)儀器：GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FW-400A高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；UV-1801紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[翱藝儀器（上海）有限公司]；FA2204電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；HH-S218數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 三角梅花待測(cè)液制備

用蒸餾水將三角梅花洗凈并于105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干4 h后，放入粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩得三角梅花粉末，備用。稱(chēng)取一定量三角梅花粉末放入150 mL圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入50 mL 75%乙醇溶液或無(wú)水乙醇，在70 ℃恒溫水浴1 h，靜置并經(jīng)定量濾紙過(guò)濾，過(guò)濾后的三角梅花濾液備用。

1.2.2 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取105 ℃干燥后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品75.0 mg，用無(wú)水乙醇溶解，置于250 mL容量瓶中，定容至刻度線(xiàn)，配成300 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL，采用5%NaNO2-10%Al（NO3）3-1 mol·L-1NaOH顯色，在470～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定溶液的吸光值。結(jié)果顯示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在510 nm處有最大吸收值，因此，選擇510 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.4 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測(cè)定黃酮含量

取2.0 mL待測(cè)液置于10 mL比色管中，再依次添加濃度為30%的乙醇至5.0 mL，加入0.5 mL 5%的NaNO2，搖勻靜置6 min，再加入0.5 mL 10%的Al（NO3）3，搖勻靜置6 min，再添加2 mL 1 mol·L-1的NaOH，搖勻，繼續(xù)添加30%的乙醇至10 mL，靜置5 min。置于510 nm吸光度下進(jìn)行比色，測(cè)定吸光值。

1.3 方法學(xué)考察

分別從線(xiàn)性關(guān)系、重復(fù)性、加標(biāo)回收率等方面對(duì)1.2.4項(xiàng)下的方法進(jìn)行方法學(xué)考察。

1.3.1 線(xiàn)性試驗(yàn)

分別精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL比色管中，按照1.2.4中NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測(cè)定黃酮含量方法，測(cè)定吸光值。以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，所測(cè)得的吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程為

Y=0.001 3X+0.000 3，R2=0.999 8

本試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果與李世燕等人在分光光度法測(cè)定毛酸漿果中總黃酮含量研究中的R2=0.999 5相比，相關(guān)性較高[8]。因此，該分光光度法具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，可用來(lái)測(cè)定三角梅花中黃酮含量。

1.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取1 g左右過(guò)篩后的三角梅花粉末，按照1.2.1項(xiàng)下方法制備待測(cè)液，平行制備3份，其余同1.2.4項(xiàng)下的操作，測(cè)定吸光值，計(jì)算RSD。

1.3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

第1組是取6個(gè)150 mL圓底燒瓶，其中3個(gè)圓底燒瓶為全程空白樣，剩余3個(gè)圓底燒瓶為加標(biāo)回收樣，往3個(gè)加標(biāo)回收樣中分別加入1 mL濃度為300 μg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，再往6個(gè)圓底燒瓶中分別加入50 mL 75%乙醇溶液，在70 ℃恒溫水浴1 h，靜置后備用，其余同1.2.4項(xiàng)下的操作，測(cè)定6個(gè)待測(cè)樣的吸光值；第2組是將第1組中往6個(gè)圓底燒瓶中分別加入的50 mL 75%乙醇溶液替換成50 mL無(wú)水乙醇，僅替換提取液，其余步驟均相同；上述兩組實(shí)驗(yàn)中加標(biāo)回收樣的黃酮含量與全程空白樣的黃酮含量二者差值的絕對(duì)值即為黃酮增量。黃酮增量與所加入的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中的蘆丁含量的比值即為加標(biāo)回收率。各回收率取平均值，計(jì)算RSD。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究中單位質(zhì)量樣品的黃酮含量（%）計(jì)算公式如下：

式中，C為單位質(zhì)量樣品的黃酮含量，%；X為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查的蘆丁含量，μg；W為樣品質(zhì)量，g。

所有數(shù)據(jù)、表格均采用Excel 2010進(jìn)行整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角梅花粉末量對(duì)黃酮含量的影響

分別稱(chēng)取1.008 4、1.007 6、1.004 0、2.009 1、2.007 2、2.003 6 g三角梅花粉末于150 mL圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入50 mL 75%乙醇溶液，在70 ℃恒溫水浴1 h，靜置并過(guò)濾的待測(cè)液按照1.2.4項(xiàng)下的操作測(cè)定吸光值，測(cè)得三角梅花中黃酮含量分別為2.39%、2.38%、2.43%、2.27%、2.23%、2.22%。結(jié)果表明，采用1 g左右的三角梅花粉末測(cè)試所得的黃酮平均含量為2.40%，采用2 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量為2.24%?？梢?jiàn)，在相同的提取和反應(yīng)條件下，2 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量小于1 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量。

2.2 提取液乙醇濃度對(duì)黃酮含量的影響

分別稱(chēng)取1.001 2、1.005 6、1.007 8 g的三角梅花粉末于150 mL 圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入50 mL無(wú)水乙醇溶液，在70 ℃恒溫水浴1 h，靜置并過(guò)濾后的待測(cè)液按照1.2.4項(xiàng)下的操作測(cè)定吸光值，測(cè)得三角梅花中黃酮含量分別為0.773%、0.787%、0.795%。結(jié)果表明，采用1 g左右的三角梅花粉末進(jìn)行測(cè)試，用無(wú)水乙醇提取的黃酮平均含量為0.785%，遠(yuǎn)低于用75%乙醇溶液提取的黃酮平均含量2.40%?？梢?jiàn)，三角梅花粉末重量和反應(yīng)條件不變的情況下，提取液乙醇濃度會(huì)影響三角梅花中黃酮的含量，采用無(wú)水乙醇提取液所提取出的黃酮含量比用75%乙醇溶液所提取出的黃酮含量少。

2.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度分析

重復(fù)性試驗(yàn)表明，采用1 g左右的三角梅花粉末，測(cè)得平均吸光值為1.257，平均含量為2.40%，RSD為1.10%，說(shuō)明該方法重復(fù)性較好，與鄭凱等人所驗(yàn)證的應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定刺葡萄葉片總黃酮含量擁有較好的重復(fù)性和精密性結(jié)論一致，也進(jìn)一步證明采用分光光度法測(cè)定植物中黃酮含量的可行性[9]。

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)分析

加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，各加標(biāo)回收率分別為82.0%、82.7%、87.3%、92.7%、87.3%、92.0%。采用提取液為75%乙醇溶液試驗(yàn)所得的加標(biāo)回收率平均值為84.0%，RSD為3.43%，與王麗麗等人研究的分光光度法測(cè)定茶葉中總黃酮含量的加標(biāo)回收率84.35%接近，二者均高于郭麗冰等人的研究結(jié)果78.49%，說(shuō)明此試驗(yàn)的加標(biāo)回收情況較好[10-11]。采用提取液為無(wú)水乙醇試驗(yàn)所測(cè)得的加標(biāo)回收率平均值為90.1%，RSD為3.21%，相較而言，提取液乙醇純度高的空白試樣加標(biāo)回收率更高。

3 結(jié)論

采用分光光度法對(duì)福建省漳州市三角梅花中黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在510 nm處有最大吸收值，測(cè)試1 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量為2.40%，而測(cè)試2 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量為2.24%；相同重量的三角梅花粉末和反應(yīng)條件下，提取液乙醇的濃度會(huì)影響三角梅花中黃酮含量，采用無(wú)水乙醇提取液所提取出的黃酮含量比75%乙醇溶液所提取的少。

試驗(yàn)過(guò)程中所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程內(nèi)R2為0.999 8，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系；在重復(fù)性試驗(yàn)中，RSD為1.10%，可見(jiàn)NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測(cè)定黃酮含量具有較高精密性；提取液為75%乙醇溶液的加標(biāo)回收率平均值為84.0%，加標(biāo)回收率較高。通過(guò)此法對(duì)漳州市三角梅花中黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，有助于進(jìn)一步拓展三角梅花的應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：張春雨）