紅星兼香型白酒香氣成分的分析研究

陳思佳，杜艷紅，譚 昊，聶建光，李婷婷，李 曉，賈春琪，瞿紅宇

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

白酒作為世界最著名的六大蒸餾酒之一，是中國本土最受歡迎的傳統(tǒng)蒸餾酒，其釀造技藝可追溯到元朝時期[1]。中國白酒種類繁多，市場上不同香型的白酒依靠各自的風(fēng)格和特點(diǎn)，皆受到廣大消費(fèi)者的歡迎，不同香型白酒風(fēng)格差異關(guān)鍵在于其香味成分的差異[2-3]。

近些年來，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）等先進(jìn)分析儀器廣泛應(yīng)用于白酒中香氣化合物的定性和定量，其中氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為檢測白酒中揮發(fā)性香氣成分的主要技術(shù)手段[4-5]。為了鑒定特征香氣成分，氣相色譜-聞香法（GC-O）應(yīng)運(yùn)而生，GC-O 是一種將氣相色譜-質(zhì)譜儀器的分析能力和人的鼻子所具有的敏感嗅覺相結(jié)合的研究方法，目前已廣泛應(yīng)用于飲料酒成分和水果風(fēng)味等多方面的研究[6-8]。

本研究應(yīng)用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HS-SPME-GC-MS）對紅星兼香型白酒和其他3種香型白酒中揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，并結(jié)合GC-O 技術(shù)對風(fēng)味物質(zhì)的香氣貢獻(xiàn)進(jìn)行剖析，以比較紅星兼香型白酒與其他香型白酒在揮發(fā)性化合物種類和含量上的差異，確定紅星兼香型白酒重要的香氣活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：兼香型白酒JG(53 %vol)，由北京紅星股份有限公司提供；清香型白酒QH(53%vol)、濃香型白酒WL(52 %vol)、醬香型白酒FT(53 %vol)，均從市場采購。

試劑及耗材：氯化鈉（分析純，上海國藥化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（99.9 %，北京百靈威科技有限公司）；定性用標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物（純度均大于98.0 %，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司或上海麥克林生化科技有限公司）；C7～C30 飽和烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（Supelco，美國）。

儀器設(shè)備：JJ323BC 型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；DVB/CAR/PDMS 固相微萃取三相頭（50/30 μ m × 1 cm，Supelco，美國）；8890-7010BGC-MS 聯(lián)用儀、DB-FFAP 色譜柱（60 m×0.25 mm,0.25 μm)、DB-WAX UI 色譜柱（30 m×0.25 m,0.5 μ m）、20 mL 頂空進(jìn)樣瓶（Agilent，美國）；sniffer 9100 系統(tǒng)（brechbühler，瑞士）；Synergy超純水機(jī)（Millipore，美國）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

DB-FFAP 毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm,0.25 μ m）；升溫程序：初始溫度40 ℃，以2 ℃/min 升到160 ℃，再以10 ℃/min 升到230 ℃，保持15 min；載氣（He）流速1.5 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣。

DB-WAX UI 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm,0.5 μ m）；升溫程序：初始溫度35 ℃，保持4 min，以5 ℃/min 升溫到100 ℃，再 以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持13min；載氣（N2）流速1.08 mL/min，進(jìn)樣口溫度230 ℃，進(jìn)樣量0.5 μ L，分流比30∶1；氫火焰離子檢測器（FID）溫度為240 ℃，尾吹氣30 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子電離源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；輔助通道加熱溫度250 ℃；全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍35～450 m/z。

1.2.3 化合物定性

化合物通過NIST.L20 譜庫檢索進(jìn)行初步鑒定，再通過計(jì)算化合物的保留指數(shù)(retention index,RI)，與文獻(xiàn)保留指數(shù)比對以及標(biāo)準(zhǔn)品比對，進(jìn)一步對該化合物進(jìn)行定性分析。

1.2.4 定量分析

對濃度較高的物質(zhì)使用DB-WAX UI 柱，GCFID 直接進(jìn)樣法定量分析；濃度較低的物質(zhì)使用DB-FFAP 柱，HS-SPME-GC-MS 法進(jìn)行相對定量分析。

1.2.4.1 GC-FID 直接進(jìn)樣法定量分析

內(nèi)標(biāo)混合溶液包含叔戊醇、乙酸戊酯、2-乙基丁酸（終濃度200 mg/L），取酒樣10 mL 加入100 μ L混合內(nèi)標(biāo)，混勻后加入1.5 mL 進(jìn)樣小瓶進(jìn)行氣相色譜分析。采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

1.2.4.2 HS-SPME-GC-MS 內(nèi)標(biāo)半定量法分析

內(nèi)標(biāo)溶液為4-辛醇（終濃度880 μ g/L），取酒樣1.5 mL 于20 mL 頂空瓶中，加入10.0 μ L 內(nèi)標(biāo)溶液、6.5 mL 超純水，加氯化鈉飽和，混合均勻后進(jìn)行分析。HS-SPME 方法參考孫細(xì)珍法[9]，條件如下：50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，樣品在50 ℃條件下平衡5 min 后，將SPME 纖維頭插入頂空瓶中樣品上方，50 ℃萃取40 min（250 r/min），萃取結(jié)束后，萃取頭插入進(jìn)樣口中，于250 ℃脫附5 min；萃取前后均于270 ℃老化15 min。采用以上DB-FFAP 色譜柱條件、質(zhì)譜條件進(jìn)行GC-MS 分析，以待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比，采用內(nèi)標(biāo)半定量法計(jì)算各化合物的相對含量。

1.2.5 GC-O 分析

對色譜流出成分在毛細(xì)管末端以1∶1 的分流比流入嗅聞儀，嗅聞系統(tǒng)傳輸線溫度250 ℃，加濕器流速100 mL/min。聞香小組由4 人組成（均經(jīng)過專業(yè)品酒訓(xùn)練，有一定品評經(jīng)驗(yàn)，含2 名國家級品酒師），采用時間－強(qiáng)度法（OSME法）[10]，香氣強(qiáng)度分別記為1～5 個等級，每人聞香3 次。每個化合物的香氣強(qiáng)度值為聞香結(jié)果的平均值。“1”表示該化合物香氣微弱，“5”表示該化合物香氣非常強(qiáng)。聞香時記錄香氣的保留時間、香氣強(qiáng)度以及香氣描述。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)采用Origin 2022 進(jìn)行聚類分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒體揮發(fā)性成分分析

4種香型白酒中每類化合物含量所占百分比如圖1 所示。由圖1 可以看出，在4種白酒樣品中含量占比最高的均為酯類化合物，其中濃香型WL 的酯類化合物占比最高；其次是酸類化合物和醇類化合物，兼香型JG 和醬香型FT 的縮醛類化合物含量占比較高，主要是乙縮醛的含量較高。研究發(fā)現(xiàn)隨著貯存時間的延長，乙醛可以和乙醇縮合成乙縮醛[12]。醬香型白酒和兼香型白酒的縮醛類物質(zhì)含量較高可能與原酒的貯存期長有關(guān)，一般來說醬香型原酒要經(jīng)過不少于三年時間，貯存成熟才能用于勾調(diào)。

圖1 4種白酒樣品中各類揮發(fā)性化合物含量占比

根據(jù)檢出的揮發(fā)性風(fēng)味成分含量進(jìn)行熱圖分析（圖2），熱圖更能夠直觀地顯示各酒樣揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類和含量差異。由圖2 熱圖可知，4種不同香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成差異明顯，尤其是醬香型FT 與其他3種香型的物質(zhì)組成差別最大。由層次聚類分析結(jié)果可知，當(dāng)樣品被歸為4 類時，4種香型能夠被區(qū)分，說明不同香型間微量化合物的構(gòu)成存在十分明顯的差異。由樹狀圖和熱圖可知，紅星兼香型JG 與清香型QH 在化合物種類和含量上相對相似，其次是與濃香型WL。

圖2 4種香型白酒風(fēng)味物質(zhì)熱圖分析

根據(jù)前述方法對酒樣中揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行測定分析，從4種白酒樣品中共鑒定出138種化合物（表1），其中包括酯類65種，醇類12種，酸類9種，醛酮類15種，芳香類11種，酚類4種，內(nèi)酯類1種，縮醛類6種，呋喃類10種，含硫化合物2種，含氮化合物1種和萜烯類2種。

表1 4種酒樣揮發(fā)性風(fēng)味化合物檢出結(jié)果

表2 紅星兼香型白酒中香氣成分的聞香結(jié)果

由表1 可知，鑒定出的138種化合物中，紅星兼香型包含116種，清香型74種，濃香型101種，醬香型101種。比較可知，兼香型的風(fēng)味化合物種類更加豐富，這可能與多種因素有關(guān)，紅星兼香型JG 為濃清醬三香融合的兼香酒體，且應(yīng)用陳年調(diào)味酒進(jìn)行酒體調(diào)制，提升了風(fēng)味化合物的多樣性。近年來對白酒發(fā)酵過程中微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，濃香型和醬香型酒醅中微生物的種類和數(shù)量明顯比清香型豐富，影響了不同香型白酒風(fēng)味化合物的豐富度[11]。

2.2 GC-O 結(jié)果分析

應(yīng)用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC-O 聞香技術(shù)，鑒定紅星兼香型白酒JG 中主要呈香的香氣化合物，共嗅聞到35種香氣成分（表2），包括酯類15種、酸類4種、芳香族4種、呋喃類1種、吡嗪類1種、醇類1種、酮類1種和未知化合物8種。由表2 可以看出，果香、花香和酸甜味是主要的風(fēng)味貢獻(xiàn)。

酯類化合物大多是由酸和醇在發(fā)酵和貯存過程中酯化而成[14]。檢測到的15種酯類化合物以乙酯類為主，是最重要的一類呈香物質(zhì)，主要呈現(xiàn)水果香和甜香，如己酸乙酯呈果香和菠蘿香氣、丁酸乙酯呈水果香和甜香、3-己烯酸乙酯呈腐敗的果香。根據(jù)香氣強(qiáng)度值的大?。ā?），己酸乙酯（4.6）、丁酸乙酯（3.8）、異戊酸乙酯（3.4）、3-己烯酸乙酯（3.3）、庚酸丙酯（3.3）、戊酸乙酯（3.0）和乳酸乙酯（3.0）是紅星兼香型白酒JG 中重要的酯類呈香化合物。此外有研究報(bào)道，辛酸乙酯在兼香型白酒中OAV＞1000，含量較低但對兼香型、濃香型、清香型、鳳香型酒體風(fēng)味均有重要貢獻(xiàn)，并且在低濃度時對酒體香味有很好的復(fù)合作用[1，15]，在本研究中該物質(zhì)也呈現(xiàn)一定的香氣強(qiáng)度。

有機(jī)酸類是細(xì)菌在發(fā)酵過程中逐步產(chǎn)生的，香氣特征是酸爽、酸臭、汗臭等氣味，酸類是形成酒“后味”的重要成分，也是生成酯類的前體物質(zhì)[16]。從香氣強(qiáng)度來看，香氣最強(qiáng)的是己酸（4.4），己酸是酒中己酸乙酯的前體物質(zhì)，貢獻(xiàn)典型的酸澀味和奶酪臭味[17]，其他被嗅聞到的酸類化合物還有異戊酸（3.8）、丁酸（2.4）和乙酸（1.0）。

芳香族化合物主要來源于原料的單寧、木質(zhì)素、阿魏酸、香草醛，經(jīng)酵母、細(xì)菌發(fā)酵生成，貢獻(xiàn)花香、蜂蜜香和水果香[18]。芳香族物質(zhì)普遍具有高沸點(diǎn)、難揮發(fā)和留香時間長等特點(diǎn)，是促進(jìn)酒體優(yōu)雅醇厚的一類物質(zhì)[17]。在紅星兼香型白酒中，嗅聞到的4種芳香族化合物均為芳香酯，香氣強(qiáng)度最大的是呈玫瑰花香的苯乙酸乙酯（4.0）和呈果香的苯丙酸乙酯（4.0），其次是乙酸苯乙酯（2.6）和苯甲酸乙酯（1.3）。

本研究嗅聞到的雜環(huán)化合物包括呈溶劑味和汽油味的乙基糠基醚（3.3），以及呈烤堅(jiān)果香和可可香氣的四甲基吡嗪（2.0）。吡嗪及呋喃等雜環(huán)類化合物均可以通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[19]。乙基糠基醚曾在兼香型、馫香型、濃香型白酒中檢出[1，20-21]，四甲基吡嗪閾值低、香味強(qiáng)度大，具有的烘烤香氣可以改善白酒風(fēng)味[22-23]。

本研究還嗅聞到未知化合物8種，未能定性可能是由于含量低導(dǎo)致未出峰或與其他組分共流出。這些成分分別呈現(xiàn)酸味、烘烤香、泥土味、堅(jiān)果味、青草味等氣味，它們對酒體整體香氣的貢獻(xiàn)也不容忽視。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過HS-SPME 結(jié)合GC-MS 技術(shù)，利用質(zhì)譜、保留指數(shù)法及標(biāo)準(zhǔn)品比對的方法，從紅星兼香型白酒和其他3種典型香型白酒中共鑒定出138種香氣成分，紅星兼香型白酒包含其中的116種，化合物種類的豐富程度高于其他3種香型白酒。通過GC-O 技術(shù)從紅星兼香型白酒中嗅聞到35種香氣活性物質(zhì)，按照香氣強(qiáng)度值的大?。ā?），己酸乙酯、己酸、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、異戊酸、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、3-己烯酸乙酯、乙基糠基醚、庚酸丙酯、戊酸乙酯和乳酸乙酯為紅星兼香型白酒重要的香氣活性物質(zhì)。本研究為紅星兼香型白酒的香氣成分剖析提供了依據(jù)，但對各類風(fēng)味物質(zhì)的協(xié)同作用還有待深入研究。