基于網(wǎng)絡(luò)藥理-分子對接探討烏藥治療酒精性肝炎的作用機制

譚明明 張優(yōu)妮 嚴聰聰 龐霄君 王軍偉

浙江省天臺縣人民醫(yī)院，浙江天臺 317200

烏藥（Lindera aggregata）系樟科山胡椒屬植物，有行氣止痛、溫腎散寒之功，成分包括揮發(fā)油、倍半萜類化合物、異喹啉類生物堿、黃酮類、木脂素以及環(huán)戊二烯酮等[1]。研究表明，烏藥可降低酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）模型大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，緩解AH[2]。烏藥可通過調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保肝效應(yīng)，機制與降低TLR4/NF-κB 通路的激活有關(guān)[3]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選烏藥的活性成分和潛在靶點，分析關(guān)鍵蛋白涉及的生物學(xué)功能及信號通路，構(gòu)建“活性分子-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理圖。通過分子對接技術(shù)，分析烏藥活性成分與靶蛋白的相互作用，為進一步揭示烏藥治療AH 的藥理機制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 烏藥組分

通 過TCMSP[4]以“烏 藥”為 檢 索 詞，獲 得烏藥所有成分信息，設(shè)定篩選參數(shù)OB ≥30%、DL ≥0.1[5]。

1.2 活性成分靶蛋白預(yù)測

采用三種在線工具預(yù)測活性分子的靶蛋白，分別是：利用TCMSP 預(yù)測活性分子的靶蛋白，基于Uniprot[6]對蛋白名稱進行Symbol 轉(zhuǎn)化，利用BATMAN[7]預(yù)測活性分子對應(yīng)的靶蛋白，并根據(jù)靶蛋白相互作用與已知靶點相似的可能性進行得分排序，設(shè)定Score cutoff=20。利用在線工具Swiss target prediction[8]，預(yù)測化合物的靶標，設(shè)定篩選物種為“Homo sapiens”“Probability＞0”。將所有篩選到的活性成分靶蛋白進行合并作為潛在靶蛋白。

1.3 篩選疾病相關(guān)靶蛋白

以“Hepatitis，Alcoholic”為關(guān)鍵詞，分別在CTD[9]、DisGeNET[10]及GeneCards[11]中，檢索AH 相關(guān)基因。整合三個數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，并與先前預(yù)測的靶蛋白取交集，認定AH 相關(guān)的靶蛋白。

1.4 功能和通路富集分析

利用R 軟件包clusterProfiler[12]對AH 靶蛋白進行GO 生物過程和KEGG 通路富集分析，參數(shù)設(shè)置為FDR＜0.05，選取富集最顯著的前20 位功能條目或通路，繪制氣泡圖。

1.5 靶蛋白相互作用分析

利用在線數(shù)據(jù)庫String[13]對靶蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）進行分析，物種設(shè)置為“Homo sapiens”“combined score ≥0.4”。利用Cytoscape[14]對PPI 進行可視化。采用CytoNCA[15]對PPI 網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點進行中心度（degree centrality，DC）分析，參數(shù)設(shè)置為“without weight”。通過各個節(jié)點的連接度排名，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點，即為hub 蛋白。利用Cytoscape 軟件的MCODE 插件識別網(wǎng)絡(luò)中的模塊基因，參數(shù)設(shè)置為“Degree Cutoff=2”“Node Score Cutoff=0.2”“K-core=2”“Max Depth=100”。

1.6 藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于“烏藥- 成 分- 靶 蛋白- 通 路”，利 用cytoscape 構(gòu)建藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)，展示烏藥活性成分的靶蛋白及信號通路。

1.7 分子對接

選取富集到AH 通路的基因，通過PDB 數(shù)據(jù)庫[16]下載靶蛋白結(jié)合配體復(fù)合物的PDB 格式文件，采用pymol 進行復(fù)合物的預(yù)處理，得到靶標蛋白，進行分子對接。設(shè)定靶蛋白的篩選條件：通過X 射線衍射方法獲得的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；蛋白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 分 辨 率＜3；“Polymer Entity Type”設(shè)置為“Protein”；得分降序排名第一。選取藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)中連接度較大的成分作為關(guān)鍵分子，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫[17]下載關(guān)鍵分子的分子結(jié)構(gòu)，并保存為SDF 格式文件，通過pymol 轉(zhuǎn)換為PDB 格式，用于分子對接。將處理好的靶蛋白與活性分子導(dǎo)入Autodock[18]，采用Lamarckian GA 算法進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 烏藥活性成分

通過檢索TCMSP，得烏藥的127 種化學(xué)成分。按閾值篩選得到33 種重要成分（表1）。

2.2 活性成分的靶蛋白預(yù)測

根據(jù)設(shè)定的閾值，TCMSP 共預(yù)測得到371 個成分-靶標關(guān)系對，包含了30 個活性成分、177 個靶 標；BATMAN 共 預(yù) 測 得 到1095 個 成 分- 靶標關(guān)系對，包含了13 個活性成分、488 個靶標；Swiss target prediction 共預(yù)測得到1451 個成分-靶標關(guān)系對，包含了30 個活性成分、551 個靶標。合并以上的預(yù)測結(jié)果，共得到2838 個活性成分-靶蛋白關(guān)系對，包括33 個活性成分和1019 個靶蛋白。

基于三個數(shù)據(jù)庫（CTD、DisGeNET 和GeneCards）依次得到AH 相關(guān)基因9248、133、6115 個。對上述預(yù)測得到活性成分相關(guān)的靶基因和3 個疾病相關(guān)基因集取交集，篩選得到27 個重疊的靶蛋白，這些靶蛋白被認為是烏藥治療AH 中的潛在作用靶蛋白。

2.3 靶蛋白功能和通路富集分析

對上述27 個潛在靶基因進行GO 和KEGG 通路富集分析。GO 顯示，最顯著的前20 位基因功能涉及白細胞遷移、細胞黏附的正向調(diào)節(jié)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)、細胞對生物刺激的應(yīng)答等（圖1A）。KEGG 分析結(jié)果顯示，富集最顯著的信號通路包括細胞衰老、Toll 樣受體通路、C 型凝集素受體通路、人T 細胞白血病病毒1 感染、乙型肝炎、TNF 信號通路等（圖1B）。

圖1 靶蛋白的功能通路富集top20 結(jié)果氣泡圖

2.4 靶蛋白相互作用分析

通過String 對靶蛋白的PPI 進行預(yù)測，采用Cytoscape 生成網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果顯示，共有25 個蛋白有互作關(guān)系，161 個關(guān)系對（圖2A）。網(wǎng)絡(luò)圖中degree 值較高的前10 位蛋白，分別是TP53、TNF、IL-1B、IL-6、MYC、CXCL8、ICAM1、SIRT1、IL-10、SYK，即為潛在的靶蛋白。

圖2 活性成分-靶蛋白相互作用的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（A）及功能子模塊（B）

采用MCODE 算法，共篩選出2 個子模塊，module1 和module2，其中上述hub 蛋白均包含在模塊內(nèi)（圖2B）。

2.5 “活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于上述得到的27 個關(guān)鍵靶蛋白，結(jié)合其對應(yīng)的成分，靶蛋白及通路關(guān)系，構(gòu)建“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，如圖3 所示，網(wǎng)絡(luò)共包含59 個節(jié)點。其中PIK3CD、PIK3CA、PPARG、TNF、RELA、IL-6、IL-1B、TP53 等可能是烏藥作用AH 的潛在靶點；這些靶點富集到的通路有20 個，包括PI3K/AKT 信號通路、癌癥中心碳代謝、丙型肝炎、C 型凝集素受體信號通路、人T 細胞白血病病毒1 感染、Toll 樣受體信號通路等。

圖3 “活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接

選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中AH 相關(guān)的蛋白，共有6 個，為CXCL8、IL-1B、IL-6、TNF、SIRT1 和RELA，基于“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，篩選靶蛋白對應(yīng)的活性分子。對于多個活性分子靶向同一個蛋白，選取連接度較大的作為關(guān)鍵節(jié)點，最終篩選到3 個活性分子，依次為槲皮素（quercetin），亞油酸（EIC）和石梓呋喃（gmelofuran）；其中quercetin 靶向CXCL8、IL-1B、IL-6、RELA 和TNF；EIC 靶向IL-1B、IL-6和TNF；gmelofuran 靶向SIRT1。結(jié)果表明，活性成分與關(guān)鍵靶點具有較強的結(jié)合活性，主要通過氫鍵相互作用與靶蛋白的氨基酸位點結(jié)合。

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，預(yù)測烏藥治療AH的關(guān)鍵靶點及作用機制。通過在線預(yù)測工具，共篩選得到27 個重要靶蛋白。功能和通路富集分析顯示，這些分子主要參與白細胞遷移、細胞黏附的正向調(diào)節(jié)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)、Toll 樣受體通路、C 型凝集素受體通路、乙型肝炎、TNF 信號通路等。分析顯示，烏藥的活性成分可通過多種信號通路干預(yù)AH，其中PIK3CD、PIK3CA、PPARG、TNF、RELA、IL-6、IL1B、TP53 是網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點，可能是烏藥作用于AH 的潛在靶點，涉及的通路包括PI3K/AKT 信號通路，癌癥中心碳代謝，Toll 樣受體信號等。

本研究對烏藥治療AH 的主要活性成分，潛在靶點及作用機制進行探討，闡述了多組分、多靶點以及多種通路間相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。通過構(gòu)建“活性分子-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合分子對接技術(shù)，預(yù)測烏藥中的三種活性成分，槲皮素、亞油酸和石梓呋喃可能通過氫鍵結(jié)合炎癥通路（CXCL8、IL1B、IL-6、RELA、TNF 和SIRT1）的多個關(guān)鍵蛋白，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮保肝作用。本研究獲得了對三種活性成分在AH 保護作用機制中靶點的概述，將為烏藥在治療AH 中的作用提供更好的研究視角和見解。