溫度脅迫對(duì)黑木耳菌絲相關(guān)酶活性的影響*

劉巖巖，李 紅，王 紅，趙玉梅，曹 君，劉 賀，劉俊杰**

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.撫順市先進(jìn)裝備制造業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心，遼寧 撫順 113000；3.撫順市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)及扶貧開(kāi)發(fā)促進(jìn)中心，遼寧 撫順 113000）

黑木耳（Auricularia auricularia）隸屬擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）木耳目（Auriculariales）木耳科（Auriculariale）木耳屬（Auricularia）[1]，屬于中溫型菌類(lèi)。其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所需的鐵、鈣、蛋白質(zhì)、維生素、碳水化合物、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，不僅具有食用價(jià)值，還有較高的藥用價(jià)值。中醫(yī)認(rèn)為黑木耳具有清肺、益氣、治療痔瘡的功效，早在《本草綱目》中就有記載木耳性平、味甘，輕身強(qiáng)志，益氣不饑。現(xiàn)已有研究證明，黑木耳粉對(duì)因二氧化硅粉塵吸入導(dǎo)致的矽肺病有一定的抑制作用。黑木耳多糖有抑菌、抗氧化、預(yù)防心血管相關(guān)疾病等多種醫(yī)藥功效[3]。

中國(guó)為全球黑木耳栽培、出口第一大國(guó)，栽培量占全世界的95%以上[4]。黑木耳栽培方法受地域、氣候等因素影響而有不同，獲得的子實(shí)體在品質(zhì)和產(chǎn)量上也存在較大差異。目前，國(guó)內(nèi)大面積人工栽培的黑木耳，大多采用袋料式栽培，此種方式因栽培周期短、產(chǎn)量高而優(yōu)勢(shì)突出，現(xiàn)已成為其人工栽培的主要方式。在食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中因光照、溫度、濕度等環(huán)境因素不同，其品質(zhì)和產(chǎn)量會(huì)受到影響[5]。黑木耳是中溫型食用菌品種，菌絲體在5～35 ℃條件下均可以正常生長(zhǎng)[6]。

利用人工袋料栽培黑木耳雖然歷史較長(zhǎng)、經(jīng)驗(yàn)豐富，但由于栽培者技術(shù)水平和管理理念的不同，導(dǎo)致獲得的收益千差萬(wàn)別。全光照露地栽培管理方式較為傳統(tǒng)，由于目前還不能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化管控，栽培期間常出現(xiàn)菌包燒熱等現(xiàn)象，導(dǎo)致菌絲體生理及子實(shí)體農(nóng)藝性狀發(fā)生改變，影響黑木耳的產(chǎn)量和品質(zhì)。劉秀明等[7]在溫度脅迫12 h 和24 h 內(nèi)，對(duì)白靈側(cè)耳[Pleurotus nebrodensis（Inzenga）Quél.]菌絲中3 種保護(hù)酶的活性進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶SOD（Super oxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化物酶POD（Peroxidaseoxide dismutase，POD）活性迅速提高，隨后下降；在整個(gè)脅迫過(guò)程中過(guò)氧化氫酶CAT（Catalase，CAT）活性一直處于較高水平。閆靜等[8]對(duì)秀珍菇（Pleurotus geesteranus）的研究發(fā)現(xiàn)，在同一溫度條件下，隨著菌絲培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外羧甲基纖維素酶CMC（Carboxymethyl cellulase，CMC）、半纖維素酶（Hemicellulases）、濾紙纖維素酶FPA（FibrinopepideA，F(xiàn)PA）和淀粉酶AMY（Amylase，AMY）4 種胞外酶活性增強(qiáng)，而胞外漆酶LC（Laccases，LC）活性有所下降。處理溫度越低，漆酶活性越低，胞外5 種酶的活性總體呈先升后降的趨勢(shì)。韓增華等[9]發(fā)現(xiàn)不同品種的黑木耳菌種中漆酶和多酚氧化酶PPO（Polyphenol oxidase，PPO）活性的變化趨勢(shì)大致相同，酶活性變化與產(chǎn)量呈正相關(guān)。不同種類(lèi)的食用菌，菌落形態(tài)不相同，菌絲在受到高溫脅迫后，應(yīng)激反應(yīng)也不相同[10]。

上述研究證明，在食用菌栽培過(guò)程中，溫度是影響食用菌生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，不同食用菌品種或同種食用菌，不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)溫度的要求也不相同。不同溫度對(duì)食用菌酶活性的影響都是菌絲體適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果[11]，菌絲只有在適宜的溫度范圍內(nèi)，才能進(jìn)行正常的新陳代謝。包括食用菌在內(nèi)的多種生物體，在高溫脅迫下，活性氧氧化生物膜會(huì)產(chǎn)生多種不飽和醛酮產(chǎn)物使蛋白質(zhì)變性，并且破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，對(duì)菌絲具有傷害作用，使其生理紊亂。

在生理學(xué)中高溫脅迫對(duì)生物產(chǎn)生的影響是非常重要的研究課題。

通過(guò)對(duì)黑木耳菌株進(jìn)行一定時(shí)間的高溫脅迫后，測(cè)定黑木耳營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期菌絲中丙二醛MAD（malondialdehyde， MAD）的含量， SOD、PPO、CAT、谷胱甘肽還原酶GR（glutathione reductase，GR）等的活性及子實(shí)體的農(nóng)藝性狀，探討黑木耳對(duì)溫度脅迫的生理反應(yīng)，為溫度控制、品種選育和栽培技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)手段和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及來(lái)源供試菌種黑木耳“沈8-9”，為遼寧省主栽品種之一，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯、20 g 葡萄糖、3 g磷酸二氫鉀、1.5 g 蛋白胨、1.5 g 硫酸鎂、15 g 瓊脂粉、1 000 mL 純凈水，pH 自然。

液體培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯、20 g 葡萄糖、3 g磷酸二氫鉀、1.5 g 蛋白胨、1.5 g 硫酸鎂、1 000 mL純凈水，pH 自然。

栽培袋培養(yǎng)基：木屑85%、麥麩12%、石膏1%、豆面2%，pH 為7.5。

1.1.3 檢測(cè)試劑盒

MAD 含量檢測(cè)試劑盒和SOD、PPO、GR、CAT檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備

將供試菌種黑木耳沈8-9 母種接種到PDA 平板培養(yǎng)基上，封口放置在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平板后取出。在無(wú)菌條件下，用接種鏟將培養(yǎng)好的菌絲轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)瓶中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置12 h 后，在150 r·min-1、25 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d。

1.2.2 栽培袋制作

按常規(guī)方法生產(chǎn)菌棒，使用16.5 cm×33 cm 的聚乙烯栽培袋裝袋，滅菌后的菌袋轉(zhuǎn)移至冷卻間，待菌袋溫度降到30 ℃以下時(shí)接種。接10 mL 液體原種到栽培袋中，接種200 棒，設(shè)3 個(gè)重復(fù)。將接種后的菌袋置于25 ℃環(huán)境下避光培養(yǎng)，直到菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋。分別在溫度為25 ℃和35 ℃的培養(yǎng)室內(nèi)放置100 棒菌袋，培養(yǎng)12 h 后取出，進(jìn)行正常出菇管理。

1.2.3 菌落形態(tài)觀察

取35 ℃脅迫12 h 后的菌絲轉(zhuǎn)接至PDA 培養(yǎng)基上，在25 ℃條件下培養(yǎng)，測(cè)定菌絲在平皿中的生長(zhǎng)速度，同時(shí)與在25 ℃條件下培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)速度進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.4 酶活測(cè)定

經(jīng)高溫脅迫12 h 后，分別在耳芽期、出耳期隨機(jī)選取5 袋菌包，取耳芽或耳片，測(cè)定質(zhì)量后分裝于1.5 mL 離心管中，置于-80 ℃超低溫冰箱保存后，進(jìn)行MAD 含量及SOD、PPO、GR、CAT 等抗性酶系活性的測(cè)定。

1.2.5 黑木耳農(nóng)藝性狀觀測(cè)記錄

觀測(cè)記錄高溫處理后黑木耳菌株菌絲的現(xiàn)耳芽時(shí)間、耳片顏色、耳片厚度、耳片寬度、產(chǎn)量、出芽整齊度和污染率指標(biāo)[12-13]。耳片性狀選取第1 潮30 朵鮮耳進(jìn)行測(cè)定。耳片厚度、寬度用游標(biāo)卡尺以“十”字形進(jìn)行測(cè)量，記錄子實(shí)體顏色的深淺。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

不同溫度處理下黑木耳菌絲生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1 和圖1。

圖1 不同溫度處理后菌絲的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth situation of hypha after different temperatures

表1 不同溫度處理黑木耳菌絲生長(zhǎng)情況Tab.1 Growth situation of mycelium of Auricularia auricularia at different temperatures

由表1、圖1 可知，菌絲回接到PDA 培養(yǎng)基后，25 ℃條件下培養(yǎng)的黑木耳菌絲潔白、致密，長(zhǎng)勢(shì)均勻，邊緣整齊，生長(zhǎng)速度為3.531 mm·d-1。35 ℃脅迫12 h 后的黑木耳菌絲呈乳黃色，菌絲稀疏，邊緣整齊度差，生長(zhǎng)速度為2.555 mm·d-1。

2.2 高溫脅迫對(duì)MAD 含量的影響

高溫脅迫對(duì)MAD 含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同溫度條件下黑木耳菌絲中MAD 的含量Fig.2 MAD contet of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖2 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，菌絲中MAD 的含量為23.59 nmol·g-1，比對(duì)照組（25 ℃處理組）高3.46 nmol·g-1，而耳芽期和耳片期的MAD 含量處于低表達(dá)量水平，且受高溫脅迫影響不顯著。

2.3 高溫脅迫對(duì)SOD 活性的影響

不同溫度條件下黑木耳菌絲中SOD 的活性見(jiàn)圖3。

圖3 不同溫度條件下黑木耳菌絲中SOD 的活性Fig.3 SOD activity of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖3 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，菌絲中SOD 活性從30.61 U·g-1下降到14.97 U·g-1，下降了48.68%。隨著菌包中菌絲的自然恢復(fù)，耳芽期高溫脅迫后菌絲中SOD 的活性為CK 組的75.44%，含量提升了26.76%；耳片期高溫脅迫后菌絲中SOD 的活性為CK 組的78.40%，含量分別比菌包期和耳芽期提升了29.72%和2.96%。結(jié)果表明，高溫脅迫后黑木耳菌絲中SOD 的活性迅速下降，而到耳芽期和耳片期時(shí)，SOD 活性高于CK，有所提升。

2.4 高溫脅迫對(duì)PPO 活性的影響

不同溫度條件下黑木耳菌絲的PPO 活性見(jiàn)圖4。

圖4 不同溫度條件下黑木耳菌絲的PPO 活性Fig.4 PPO activity of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖4 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，菌絲中PPO 的活性為60.80 U·g-1，是CK 的1.43倍，菌包期的處理對(duì)耳芽期和耳片期PPO 的活性無(wú)顯著影響，整體活性水平在20～22.8 U·g-1。

2.5 高溫脅迫對(duì)CAT 活性的影響

不同溫度條件黑木耳菌絲中CAT 的活性見(jiàn)圖5。

圖5 不同溫度條件黑木耳菌絲中CAT 的活性Fig.5 CAT activity of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖5 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，CAT 活性未發(fā)生明顯變化，為16.572 μmol·min-1·g-1，而CK 中CAT 的活性為16.442 μmol·min-1·g-1。當(dāng)生長(zhǎng)發(fā)育到耳芽期和耳片期時(shí)，CAT 活性均低于CK，其中耳芽期CAT 活性最低，為6.45 μmol·min-1·g-1，僅為CK 組的37.65%。

2.6 高溫脅迫對(duì)GR 活性的影響

不同溫度條件下黑木耳菌絲的GR 活性見(jiàn)圖6。

圖6 不同溫度條件下黑木耳菌絲中GR 的活性Fig.6 GR activity of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖6 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，黑木耳菌絲中GR 活性為250.84 nmol·min-1·g-1，是CK組的8.29 倍。耳芽期和耳片期GR 的活性為10.72～16.08 nmol·min-1·g-1，對(duì)照組和處理組差異不顯著。

2.7 高溫脅迫對(duì)黑木耳農(nóng)藝性狀的影響

不同溫度處理后黑木耳子實(shí)體農(nóng)藝學(xué)性狀見(jiàn)表2。

表2 不同溫度處理黑木耳子實(shí)體農(nóng)藝性狀Tab.2 Agronomic characters of Auricularia auricularia fruiting body under different temperature conditions

從表2 可以看出，在35 ℃條件下，黑木耳耳芽形成的時(shí)間比CK 組晚2 d，耳片較薄，耳片顏色差異不明顯，耳片比對(duì)照組寬1.452 cm，可能是受高溫脅迫后該品種朵形發(fā)生了變化。高溫脅迫后的菌包不但產(chǎn)量比對(duì)照組低4.87 g，污染率更是達(dá)到15%。說(shuō)明高溫條件下，菌絲的活力會(huì)受到影響，其抗病能力也大大減弱，易受污染。

3 結(jié)論與討論

研究表明，黑木耳“沈8-9”對(duì)高溫脅迫較為敏感。菌絲體在受高溫脅迫后，其形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)都出現(xiàn)變化。在溫度不適宜的條件下，黑木耳菌絲體的生長(zhǎng)速度、色澤、長(zhǎng)勢(shì)等都存在差異。35 ℃條件下高溫脅迫12 h，菌包培養(yǎng)期、耳芽期和出耳期3 個(gè)不同時(shí)期菌絲中多種酶的活性變化都大于25 ℃。其中SOD 活性在培養(yǎng)期迅速下降，但在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，活性不斷增強(qiáng)；MAD 含量和PPO、CAT、GR活性變化明顯，且在耳芽期和耳片期活性處于較低水平，但受高溫脅迫持續(xù)影響不顯著。

高溫脅迫后，菌包培養(yǎng)期MAD 含量升高，抗性酶系活性升高或降低，是黑木耳菌絲自身抵抗外界脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。MAD 是菌絲細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損傷后產(chǎn)生的最終產(chǎn)物，其含量多少反映細(xì)胞膜的受損程度。抗性酶系活性的變化是由于菌絲將細(xì)胞內(nèi)形成的過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為低毒或無(wú)毒物質(zhì)，以維持體內(nèi)活性氧的代謝平衡。耳芽期和耳片期是菌絲從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變到生殖生長(zhǎng)的時(shí)期，菌包培養(yǎng)期受高溫脅迫對(duì)這2 個(gè)時(shí)期的影響較弱。

在催芽過(guò)程中，各處理間耳芽形成時(shí)間和整齊度無(wú)顯著變化。頭潮耳采收時(shí)間較早的是25 ℃處理的菌棒，35 ℃處理組的采收時(shí)間最晚。耳芽的整齊度與菌絲是否受溫度脅迫無(wú)直接的相關(guān)性，這可能是因?yàn)楹谀径诖哐科诘恼R度與環(huán)境濕度有關(guān)，栽培袋所處的位置通風(fēng)好、濕度小，導(dǎo)致耳芽不整齊。

從栽培試驗(yàn)可以看出，栽培袋刺孔后所處的溫度條件不同會(huì)直接影響木耳的產(chǎn)量和商品性狀。在25 ℃條件下，耳片的農(nóng)藝性狀無(wú)顯著變化；35 ℃條件已經(jīng)對(duì)黑木耳菌絲體活力造成影響，不但產(chǎn)量降低、商品性狀下降，污染率也大大增加。試驗(yàn)結(jié)果顯示，高溫脅迫使SOD 活性在初期迅速降低，后期活性不斷增強(qiáng)，表明其一直在修復(fù)自身的活性損傷。結(jié)合產(chǎn)量及耳片相關(guān)農(nóng)藝性狀的變化總結(jié)得出，溫度的變化影響菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中相關(guān)酶的活性，活性與受脅迫時(shí)間無(wú)正相關(guān)關(guān)系。在栽培過(guò)程中，不同溫度及脅迫時(shí)間對(duì)產(chǎn)量、污染率等農(nóng)業(yè)性狀變化有直接關(guān)系，溫度越高且脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)品品質(zhì)及產(chǎn)量越低。