基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討姜黃素對砷誘導(dǎo)心臟損傷的作用機(jī)制及PI3K/AKT信號通路驗(yàn)證

李瑞平 雷雨歌 李 健 張 越

沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧沈陽 110034

砷作為已知的人類致癌物，廣泛存在于自然界 中[1]。通過環(huán)境污染和職業(yè)接觸進(jìn)入體內(nèi)，對人體皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、肝臟及腎臟等器官有明顯的損傷[2]。砷在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生多種自由基和非自由基產(chǎn)物，引起細(xì)胞紊亂，直接攻擊細(xì)胞或誘發(fā)脂質(zhì)過氧化物引起機(jī)體氧化與抗氧化代謝失調(diào)，造成氧化應(yīng)激損傷[3]。氧化應(yīng)激的產(chǎn)生使得大量的ROS 產(chǎn)生，造成細(xì)胞的損傷和凋亡[4]。姜黃素（Cur）是姜黃（姜黃科）根莖的主要Cur 類化合物，傳統(tǒng)上被用來治療咳嗽、黃疸、感冒、肝臟疾病和炎癥性疾病，被認(rèn)為是一種安全性能高、療效好、副作用小的藥物，可作為糖尿病及心血管并發(fā)癥的治療藥物[5]。但Cur 對砷誘導(dǎo)心臟損傷的具體機(jī)制尚不明確，值得進(jìn)一步研究。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索Cur 抗砷誘導(dǎo)心臟損傷的潛在靶點(diǎn)和途徑。以砷處理的H9C2 細(xì)胞作為體外心肌細(xì)胞模型，驗(yàn)證Cur 對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其機(jī)制。結(jié)果表明，Cur 至少部分地通過激活PI3K/AKT 通路來減輕亞砷酸鈉（NaAsO2）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 Cur靶點(diǎn)的預(yù)測

從本草組鑒HERB 數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）中篩選Cur 的潛在靶點(diǎn)，該數(shù)據(jù)庫是中藥高通量實(shí)驗(yàn)和參考數(shù)據(jù)庫。

1.2 砷致心臟損傷疾病靶點(diǎn)預(yù)測

從GeneCard、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)，關(guān)鍵詞為砷誘導(dǎo)心臟損傷，并去除兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的重復(fù)靶點(diǎn)。

1.3 疾病和藥物共同靶點(diǎn)的篩選

將藥物和疾病的靶點(diǎn)輸入Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平臺，得到藥物和疾病的交集靶點(diǎn)及韋恩圖。

1.4 交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物與疾病的交集靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫，將物種設(shè)定為人“Homo Sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為“medium confidence（＞0.700）”，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)。Cytohubba 是Cytoscape 軟件中尋找核心靶點(diǎn)的一個(gè)插件，用于發(fā)現(xiàn)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵目標(biāo)[6]。利用Cytohubba 中的五種算法，節(jié)點(diǎn)連接度（Deg）、最大集團(tuán)中心性（MCC）、最大領(lǐng)域分量（MNC）、邊緣滲透分量（EPC）與Closeness（Clo）選取前5 個(gè)基因，根據(jù)5 種算法篩選后的基因取交集，如果同一基因同時(shí)能在五種算法之中，則認(rèn)為是核心基因。

1.5 基因功能和信號通路的富集分析

GO 是注釋基因及其表達(dá)產(chǎn)物的常用方法，由生物過程（biological process）、細(xì)胞組成（cellular component）和分子功能（molecular function）3 部分組成，運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫對疾病和藥物的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能分析，說明其在基因功能中的作用。對Cur 和砷導(dǎo)致的心臟損傷疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號通路富集分析，從而了解Cur 治療該疾病發(fā)生改變的關(guān)鍵信號通路。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)與Cur的分子對接

將排名前三的靶點(diǎn)與Cur 進(jìn)行分子對接，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫下載成分的結(jié)構(gòu)，通過PDB 數(shù)據(jù)庫下載排名靠前的核心靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)，將成分及靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)通過AutoDock 軟件進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷處理后進(jìn)行分子對接，結(jié)合能最低的結(jié)構(gòu)為最優(yōu)結(jié)構(gòu)，通過Open Babel GUI 軟件將對接結(jié)果的.pdbqt 格式轉(zhuǎn)化為.pdb 格式，最后使用PyMOL 軟件對圖像進(jìn)行處理分析。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

H9C2 細(xì)胞購自中國科學(xué)院，NaAsO2來自美國Sigma 公司。

1.8 細(xì)胞活力

將H9C2 心肌細(xì)胞接種與96 孔板中，接種密度為5×104個(gè)/ml，鋪板24 h 后對細(xì)胞進(jìn)行NaAsO2染毒實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的分組設(shè)置為：對照（Con）組、NaAsO2組（6、8、10 μmol/L），NaAsO2（6 μmol/L）與Cur組（2.5、5、7.5、10、15 μmol/L）。

1.9 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

取大鼠心肌細(xì)胞，提取RNA 并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，RT-PCR 檢測各因子的表達(dá)，引物序列由上海生工公司合成，以GAPDH 為參照基因。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，采用t檢驗(yàn)；P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)的預(yù)測

從HERB 數(shù)據(jù)庫中篩選出Cur 靶點(diǎn)152 個(gè)。以“Arsenic induces heart damage”為關(guān)鍵詞，GeneCards數(shù)據(jù)庫以“Relevance score”大于1 進(jìn)行篩選，得出疾病靶點(diǎn)2207 個(gè)。OMIN 數(shù)據(jù)庫中篩選出197 個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出來的Cur 靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)，運(yùn)用VENNY 2.1 繪制韋恩圖，見圖1A。將兩者的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)設(shè)定條件得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 軟件導(dǎo)入節(jié)點(diǎn)信息，見圖1B。其中，根據(jù)5 種算法獲得5 個(gè)核心基因分別是AKT1、AMPK3、JUN、TP53、SRC。

2.3 GO和KEGG通路分析

DAVID 數(shù)據(jù)庫以FDR＜0.05 對結(jié)果進(jìn)行篩選，對119 個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析。共有973 個(gè)GO 術(shù)語條目，主要的GO 生物過程包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等，表明Cur 對砷誘導(dǎo)的心臟損傷有抗凋亡作用。細(xì)胞組分主要與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核有關(guān)。分子功能與蛋白結(jié)合與酶結(jié)合有關(guān)，揭示了蛋白質(zhì)在疾病的重要性，見圖2。主要KEGG 信號通路有癌癥通路、PI3K/AKT 信號通路，PI3K/AKT 通路富集程度較高，有34 個(gè)靶基因，見圖3。

圖2 Cur 治療砷誘導(dǎo)心臟損傷GO 富集分析

圖3 Cur 治療砷誘導(dǎo)心臟損傷KEGG 富集分析

2.4 分子對接

將Cur 與排名前3 位靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，值越小表示結(jié)合活性越高，成分越容易與受體結(jié)合，所示對接結(jié)果見表1。分子與標(biāo)靶蛋白的結(jié)合能均小于0，說明配體與受體均可以自發(fā)結(jié)合。分子對接圖見圖4。

表1 分子對接結(jié)果圖

圖4 Cur 治療砷誘導(dǎo)心臟損傷的分子對接示意圖

2.5 細(xì)胞活力

CCK8 結(jié) 果 表 明 從6 μmol/L 時(shí) 開 始，隨 著NaAsO2染毒劑量增加，細(xì)胞活性下降（P＜ 0.05）。在Cur 與NaAsO2聯(lián)合處理實(shí)驗(yàn)中Cur 濃度為2.5 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活性上升最顯著，因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選用2.5 μmol/L Cur 和6 μmol/L NaAsO2進(jìn)行研究。見圖5。

圖5 Cur 和NaAsO2 對H9C2 細(xì)胞存活率的影響（n=6）

2.6 Cur通過PI3K/AKT信號通路在砷誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用

與Con 組相比，NaAsO2組Caspase-9 的mRNA水 平 升 高，AKT、BCL-2 的mRNA 水 平 降 低; 與NaAsO2組相比，Cur+NaAsO2聯(lián)合組中PI3K、AKT mRNA 水平升高，Caspase-9、BAX 的mRNA 水平降低，見圖6。

圖6 H9C2 細(xì)胞中PI3K（A）、AKT（B）、Caspase-3（C）、Caspase-9（D）、Bax（E）、BCL-2（F）的mRNA 相對表達(dá)水平（n=3）

3 討論

全世界有超過3 億人口面臨高砷暴露的威脅，我國因砷暴露受累人群近2000 萬[7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法，揭示Cur 對砷誘導(dǎo)心臟的作用機(jī)制。從數(shù)據(jù)庫中選取Cur 152 個(gè)靶點(diǎn)，PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中根據(jù)5 種算法得出AKT1、MAPK3、TP53、JUN、SRC5 個(gè)核心基因發(fā)揮著重要作用。分子對接結(jié)果顯示AKT1 與Cur結(jié)合活性最好。AKT1 是AKT 重要的亞型，AKT 一般指蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是PI3K 下游的主要靶點(diǎn)之一。PI3K/AKT 信號通路具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、增殖、凋亡、代謝等多個(gè)環(huán)節(jié)，與心血管疾病密切相關(guān)[8]。MAPK3、JUN 與Cur 結(jié)合活性較好。在人類中，MAPK3 在細(xì)胞周期進(jìn)展和凋亡中起關(guān)鍵作用[9]。c-jun 通過促進(jìn)細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞凋亡，在低氧心肌反應(yīng)中起到保護(hù)作用。GO 富集分析的生物學(xué)過程涉及細(xì)胞凋亡過程。KEGG 信號通路分析表明PI3K/AKT 信號通路富集度較高，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Cur 通過激活PI3K/AKT 信號通路抑制砷處理的心肌細(xì)胞的凋亡。

PI3K/AKT 是調(diào)節(jié)心臟功能的一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要通過血管內(nèi)皮生長因子介導(dǎo)血管生成、抑制心肌細(xì)胞凋亡、重構(gòu)心室、促進(jìn)細(xì)胞能量代謝等方面調(diào)節(jié)心臟功能[10]，該信號在心肌細(xì)胞存活和程序性死亡的過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[11]。此通路與線粒體途徑細(xì)胞凋亡過程中Bcl-2 家族蛋白的活性密切相關(guān)，Bcl-2 蛋白家族是線包括抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 等[12]。Caspase-9作為線粒體途徑細(xì)胞凋亡的起始者，活化的Caspase-9 進(jìn)一步裂解Caspase-3 和Caspase-7，凋亡過程開始[13]。研究表明，Cur 可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而降低冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[14]。Cur 可以改善糖尿病心肌病大鼠心室重構(gòu)[15]。

綜上所述，本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上，將PI3K/AKT 通路與Cur 對砷誘導(dǎo)心臟的保護(hù)作用聯(lián)系起來，并利用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析。通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘了潛在通路，這些通路也值得研究，但本研究未對其他通路進(jìn)行驗(yàn)證。本研究只利用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，具有一定的局限性。