基于TMT蛋白組學(xué)研究納米氧化鈰對(duì)小鼠腦組織的作用*

李宜格,郭麗娜,李裕林,梅建軍,張 濤,趙繼軍,王艷芳

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014040; 2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

鈰是稀土鑭系元素之一,納米氧化鈰(cerium oxide nanoparticles, CeO2NPs)是衍生自鈰的納米晶體,由于其特殊的螢石晶格結(jié)構(gòu),在生理?xiàng)l件下,CeO2NPs很容易失去氧離子或者得到電子,從而產(chǎn)生氧空位,導(dǎo)致價(jià)態(tài)降低,使得CeO2NPs可以在Ce3+和Ce4+之間不斷的氧化還原,提供強(qiáng)大的抗氧化活性[1-2]。大量研究表明,CeO2NPs在急性腎損傷[3-5]、急性肝損傷[6]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7]、銀屑病[8]、炎癥性腸炎[9]等疾病中均顯示出了減輕氧化應(yīng)激的效能。鑒于CeO2NPs良好的抗氧化特性,其是否能作為腦靶向藥物遞送載體備受關(guān)注[10]。Ana等[11]在缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn),CeO2NPs能夠穿越血腦屏障。Gao等[12]在腦卒中靶向藥物研究中顯示,CeO2NPs能夠通過(guò)胞飲作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或吞噬作用主動(dòng)穿越血腦屏障。但由于粒徑與濃度的不同,CeO2NPs穿越血腦屏障的效率以及氧化還原能力也有所差別。本實(shí)驗(yàn)采用了粒徑為2～6 nm,劑量為0.4 mg/kg的CeO2NPs,觀察CeO2NP對(duì)小鼠海馬的影響,為CeO2NP在腦內(nèi)的遞送提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是繼基因組學(xué)技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的技術(shù)。自誕生以來(lái),蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域,是檢測(cè)各種疾病診斷標(biāo)記、疫苗生產(chǎn)候選選擇和病理機(jī)制研究的重要手段[13]。如Higginbotham 等[14]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示了無(wú)癥狀和有癥狀阿爾茨海默病中的腦脊液生物標(biāo)志物。喬陽(yáng)等[15]在膿毒癥腦病的研究中利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出關(guān)鍵蛋白,為疾病的治療提供新的思路。本研究利用TMT的蛋白質(zhì)組學(xué),通過(guò)生物信息學(xué)分析,探究納米氧化鈰對(duì)小鼠腦組織的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性ICR小鼠(5～8周齡)購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證書編號(hào):SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批件號(hào):2021第006號(hào))。

1.2試劑與儀器 二氧化鈰納米顆粒(溶液,粒徑2～6 nm,貨號(hào):14227749,江蘇先豐納米材料科技有限公司);自動(dòng)組織脫水機(jī)(HistoCore PEARL,德國(guó)Leica Biosystems);TMT蛋白組學(xué)(上海中科新生命公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥 (1)實(shí)驗(yàn)分組:ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)區(qū)組法分為空白對(duì)照組(n=6)、CeO2NPs組(n=6);(2)給藥方法:CeO2NPs組小鼠進(jìn)行尾靜脈注射CeO2NPs(0.4 mg/kg),24 h后進(jìn)行行為學(xué)、組織病理學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。對(duì)照組注射等比例劑量生理鹽水。

1.4行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 該測(cè)試包括定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。定向航行實(shí)驗(yàn):為期5 d,測(cè)試其找到平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期),檢測(cè)空間記憶學(xué)習(xí)能力。空間探索實(shí)驗(yàn):為期1 d,記錄60 s內(nèi)小鼠穿越平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù),檢測(cè)空間記憶能力。

1.4.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將小鼠放入曠場(chǎng)自由探索5 min,記錄小鼠運(yùn)動(dòng)的總距離、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間及進(jìn)入中央次數(shù)。每只小鼠測(cè)試1次,測(cè)試結(jié)束后用乙醇擦拭曠場(chǎng)箱除味。

1.4.3轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 將小鼠放在旋轉(zhuǎn)棒通道上,觀察小鼠從棒上掉落的時(shí)間訓(xùn)練模式為3 d,設(shè)置轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速為20 r/min,時(shí)長(zhǎng)為10 min,實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綖? d,轉(zhuǎn)速為40 r/min,時(shí)長(zhǎng)為5 min。

1.5組織學(xué)檢測(cè) 蘇木素-伊紅染色(HE染色),麻醉小鼠后用生理鹽水和多聚甲醛心尖灌注,取出腦組織放于多聚甲醛中固定,48 h后取出腦組織,在視交叉前后從冠狀面切割2 mm,制備石蠟切片進(jìn)行HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察海馬細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6TMT蛋白組學(xué)

1.6.1蛋白質(zhì)提取和胰蛋白酶處理 稱取適量組織(小鼠海馬)進(jìn)行研磨,加入4倍體積的裂解緩沖液超聲裂解。離心后將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.6.2TMT標(biāo)記 胰蛋白酶消化后,將凍干樣品重新懸浮在100 μL的200 mM TEAB中,取20 μL加入100 μL TMT標(biāo)記試劑,混合后溫育2 h,加入200 μL高效液相色譜(HPLC)水,孵育0.5 h以終止反應(yīng)。將標(biāo)記的肽溶液冷凍干燥。

1.6.3高效液相色譜分離 通過(guò)高pH反相HPLC分離肽,色譜柱為Agilent 300 Extend C18(5 μm粒徑,4.6 mm內(nèi)徑,250 mm長(zhǎng))。將60 min內(nèi)分離的60種成分分為9個(gè)組分樣品,真空冷凍干燥用于后續(xù)操作。

1.6.4LC-MS分析 將肽溶解于流動(dòng)相A[0.1 %(v/v)甲酸和2 %乙腈水溶液]中,使用EASY-nLC 1000超高效液體系統(tǒng)進(jìn)行分離,然后注入NSI離子源進(jìn)行電離,最后通過(guò)Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。依賴掃描(DDA)程序進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.7生物信息分析 聚類分析采用集群3.0(http:‘‘bonsai.hgc.jp‘～mdehoon‘software‘Cluster‘software.htm)和Java Treeview軟件(http:‘‘jtreeview.sourceforge.net)用于執(zhí)行分層聚類分析、亞細(xì)胞定位分析采用CELLO(http:‘‘CELLO.life.nctu.edu.tw‘),功能分類(GO)富集分析,使用NCBI BLAST+客戶端軟件(NCBI-BLAST-2.2.28+-win32.exe)和InterProScan,目標(biāo)通路分析通過(guò)京都基因和基因組百科全書(KEGG)(https://www.genome.jp/kegg/)確定。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,兩組之間的差異用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,使用單向ANOVA分析統(tǒng)計(jì)比較,采用GraphPad Prism 9進(jìn)行作圖,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮測(cè)試分析進(jìn)行了為期6 d的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),包括5 d定位航行和1 d空間探索。與對(duì)照組相比,CeO2NPs組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 Morris水迷宮測(cè)試分析

2.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)納米氧化鈰組小鼠的空間探索和運(yùn)動(dòng)能力以及焦慮情況。與對(duì)照組相比,CeO2NPs組小鼠的中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間略微延長(zhǎng),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

2.3轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的肌肉協(xié)調(diào)及運(yùn)動(dòng)能力。與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

2.4小鼠海馬組織病理學(xué)觀察 將HE染色作為小鼠腦損傷評(píng)估。處死小鼠后,收集海馬組織,HE染色顯示對(duì)照組與CeO2NPs組CA2區(qū)海馬神經(jīng)元排列整齊,形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖4 CA2區(qū)海馬神經(jīng)元(HE染色,×400)

2.5TMT蛋白組學(xué)結(jié)果 為了深入了解蛋白質(zhì)在不同的生物學(xué)功能和途徑中的作用,首先對(duì)CeO2NPs組小鼠進(jìn)行了GO分析(圖5),包括生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)分析。BP中的大多數(shù)蛋白質(zhì)與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞代謝、以及應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程有關(guān)。CC類別分析表明,大多數(shù)蛋白質(zhì)位于細(xì)胞器和細(xì)胞膜中。MF分析表明,大多數(shù)鑒定的蛋白質(zhì)都與小分子、蛋白質(zhì)和核苷酸的結(jié)合和催化活性有關(guān)。然后對(duì)CeO2NPs組小鼠的差異蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,有243個(gè)蛋白下調(diào),280個(gè)蛋白上調(diào),其中有7個(gè)上調(diào)蛋白具有顯著差異(表1);20個(gè)下調(diào)蛋白具有顯著差異(表2)。KEGG通路富集表明,鑒定出的蛋白質(zhì)主要參與同源重組、P450代謝途徑、NF-kappaB、精氨酸生物合成等信號(hào)通路(圖6)。

表1 顯著上調(diào)蛋白

表2 顯著下調(diào)蛋白

圖6 TMT蛋白組學(xué)結(jié)果

3 討論

本研究中,我們首先對(duì)尾靜脈注射CeO2NPs組小鼠進(jìn)行了行為學(xué)檢測(cè),觀察CeO2NPs注射后對(duì)小鼠行為的影響,通過(guò)Morris水迷宮、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn),均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CeO2NPs組小鼠的行為學(xué)異常,統(tǒng)計(jì)分析也未發(fā)現(xiàn)顯著差異。但在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中我們觀察到,與對(duì)照組相比,CeO2NPs組小鼠的中央?yún)^(qū)域探索時(shí)間有所增加,但也沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)被用作檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和空間探索能力,因此這提示CeO2NPs可能會(huì)提高小鼠的空間探索欲望以及減少焦慮樣情況,但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。研究顯示,CA2區(qū)是海馬與神經(jīng)退行性病變相關(guān)的主要區(qū)域[16]。我們?cè)趯?duì)小鼠海馬CA2區(qū)進(jìn)行組織損傷評(píng)估時(shí),采用HE染色,與對(duì)照組相比CeO2NPs組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯異常,因此推測(cè)CeO2NPs可能沒(méi)有對(duì)海馬組織的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)造成損傷,是相對(duì)安全的。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)許多動(dòng)物模型中的差異蛋白和通路。本研究總共鑒定了5 857種蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)有523種蛋白質(zhì)存在差異表達(dá),其中243個(gè)蛋白下調(diào),280個(gè)蛋白上調(diào)。已發(fā)現(xiàn)其中一些具有顯著差異的蛋白質(zhì)與海馬相關(guān),并均集中在下調(diào)差異蛋白中。在Wnt信號(hào)通路中,鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II型(CaMKII)在本研究中顯著下調(diào)。

CaMKII是神經(jīng)元功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,在學(xué)習(xí)、突觸可塑性和記憶等領(lǐng)域得到廣泛研究,研究顯示,CaMKII在興奮性毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡中起關(guān)鍵作用,抑制CaMKII可能成為缺血性腦損傷急性期有前途的治療策略[17]。Li等[18]在益母草堿對(duì)缺氧缺血損傷影響的研究中發(fā)現(xiàn)CaMKII可能是缺血后神經(jīng)毒性的主要上游調(diào)節(jié)劑之一,抑制CaMKII能夠起到神經(jīng)保護(hù)作用。在本研究中CaMKIIa、CaMKIIg均下調(diào),這提示CeO2NPs可能對(duì)腦損傷起到保護(hù)作用。Chang等[19]在Albanin A蛋白對(duì)大鼠大腦皮層神經(jīng)末梢中谷氨酸釋放影響的研究中發(fā)現(xiàn),Albanin A蛋白能夠通過(guò)抑制腺苷酸環(huán)化酶Ⅰ型(Adcy1)的激活,進(jìn)而降低cAMP水平和PKA的激活,導(dǎo)致胞外谷氨酸釋放減少,從而起到神經(jīng)保護(hù)作用,與此相一致,Adcy1在本實(shí)驗(yàn)中也顯著下調(diào),說(shuō)明CeO2NPs可能會(huì)通過(guò)Adcy1的下調(diào),從而對(duì)神經(jīng)起到保護(hù)作用。電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1(VDAC1)是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白,在阿爾茲海默癥模型小鼠死后腦中檢測(cè)出了高水平的VDAC1,這提示VDAC1的過(guò)度表達(dá)會(huì)觸發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的死亡[20]。研究發(fā)現(xiàn)VDAC1的下調(diào)能夠改善阿爾茲海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,并且能夠部分減少線粒體自噬[21]。Xue等[22]在新生兒缺氧缺血性腦病研究中顯示,VDAC1下調(diào)可以促進(jìn)神經(jīng)元的存活。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,說(shuō)明CeO2NPs可能會(huì)引起腦內(nèi)VDAC1的下調(diào),并且有利于小鼠學(xué)習(xí)記憶同時(shí)起到神經(jīng)保護(hù)作用。此外,本研究中未發(fā)現(xiàn)與海馬損傷相關(guān)蛋白Tau[23-25]、α-突觸核蛋白(α-syn)[26-27]、β淀粉樣蛋白[28-29]等出現(xiàn)顯著性差異,這進(jìn)一步說(shuō)明了CeO2NPs對(duì)海馬沒(méi)有損傷作用。在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中預(yù)計(jì)對(duì)CaMKII、Adcy1、VDAC1采用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)蛋白組學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)基于TMT蛋白組學(xué)研究了CeO2NPs組和對(duì)照組小鼠海馬組織的蛋白表達(dá)情況,差異蛋白涉及多條通路,有氧化磷酸化信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)信號(hào)通路、膽固醇代謝通路等。這些通路都與海馬相關(guān)疾病有關(guān),但經(jīng)對(duì)每條通路中的差異蛋白進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其上調(diào)或者下調(diào),對(duì)小鼠海馬組織均無(wú)毒害作用。由此我們推測(cè),小粒徑、低濃度的CeO2NPs有望成為腦疾病治療的藥物遞送載體。