Toll樣受體5基因rs2072493與肝癌易感性的關(guān)系*

秦金東,高 芳,李迎澤,李 鵬,賈彥彬

(1.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.包頭市腫瘤醫(yī)院;3.鄂爾多斯市第二人民醫(yī)院)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC)是常見的惡性腫瘤之一,2020年其死亡率位居全球各類腫瘤死亡率的第三位[1]。雖然我國(guó)人群肝癌發(fā)病率和病死率近10年有所下降,但由于原發(fā)性肝癌惡性程度高、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移發(fā)生早、預(yù)后較差、致死率極高[2],這些因素導(dǎo)致我國(guó)肝癌負(fù)擔(dān)依然很重[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn),相同暴露條件下不同個(gè)體患病存在很大差異,肝癌的發(fā)生發(fā)展受遺傳因素的影響,與基因多態(tài)性有明顯的相關(guān)性[5]。

Toll樣受體家族(toll-like receptors,TLRs)作為一種受體蛋白,可識(shí)別細(xì)菌、病毒等病原體,在機(jī)體抗病原微生物免疫防御中發(fā)揮重要的作用。研究表明TLRs在多種肝臟組織細(xì)胞中均有表達(dá),并使其在免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生和釋放多種細(xì)胞因子,介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷[6-7];還可以通過信號(hào)通路參與腫瘤的免疫效應(yīng),引起肝癌的發(fā)生[8-9]。

目前的研究中,對(duì)Toll樣受體與原發(fā)性肝癌的研究主要集中在TLR4和TLR9,而TLR5基因多態(tài)性與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系卻鮮有報(bào)道。本研究利用病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究的方法,在內(nèi)蒙古西部地區(qū)漢族人群中檢測(cè)TLR5單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)rs2072493與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,為肝癌預(yù)防措施的制訂以及基因治療、開發(fā)新藥提供實(shí)驗(yàn)參考和理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2014年5月-2020年7月期間確診的205例肝癌患者為病例組,其中159例來自鄂爾多斯市第二人民醫(yī)院(傳染病醫(yī)院)收治的肝癌患者,46例來自包頭市腫瘤醫(yī)院的肝癌患者。所有肝癌患者均已病理確診。排除轉(zhuǎn)移性肝癌患者以及接受化療和放療的病例。收集同期包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院238例體檢者為正常對(duì)照組,排除肝炎疾病史、肝臟手術(shù)史和癌癥病史等。所有入選對(duì)象均為互無血緣關(guān)系的內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)和包頭地區(qū)漢族人群。確診病例組中男性138例、女性67例,年齡為41～93歲、平均年齡51.60±10.63歲。正常組中男性155例、女性83例,年齡33～93歲、平均年齡58.87±11.05歲。兩組年齡分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。所有對(duì)象均簽署知情同意書,本研究已獲包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 肝癌病例組和正常對(duì)照組的一般臨床資料比較

1.2基因分型 對(duì)所有研究樣本采集外周血液2 mL。采用人血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取外周血白細(xì)胞DNA。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)方法對(duì)TLR5 rs2072493位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。用Primer 3設(shè)計(jì)引物,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。上游引物序列(5′-3′):GACTAAGCCTCAACTCCAACA;下游引物序列(5′-3′):GACTTCCTCTTCATCACAACC。PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中包括DNA 2 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、上下游引物(5 pmol/μL)各1 μL、雙蒸水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。每次PCR反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照(即在PCR反應(yīng)體系中不加模板DNA)。最終得到擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為314 bp。運(yùn)用查詢軟件(http://tools.neb.com/NEBCUTTER2/)尋找合適的限制性內(nèi)切酶(MfeI),酶切反應(yīng)體系為10 μL:其中包括上述所得PCR產(chǎn)物3 μL,10×酶切緩沖液1 μL,限制性內(nèi)切酶0.3 μL(10 U/μL),ddH2O 5.7 μL。在37 ℃水浴箱溫浴1 h。取5 μL酶切產(chǎn)物加到2 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。紫外凝膠成像分析其基因型。AA基因型出現(xiàn)186 bp和128 bp兩個(gè)片段;AG基因型出現(xiàn)314 bp,186 bp和128 bp三個(gè)片段;GG基因型只有一個(gè)314 bp片段。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用秩和檢驗(yàn)比較分析年齡在病例組和對(duì)照組間的分布差異。采用Person χ2檢驗(yàn)比較分析性別在病例組和對(duì)照組間的分布差異。采用非條件性Logistic回歸計(jì)算比值比(odds ratio,OR)、95 %置信區(qū)間(confidence interval,CI)以及赤池信息準(zhǔn)則(akaike information criterion,AIC)和貝葉斯信息準(zhǔn)則(bayesian information criterion,BIC)評(píng)估在共顯性、顯性、隱性、超顯性四種遺傳模式下SNP rs2072493與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1基因型和等位基因在病例組和對(duì)照組中的分布情況 分析結(jié)果顯示:SNP rs2072493的基因型分布在正常對(duì)照組符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=5.182,P=0.075)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,TLR5基因SNP rs2072493位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在正常對(duì)照組和肝癌病例組中的分布差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 SNP rs2072493基因型和等位基因在肝癌病例組和正常對(duì)照組的分布情況[n(%)]

2.2不同遺傳模式下TLR5基因SNP rs2072493與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 研究結(jié)果顯示在共顯性、顯性、隱性遺傳模式下,TLR5基因SNP rs2072493與肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)。其中共顯性遺傳模式最適合,AIC和BIC最小,分別為581.2和597.6。與攜帶AA基因型者相比,攜帶GA和GG基因型者肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低(GAvsAA:OR=0.512,95 %CI=0.333-0.787、GGvsAA:OR=0.192,95 %CI=0.077-0.477)。見表3。

表3 不同遺傳模型下rs2072493與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系[n(%)]

3 討論

TLR5基因位于1號(hào)染色體遠(yuǎn)端,編碼859個(gè)氨基酸[10]。TLR5是一種模式識(shí)別受體,通過對(duì)全身炎癥反應(yīng)和腫瘤相關(guān)的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[11]。目前,國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道主要聚焦于TLR5基因多態(tài)性與多種細(xì)菌、病毒感染及其相關(guān)疾病是否存在相關(guān)性。如TLR5基因中的SNPs rs5744168 T等位基因在第392個(gè)密碼子處編碼終止密碼子(TLR5 r392x),導(dǎo)致TLR5跨膜結(jié)構(gòu)域斷裂,且這一SNP與散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生有關(guān)[12]。Rutkowski等[13]通過建立肉瘤和卵巢腫瘤小鼠模型,發(fā)現(xiàn)TLR5可以識(shí)別共生的微生物群,并且可以促進(jìn)炎癥反應(yīng),從而調(diào)控遠(yuǎn)端惡性進(jìn)展。而我們課題組之前的研究顯示,TLR5基因多態(tài)性可能在幽門螺旋桿菌感染、非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中不起主要作用[14]。Klimosch等[15]采用TaqMan法對(duì)大腸癌高加索患者613例進(jìn)行基因分型,發(fā)現(xiàn)在高加索人群中,與AG+GG基因型攜帶者相比,rs2072493 AA基因型攜帶者大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。

PLC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多因素、多基因累積作用的復(fù)雜生物學(xué)過程,涉及的主要危險(xiǎn)因素有兩個(gè)方面,環(huán)境因素和宿主遺傳因素[16-18]。其中個(gè)體遺傳因素起到了非常重要的作用。Cao等[19]發(fā)現(xiàn)TLR5基因可能在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相關(guān)的嚴(yán)重肝病的發(fā)展中起作用。某研究中發(fā)現(xiàn)TLR5基因多態(tài)性與肝癌的發(fā)生有關(guān)[10]。而我國(guó)是HBV感染、肝癌高發(fā)地區(qū),TLR5基因多態(tài)性在不同地區(qū)、不同人群中分布存在差異;且TLR5 rs2072493基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌的關(guān)系研究目前未見報(bào)道。因此本課題組首次對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)人群TLR5 rs2072493位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與肝癌關(guān)系進(jìn)行研究,具有一定的意義。

本研究顯示,在共顯性、顯性、隱性遺傳模式下TLR5基因SNP rs2072493與肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)。其中共顯性遺傳模式最適合,AIC和BIC最小,分別為581.2和597.6。與攜帶AA基因型者相比,攜帶GA和GG基因型者肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低,提示rs2072493 GA和GG基因型可能是內(nèi)蒙古西部地區(qū)漢族人群肝癌發(fā)病的保護(hù)因素。

綜上所述,對(duì)于內(nèi)蒙古西部地區(qū)漢族人群,TLR5基因的遺傳變異可能和肝癌的發(fā)生相關(guān)。本課題組在今后的研究中,應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量,通過全基因的關(guān)聯(lián)分析進(jìn)一步驗(yàn)證。