EMS誘變對岷江百合種子萌發(fā)的影響

金 鴿, 張銘芳, 魏 蕾, 韓東洋, 杜運鵬, 楊鳳萍, 薛 靜, 陳緒清, 張秀海, 董 然

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與草學(xué)學(xué)院, 長春 130118;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室, 北京 100097)

百合為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本植物,具地下鱗莖,是常見的觀賞花卉,同時也具有食藥用價值[1]。岷江百合(LiliumregaleWilson)別名王百合、千葉百合,天然分布于我國四川岷江流域海拔760～2 200 m氣候變化劇烈的干旱河谷區(qū)域,對寒冷天氣抵抗能力較強,同時對酸堿性土壤及石灰土也具有一定的抵抗能力,在土壤pH值達8.5的環(huán)境中仍能正常生長開花[2],具有抗病毒能力強的優(yōu)點[3]。

甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate,EMS)是典型的化學(xué)誘變劑,目前在許多植物的突變體育種研究及種質(zhì)資源的創(chuàng)制中取得一定進展[4]?；瘜W(xué)誘變育種具有使用方便、特異性較強和誘變后代較易穩(wěn)定遺傳的特點。通過化學(xué)誘變劑對農(nóng)作物誘變后代進行多世代篩選、鑒定,已經(jīng)培育出具有生產(chǎn)利用價值的農(nóng)作物新品種。其中EMS化學(xué)誘變技術(shù)是創(chuàng)造新種質(zhì),改良農(nóng)藝性狀的常用方法,相比于其他誘變劑,EMS誘變劑應(yīng)用效果較好。EMS直接作用于DNA鳥嘌呤部分引起點突變及染色體損傷。EMS誘變產(chǎn)生點突變的頻率較高,而誘發(fā)染色體畸變相對較少,且誘變產(chǎn)生的突變體多為顯性突變體,易于進行突變體的田間篩選。目前,EMS誘變已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于西蘭花種子[5],刺梨種子[6],藜麥種子[7-9],高粱種子[10],黨參種子[11],燕麥種子[12],木槿種子[13],醉魚草種子[14],紅豆草種子[15]等。王育川等[9]以自育白種藜麥種子為實驗材料,設(shè)置5個濃度(0.5%,1.0%,1.5%、2.0%,2.5%)的EMS緩沖液和4個時間(8,10,12,14 h)進行誘變處理,來確定半致死劑量[9]。閆鋒等[16]用EMS(0.3%,0.6%,0.9%,1.2%)處理(6,10,1,4 h)糜子種子,來篩選建立糜子突變體庫的適宜條件。于震宇[17]以金花葵種子為實驗材料,設(shè)置不同的EMS濃度(0.4%,0.8%,1.2%,1.6%,2.0%)來篩選出EMS最佳處理濃度。

但是目前關(guān)于對百合種子的EMS誘變研究較少,田鑫等[18]以湖北百合鱗片為試材,首先采用9種不同培養(yǎng)基接種,獲得誘導(dǎo)愈傷組織最佳配方,然后以該配方誘導(dǎo)出的愈傷組織為誘變材料,用EMS(0.2%,0.4%,0.6%)處理(1,2,3 h)愈傷組織,對誘變處理的愈傷組織分化的不定芽用0.4%濃度的NaCl脅迫處理0～12 d進行鹽脅迫篩選,獲得復(fù)合誘變處理后的最佳耐鹽濃度。劉艷妮等[19]用EMS對百合離體葉片進行處理,篩選出其半致死濃度為0.6%和處理3 h。利用篩選出來的EMS濃度和處理時間對離體葉片進行處理,在1%鹽濃度脅迫下進行抗鹽性突變體篩選,得到抗鹽性誘變植株。其研究認為篩選出來的百合突變體比對照具有更強的抗鹽性。

目前,關(guān)于百合的EMS處理,較多是應(yīng)用于離體組織,沒有對種子的處理。本研究利用不同濃度的EMS和不同處理時間對岷江百合種子進行誘變處理,目的是篩選出未經(jīng)沙藏處理的種子以及經(jīng)過沙藏處理的種子最佳的誘變濃度和誘變時間,為創(chuàng)新種質(zhì)資源、選育百合新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合種子取于北京農(nóng)林科學(xué)院百合種植基地?；瘜W(xué)誘變劑EMS為Solarbio品牌,為無色透明的油狀液體。

1.2 試驗設(shè)計

處理分為干種子組和沙藏種子組,干種子為岷江百合自交種子,沙藏種子組為岷江百合自交種子經(jīng)過一個月的沙藏處理。用不同濃度的EMS(0,0.4%,0.8%,1.2%)處理百合種子2 h,4 h,8 h,每個處理3個重復(fù)。

1.3 試驗流程

挑選胚部成熟的種子進行實驗處理,3次重復(fù),每個重復(fù)30粒種子,將種子及溶液放于50 mL的離心管中,放于28 ℃,200 r/min,在處理過程中偶爾翻轉(zhuǎn)離心管,以保證種子與誘變劑充分反應(yīng)。處理完成后,用自來水晃洗10次,上下?lián)u晃30次,將種子倒在篩網(wǎng)中,流水沖洗30 min,以終止反應(yīng)。處理完成后,在EMS溶液中加入1 mol/L的NaOH溶液,對EMS溶液進行消毒。

將處理完成后的種子均勻地鋪在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿上,進行培養(yǎng),然后不定期對種子進行澆水,浸濕濾紙即可。

1.4 指標測定

在種子萌發(fā)第9,13,17天分別測定種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、成活率以及種子誘變當天的電導(dǎo)率。其中發(fā)芽的標準為只要種子萌發(fā),即為發(fā)芽。

發(fā)芽勢/%=(第9天種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%;

發(fā)芽率/%=(第13天種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%;

成活率/%=(第17天幼苗成活數(shù)/供試種子數(shù))×100%;

相對發(fā)芽率/%=(處理組的發(fā)芽率/對照組的發(fā)芽率)×100%。

電導(dǎo)率的測定:挑選飽滿的種子,每組9粒,稱重,進行EMS處理,沖洗30 min后,用濾紙將水吸干,于10 mL蒸餾水浸泡30 min,用電導(dǎo)儀測定浸出液的電導(dǎo)率,以靜置0.5 h的蒸餾水電導(dǎo)率為空白(ck),3次重復(fù)。每克處理樣品種子浸出液電導(dǎo)率[mS/(cm·g)]=(測定電導(dǎo)率-空白電導(dǎo)率)/樣品重量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件進行方差分析,實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對種子發(fā)芽勢的影響

由圖1可見,岷江百合干種子和經(jīng)過沙藏處理的種子,其發(fā)芽勢都顯著受到EMS誘變劑處理時間及濃度的影響。

干種子在同一處理濃度下,各個處理的發(fā)芽勢隨著EMS處理時間的延長而逐漸降低,0.4%EMS濃度處理2 h時其發(fā)芽勢接近于濃度為0處理的對照種子,而在處理4 h和8 h時,其發(fā)芽勢顯著低于對照組。在0.8%EMS濃度處理4 h時,有部分種子發(fā)芽,而隨著處理時間延長到8 h,種子的發(fā)芽數(shù)量極少。在同一處理時間下,各個處理的發(fā)芽勢隨著處理濃度的增加而逐漸降低。當處理時間為2 h,處理濃度從0.8%增加到1.2%時,其發(fā)芽勢從9%將至0,發(fā)芽勢顯著下降?？梢姰斕幚頃r間為2 h,4 h,8 h時,不同濃度的EMS溶液處理干種子發(fā)芽勢依次為1.2%<0.8%<0.4%<0。

注:不同小寫字母為同一類型種子在相同濃度,不同處理時間的多重比較標識,不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。圖1 干種子及沙藏種子發(fā)芽勢Fig.1 Germination potential of dry seeds and sandy storage seeds

當沙藏種子經(jīng)0及0.4%濃度處理時,隨著處理時間從2 h延長至8 h,其種子的發(fā)芽勢逐漸升高,而在0.8%濃度處理2 h時,其發(fā)芽勢開始隨著處理時間的延長而逐漸降低,最終在0.8%濃度處理8 h時,發(fā)芽勢由51%降至0?？梢姰斕幚頃r間為2 h,4 h,8 h時,不同濃度的EMS溶液處理干種子發(fā)芽勢依次為1.2%<0.8%<0.4%<0。同時,圖1也表明,在處理濃度為0時,經(jīng)過沙藏處理種子的發(fā)芽勢整體高于干種子的發(fā)芽勢,說明種子在經(jīng)過低溫沙藏處理時,其胚開始發(fā)育。在種子經(jīng)過0.4%,0.8%,1.2%處理時,也同樣表明沙藏處理種子的發(fā)芽勢高于干種子的發(fā)芽勢,產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是由于種子在經(jīng)過低溫沙藏處理時,種子的活力增加,所以對于EMS誘變的抵抗能力也相應(yīng)地增強。

2.2 不同處理對種子發(fā)芽率的影響

由圖2可見,岷江百合干種子和經(jīng)過沙藏處理的種子,其發(fā)芽率都顯著受到EMS誘變劑處理時間及濃度的影響。

圖2 干種子及沙藏種子發(fā)芽率Fig.2 Germination rate of dry seeds and sandy storage seeds

干種子在同一處理濃度下,各個處理的發(fā)芽率隨著EMS處理時間的延長而逐漸降低,在0.4%EMS濃度處理2 h時其發(fā)芽率為71%,而隨著EMS處理時間延長至8 h時,其發(fā)芽率降至13%。當種子由0.8%EMS濃度處理2 h,延長至8 h時,其發(fā)芽率由47%降至0。當種子由1.2%EMS濃度處理2 h,延長至8 h時,其發(fā)芽率由8%降至0。在同一處理時間下,各個處理的發(fā)芽率隨著處理濃度的增加,而逐漸降低。在處理時間都為2 h時,種子發(fā)芽率隨著處理濃度的增加而降低,發(fā)芽率分別為71%,57%,47%,8%。而當處理時間為8 h時,種子在0.8%、1.2%濃度時,發(fā)芽率都為0,可見濃度顯著抑制了種子的萌發(fā)。沙藏種子的發(fā)芽率在0.4%濃度處理時,其發(fā)芽率隨著處理時間的延長而增加,由42%逐漸增加至51%,而種子經(jīng)0.8%、1.2%濃度處理時,其發(fā)芽率逐漸降低,最終其發(fā)芽率都為0?？梢奅MS顯著抑制了種子的萌發(fā),對種子造成了致死性的傷害,但是由圖2可見,沙藏種子的發(fā)芽率整體上略高于干種子的發(fā)芽率。

2.3 不同處理對種子相對發(fā)芽率的影響

由圖3可見,隨著EMS濃度的升高,各個不同時間處理的相對發(fā)芽率逐漸降低。當EMS濃度為0.4%時,2 h處理的相對發(fā)芽率顯著高于經(jīng)過4 h和8 h處理的種子?？梢姇r間的延長,對種子的生長起到了顯著的抑制作用。但同時由于誘變劑作用的時間較短,所以濃度為0.4%,經(jīng)過2 h處理時,其相對發(fā)芽率接近于對照組,說明此時對種子的毒害作用較弱。在4 h處理時,其相對發(fā)芽率為65.38%,接近半致死率,而當時間延長至8 h時,種子的相對發(fā)芽率約為對照組的1/4,這時對種子的發(fā)芽起到了顯著的抑制作用。當EMS濃度為0.8%時,分別經(jīng)2 h,4 h,8 h處理后,其發(fā)芽率分別為65.63%,23.08%,0。當EMS濃度在1.2%時,種子的相對發(fā)芽率顯著低于對照組,經(jīng)過2 h處理后,種子的相對發(fā)芽率為10.94%,而經(jīng)過4 h和8 h處理后,種子的相對發(fā)芽率為0。綜上所述,并且結(jié)合種子的生長情況,EMS濃度為0.4%,處理時間為4 h時,其相對發(fā)芽率接近半致死率,故岷江百合干種子的最佳誘變濃度和時間分別為0.4%,4 h。

圖3 干種子相對發(fā)芽率Fig.3 Relative germination rate of dry seeds

由圖4可見,種子經(jīng)0.4%濃度處理2 h時,其相對發(fā)芽率為62.3%,其較同樣處理條件下的干種子的相對發(fā)芽率要低近20%,而經(jīng)4 h處理的種子比經(jīng)過8 h處理的種子相對發(fā)芽率要高,這與同樣處理條件下的干種子相對發(fā)芽率趨勢相同。在0.8%濃度處理時,種子的相對發(fā)芽率在經(jīng)2 h,4 h,8 h處理時,其相對發(fā)芽率分別為85.25%,37.50%,0。在經(jīng)1.2%濃度處理時,種子的相對發(fā)芽率都極低,綜合比較,種子在經(jīng)0.4%,2 h處理的相對發(fā)芽率接近半致死率,故岷江百合沙藏種子的最佳誘變濃度和時間分別為0.4%,2 h。

圖4 沙藏種子相對發(fā)芽率Fig.4 Relative germination rate of sandy storage seeds

2.4 不同處理對種子成活率的影響

由圖5可見,干種子在0,2 h處理時成活率為81%,此時生長狀態(tài)良好,在0.4%,4 h時成活率達到56%。而沙藏處理的種子在0,2 h處理時成活率為72%,在0.4%,8 h處理時成活率達53%。在1.20%,2 h處理下,沙藏種子的成活率高于干種子的成活率,約為干種子成活率的3倍?？梢婋S著EMS濃度的增加,百合種子的成活率逐漸降低,經(jīng)過0.8%處理的種子,部分發(fā)生腐爛的情況,生長出來的幼苗整體偏小,而且有部分幼苗出現(xiàn)腐爛。經(jīng)過1.2%濃度處理的種子,大部分存在腐爛壞死的現(xiàn)象,在芽尖處及種子表面發(fā)生腐爛現(xiàn)象。

圖5 干種子及沙藏種子成活率Fig.5 Survival rate of dry seeds and sandy storage seeds

2.5 不同處理對種子浸泡液相對電導(dǎo)率的影響

由圖6可見,種子浸泡液的電導(dǎo)率反映了細胞膜的受損程度,干種子在0.8%,2 h處理時,電導(dǎo)率最大,而后隨著處理時間的延長和濃度的增加,電導(dǎo)率逐漸減小。沙藏種子在0.8%,4 h處理時,電導(dǎo)率達到最大,而后隨著處理時間的延長和濃度的增加,電導(dǎo)率逐漸減小,而沙藏種子的電導(dǎo)率整體略高于干種子電導(dǎo)率。

圖6 干種子及沙藏種子電導(dǎo)率Fig.6 Conductivity of dry seeds and sandy storage seeds

注:A,B,C,D分別為0,0.4%,0.8%,1.2%EMS濃度處理的種子,其中a代表處理2 h,第9天生長狀況;b代表處理4 h,第9天生長狀況;c代表處理8 h,第9天生長狀況;d代表處理2 h,第13天生長狀況;e代表處理4 h,第13天生長狀況;f代表處理8 h,第13天生長狀況;g代表處理2 h,第17天生長狀況;h代表處理4 h,第17天生長狀況;i代表處理8 h,第17天生長狀況。圖7 干種子生長狀況Fig.7 Dry seed growth status

2.6 不同處理時種子胚長及根的生長狀況

EMS濃度為0時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子生長狀況見圖7。由圖7可以看出,濃度為0處理的種子發(fā)芽速度及生長速度較快。EMS濃度為0.4%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子發(fā)芽速度比濃度為0處理的種子發(fā)芽及生長速度明顯慢很多。尤其到生長第17天的時候,兩者生長大小差異較大。這是由于EMS誘變劑對種子細胞造成了一定的傷害,對種子的發(fā)芽具有明顯的抑制作用。EMS濃度為0.8%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子發(fā)芽速度比0.4%濃度處理的種子發(fā)芽及生長速度明顯慢。且在0.8%濃度處理2 h及4 h的種子在第9天可以看見芽,而到了第13天,出現(xiàn)了腐爛。在第9天時,2 h,4 h,8 h芽生長的不明顯,而到了第13天部分種子芽才可見。EMS濃度為1.2%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子的生長明顯受到抑制,導(dǎo)致出芽率極低,甚至部分種子發(fā)生腐爛現(xiàn)象。

EMS濃度為0時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子生長狀況見圖8,由圖8可以看出,濃度為0處理的沙藏種子發(fā)芽速度比干種子發(fā)芽及生長速度快,主要是因為種子在經(jīng)過低溫沙藏過程中已經(jīng)開始萌發(fā),細胞內(nèi)各種酶活性開始提升。EMS濃度為0.4%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子發(fā)芽速度比濃度為0處理的種子發(fā)芽及生長速度略慢,但是相比于干種子,生長較快。EMS濃度為0.8%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子發(fā)芽速度比0.4%濃度處理的種子發(fā)芽及生長速度明顯減慢,而且在4 h和8 h處理的種子發(fā)芽不顯著,可見EMS對種子發(fā)芽的抑制較為明顯。EMS濃度為1.2%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時,沙藏種子和干種子一樣,其生長明顯受到抑制,導(dǎo)致出芽率極低,甚至部分種子發(fā)生腐爛現(xiàn)象。

圖8 沙藏種子生長狀況Fig.8 Growth status of sandy storage seeds

3 結(jié)論與討論

在培育新品種上,經(jīng)常使用EMS對種子或者植物組織等進行誘變處理,EMS誘發(fā)的突變主要通過兩個步驟來完成,首先,鳥嘌呤的N-7位置被烷基化,成為一個帶正電荷的季銨基團,從而發(fā)生兩種遺傳效應(yīng):一是烷化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對,代替胞嘧啶,發(fā)生轉(zhuǎn)換型的突變;二是由于鳥嘌呤的N-7烷基活化,糖苷鍵斷裂造成脫嘌而后在DNA復(fù)制過程中,烷基化鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對,導(dǎo)致堿基替換,即G∶C變?yōu)锳∶T[20]。EMS誘變可以實現(xiàn)在短期內(nèi)獲得大量的突變體,構(gòu)建突變體庫,具有其他誘變育種方式所不具備的優(yōu)點,因此常被現(xiàn)代育種學(xué)家用于大規(guī)模突變研究[21]。

本試驗結(jié)果表明,干種子在0.4%,4 h處理時相對成活率達到65.38%,接近半致死劑量。而沙藏處理的種子在0.4%,2 h時相對成活率達62.3%,接近半致死劑量。因此,0.4%的EMS,處理4 h為EMS處理百合干種子的較適宜方式,0.4%濃度的EMS,處理2 h為EMS處理沙藏種子較適宜方式。馬海新等[22]研究表明,4%濃度的EMS,2 h處理,對加工西紅柿干種子處理的發(fā)芽率為45%,接近半致死劑量;3%濃度的EMS,12 h處理對加工西紅柿濕種子處理的發(fā)芽率為61%,接近半致死劑量。安佰義等[23]研究表明,EMS誘變處理白樺種子的適宜條件為1.0%處理5 h或0.4%處理7 h。續(xù)言等[24]研究結(jié)果表明,4%濃度的EMS處理尾葉紫薇8 h和12 h后全部致死。2%濃度處理4 h的相對致死率為48.18%,接近半致死濃度。這說明不同種子對EMS的敏感性差異較大,誘變效果存在很大不同。并且隨著EMS濃度的增加以及處理時間的延長,對種子的萌發(fā)及生長抑制作用就越來越顯著。周厚成等[25]用不同濃度EMS對草莓愈傷組織進行誘變處理,結(jié)果表明,隨著EMS處理濃度的增加和時間的延長,愈傷組織死亡率呈上升趨勢;所以EMS處理種子及其他愈傷組織,均會起到抑制生長的作用。