低氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠脾細(xì)胞中T細(xì)胞亞群的調(diào)控作用*

孟 金, 康 敏, 蘆彥蓉, 郭 煜, 龐春艷

[1.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),內(nèi)蒙古 包頭 014010;2.包頭醫(yī)學(xué)院]

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)的特征是慢性滑膜炎癥以及軟骨和骨的進(jìn)行性破壞,它具有很高的致殘率。RA 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。許多因素會(huì)影響 RA 的發(fā)病,包括環(huán)境因素[1]、遺傳[2]和微生物群[3]的相互作用,各種免疫細(xì)胞的激活及其相互作用[4-6]等,最終會(huì)使免疫耐受性異常,導(dǎo)致針對(duì)滑膜的自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn),T 細(xì)胞的異常活化和增殖是 RA 炎癥、免疫活化和骨破壞的重要因素。大量的 CD4+T 細(xì)胞浸潤(rùn)滑膜組織,在抗原和細(xì)胞因子的作用下被激活并分化成具有免疫作用的各種 T 細(xì)胞亞群,其在 RA 中起著不同的作用[7-9]。Chen 等[10]研究發(fā)現(xiàn) RA 患者的滑膜組織中低氧誘導(dǎo)因子-1α ( hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表達(dá)水平升高,HIF-1α與 Notch-1 和 Notch-3 信號(hào)通路可以激活 RA 滑膜成纖維細(xì)胞進(jìn)而參與 RA 的發(fā)展。

因此,本研究采用小干擾 RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默 HIF-1α 的表達(dá),分析其對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)小鼠的治療作用及對(duì) CIA 小鼠脾細(xì)胞中 T 細(xì)胞亞群的影響,探討 HIF-1α作為治療 RA 新靶點(diǎn)的可能。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只5周齡的DBA/1小鼠,雄性,購(gòu)于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,體重約20 g。實(shí)驗(yàn)獲包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理學(xué)準(zhǔn)則進(jìn)行。

1.2試劑及儀器 完全弗氏佐劑、牛Ⅱ型膠原購(gòu)自美國(guó) chondrex 公司,CD4 單克隆抗體、CD25單克隆抗體、IFN-γ單克隆抗體、IL-10 單克隆抗體、FOXP3 單克隆抗體、IL-17 單克隆抗體、細(xì)胞內(nèi)固定和破膜緩沖液組合均購(gòu)自 eBioscience 公司,流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) BD 公司,PMA/Ionomycin mixture(250 X)(佛波酯/離子霉素混合物)、BFA/Monensin Mixture(250 X)(布雷非德菌素 A /莫能霉素混合物) 購(gòu)自聯(lián)科生物。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1建立膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型 將牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑在冰上混合乳化,于 DBA/1 小鼠尾根部皮下注射上述乳化成功的膠原和完全弗氏佐劑混合物進(jìn)行初次免疫。21 d 后進(jìn)行第二次免疫,28 d 小鼠的關(guān)節(jié)會(huì)出現(xiàn)紅腫,即造模成功。

1.3.2HIF-1α-siRNA 載體的構(gòu)建和病毒的制備及鑒定 針對(duì)HIF-1α的序列并參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)一段 siRNA 序列,序列為 5′- TGGATAGC GATATGGTCAAT-3′,陰性對(duì)照的序列為 5′- TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,送到北京合生生物科技有限公司構(gòu)建載體,并轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞制備病毒,病毒滴度分別為 5.53×1010PFU/mL 和 1.58×1011PFU/mL。

1.3.3HIF-1α干預(yù) CIA 小鼠 將 CIA 小鼠隨機(jī)分成3組,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,即沒(méi)有進(jìn)行造模的DBA/1小鼠;CIA模型組:造模成功的DBA/1小鼠;陰性對(duì)照組:CIA小鼠尾靜脈注射陰性對(duì)照載體;HIF-1α-siRNA組:CIA小鼠尾靜脈注射HIF-1α-siRNA載體,每周1次,共4次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死小鼠。

1.3.4HE染色檢測(cè)小鼠踝關(guān)節(jié)的病理改變 處死小鼠,取小鼠的其中一條后腿,PBS清洗,浸泡在含4 %多聚甲醛的凍存管中,送至武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行HE染色并拍照。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞亞群的分化情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束,處死小鼠,取脾組織,用含雙抗的PBS洗滌,研磨,細(xì)胞篩過(guò)濾,1 000 rpm離心5 min,加入3 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀,后移到培養(yǎng)皿中,加入PMA/Ionomycin和BFA/Monensin,37 ℃ 5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后收集細(xì)胞至流式管中,PBS洗滌并重懸細(xì)胞,離心棄上清,加入固定破膜液500 μL,吹勻,常溫避光孵育30 min,離心棄上清,加入透化液500 μL,吹勻,常溫避光孵育30 min。離心棄上清,PBS重懸細(xì)胞,將其中一管細(xì)胞分成8管,對(duì)應(yīng)每管加CD4+IFN-γ+、CD4+IL-10+、CD4+CD25+FOXP3+、CD4+IL-17+及同型對(duì)照各1 μL,輕彈混勻,常溫避光孵育30 min,剩余小鼠的脾細(xì)胞,均分成4個(gè)流式管,每管加入CD4+IFN-γ+、CD4+IL-10+、CD4+CD25+FOXP3+、CD4+IL-17+各1 μL,常溫避光孵育30 min。PBS洗滌并重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群分化情況。

2 結(jié)果

2.1小鼠踝關(guān)節(jié)的病理變化及淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況 空白組小鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常,沒(méi)有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),模型組和陰性對(duì)照組小鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生明顯。HIF-1α-siRNA 組小鼠踝關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜增生減輕,踝關(guān)節(jié)病理?yè)p傷得到一定的緩解。見(jiàn)圖 1。

圖1 小鼠關(guān)節(jié)病理變化

2.2脾細(xì)胞中Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的比例變化 模型組小鼠脾細(xì)胞中CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞的比例明顯升高,與空白組小鼠比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CD4+IL-10+Th2細(xì)胞的比例變化不明顯。HIF-1α-siRNA組小鼠脾細(xì)胞中CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞的比例明顯下降,與陰性對(duì)照組和CIA模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CD4+IL-10+Th2細(xì)胞的比例有上升的趨勢(shì),但變化沒(méi)有明顯的差異。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 小鼠脾細(xì)胞中 Th1 細(xì)胞的變化(n=8)

圖3 小鼠脾細(xì)胞中 Th2 細(xì)胞的變化(n=8)

2.3脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞和Treg的比例變化 模型組小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-17+Th17細(xì)胞的比例明顯升高,與空白組小鼠比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CD4+CD25+FOXP3+Treg的比例雖然呈上升的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIF-1α-siRNA組小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-17+Th17細(xì)胞的比例明顯下降,與陰性對(duì)照組和模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CD4+CD25+FOXP3+Treg的比例同樣也是升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞的變化(n=8)

圖5 小鼠脾細(xì)胞中Treg的變化(n=8)

3 討論

RA是很常見(jiàn)的一種自身免疫性疾病。CIA小鼠是進(jìn)行臨床前研究常用的一種RA動(dòng)物模型,CIA小鼠與RA患者有相同的病理特征,比如滑膜炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、滑膜增生、軟骨和骨破壞等。本研究的結(jié)果也顯示小鼠的踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)滑膜增生,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的CIA小鼠可以作為RA的動(dòng)物模型。Feng等[11]研究顯示HIF-1α在CIA小鼠的血清和滑膜中的表達(dá)是增高的。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)HIF-1α-siRNA的納米微粒在RAW264.7細(xì)胞水平有很好的抗炎作用,對(duì)CIA小鼠同樣有抗炎的作用,還可以延緩骨侵蝕和軟骨破壞的程度及減少破骨細(xì)胞的生成。本研究采用siRNA技術(shù)沉默HIF-1α的表達(dá)后,CIA小鼠踝關(guān)節(jié)的滑膜增生減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,因此,提示HIF-1α可以成為治療CIA小鼠或者RA的一個(gè)靶點(diǎn)。

那么HIF-1α如何起治療作用的呢?有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)RA滑膜成纖維細(xì)胞導(dǎo)致的Th1和Th17細(xì)胞的產(chǎn)生,促進(jìn)IFN-γ和IL-17A的分泌增多[13-14]。Th17細(xì)胞的增多和Treg數(shù)量減少或功能不足以及二者之間的失衡在RA的免疫紊亂和關(guān)節(jié)破壞中起重要作用[15-16]。Ye等[17]研究表明酪蛋白激酶2通過(guò)調(diào)控Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞參與RA的發(fā)病,其抑制劑則可以抑制Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞分化,增加Th2細(xì)胞分化而對(duì)RA起治療作用,但它對(duì)Treg沒(méi)有明顯的影響作用。本研究發(fā)現(xiàn)CIA小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例升高,Treg的比例降低,確實(shí)證實(shí)了Th17細(xì)胞數(shù)量的增多和Treg的減少參與CIA小鼠的發(fā)病。采用siRNA技術(shù)沉默HIF-1α的表達(dá)后,小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例下降,Treg的比例升高,提示沉默HIF-1α的表達(dá)確實(shí)可以抑制CIA小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞的分化,增加Treg的分化。此外本研究發(fā)現(xiàn)CIA小鼠脾細(xì)胞中Th1細(xì)胞的比例升高,Th2細(xì)胞的比例降低,提示Th1細(xì)胞數(shù)量的增多和Th2細(xì)胞的減少參與CIA小鼠的發(fā)病。本研究敲減了HIF-1α的表達(dá)后,小鼠脾細(xì)胞中Th1細(xì)胞的比例下降,Th2細(xì)胞的比例升高,提示沉默HIF-1α的表達(dá)可以減輕CIA小鼠脾細(xì)胞Th1細(xì)胞相關(guān)的炎癥反應(yīng),增強(qiáng)Th2細(xì)胞的分化能力。

綜上所述,CIA小鼠是研究RA的常用動(dòng)物模型,T細(xì)胞亞群可以參與RA的發(fā)生和發(fā)展,靶向HIF-1α不僅可以降低CIA小鼠脾細(xì)胞中Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例,而且還可以升高Treg和Th2細(xì)胞的比例,從而成為治療RA的靶點(diǎn)。